全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(8): 11121121 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目 (31460370), 高等学校博士学科点专项科研基金项目 (20126202110007), 国家国际科技合作专项
(0102014DFG31570)和甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地开放基金项目(GSCS-2012-02)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31460370), Specialized Research Fund for the Doctoral
Program of Higher Education of China (20126202110007), International Science & Technology Cooperation Program of China
(0102014DFG31570), and Gansu Key Laboratory of Aridland Crop Science of Gansu Agricultural University (GSCS-2012-02).
通讯作者(Corresponding author): 张宁, E-mail: ningzh@gsau.edu.cn, Tel: 0931-7631875
第一作者联系方式: E-mail: 1335973527@qq.com, Tel: 18709492533
Received(收稿日期): 2016-01-19; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-06-02.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160602.0830.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01112
马铃薯 HD-Zip I家族 ATHB12基因的克隆及功能鉴定
武亮亮 姚 磊 马 瑞 朱 熙 杨江伟 张 宁* 司怀军
甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地 / 甘肃农业大学生命科学技
术学院, 甘肃兰州 730070
摘 要: HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽
培品种甘农薯 2号中克隆了 HD-Zip I转录因子 ATHB12基因, 其开放阅读框为 759 bp, 编码 252个氨基酸残基。该
基因位于马铃薯第 1染色体, 其启动子区含有 ABRE、LTRECOREATCOR15和 WBOXATNPR1等多种响应非生物胁
迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。
qRT-PCR 分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl 和 ABA 诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子
CaMV 35S驱动的 ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基
因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P < 0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P < 0.05); 转基因
植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯 ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。
关键词: 马铃薯; HD-Zip; ATHB12基因; 根; 丙二醛; 脯氨酸
Cloning and Functional Identification of the ATHB12 Gene of HD-Zip IFamily
in Potato (Solanum tuberosum L.)
WU Liang-Liang, YAO Lei, MA Rui, ZHU Xi, YANG Jiang-Wei, ZHANG Ning*, and SI Huai-Jun
Gansu Key Laboratory of Crop Genetic and Germplasm Enhancement, Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science / College of Life
Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
Abstract: HD-Zip I is a class of plant-specific transcription factors, which has an important role in response to adversity stress in
plant. A ATHB12 gene of HD-Zip I transcription factors was cloned from potato cultivar Gannongshu 2, which contains a 759 bp
open reading frame (ORF) encoding a protein of 252 amino acid residues. ATHB12 gene is located on potato chromosome 1, and
its promoter region sequence contains cis-acting elements including ABRE, LTRECOREATCOR15, WBOXATNPR1 responsive
to abiotic stresses (ABA, temperature, dehydration, and salt stress). ATHB12 gene expressed in root, stem and leaf of potato, with
the highest expression in the root. qRT-PCR analysis confirmed that the gene was induced by PEG, NaCl, and ABA, but repressed
by cold treatment. The overexpressed-vector of ATHB12 gene driven by the constitutive promoter CaMV 35S was constructed,
and the transgenic plants were obtained using Agrobacterium-mediated transformation system. The malondialdehyde (MDA)
content in the transgenic plant leaves was significantly lower (P 0.05), whereas the proline content was significantly higher
(P0.05) than those of non-transgenic control under drought stress. The fresh and dry weight of the transgenic plant root was
higher than that of non-transgenic plants. These results showed that ATHB12 gene may be involved in response to stress.
Keywords: Potato; HD-Zip; ATHB12 gene; Root; Malondialdehyde; Proline
同源异型域亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leu- cine zipper, HD-Zip)是植物特异转录因子, 由 DNA同
第 8期 武亮亮等: 马铃薯 HD-Zip I家族 ATHB12基因的克隆及功能鉴定 1113
源结构域(HD)和附加的 Leu zipper (LZ)元件组成, 前
者与 DNA特异结合, 后者介导蛋白二聚体的形成[1]。
依据 HD-ZIP 转录因子结构和功能差异, 可将其分为
HD-Zip I、HD-Zip II、HD-Zip III和 HD-Zip IV四类[1]。
HD-Zip转录因子已分别从拟南芥(Arabidopsis thaliana
L.)[2]、烟草(Nicotiana tabacum L.)[3]、苜蓿(Medicago
truncatula L.)[4]和小立碗藓(Physomitrella patens H.)[5]
中被克隆出来, 并对其响应非生物胁迫的功能进行了
研究。HD-Zip转录因子亚家族 I和 II表达受干旱、高
盐和冷害等非生物胁迫因子的诱导, 这两类基因参与
激素信号途径, 通过与合成激素途径相关基因和下游
功能基因互作来调控植物形态结构或生理状态从而提
高植物耐逆性[1]。HD-Zip I 类转录因子调节植物干
旱胁迫应答方面有 ABA依赖型和 ABA非依赖型[1]。
缺水胁迫和外源 ABA 诱导拟南芥 HD-Zip I 类转录
因子基因 ATHB6、ATHB7 和 ATHB12 表达, 表明
ATHB6、ATHB7, ATHB12受水分胁迫方面起着正向
调节作用[6-7]。还魂草(Craterostigma plantagineum)中,
HD-Zip I类转录因子基因的 4个成员 CpHB4、CpHB5、
CpHB6、CpHB7 表达均受到脱水胁迫所调节 , 但
CpHB4、CpHB5的表达量在 ABA胁迫下没有变化; 而
CpHB6、CpHB7 表达量同时受脱水胁迫和 ABA 所调
节[8]。来自于向日葵 Hahb4 基因在拟南芥中过量表达
能显著增强耐旱性, 植株长势表现出了节间缩短, 叶
片变窄等适应干旱的性状[9]。玉米中, 超表达 Zmhdz10
基因提高了对盐和干旱胁迫的抗性, 对于ABA敏感性
增强, 叶片中丙二醛(MDA)含量降低, 脯氨酸(Pro)含
量增高[10]。这些成员均含有 1个 HD和 1个 LZ结构
域, 属于 HD-Zip I型 HD-Zip转录因子亚家族。
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是重要的粮菜兼用
作物。Xu等[11]根据马铃薯基因组测序结果用生物信息
学方法预测了马铃薯ATHB12-like基因(GenBank登录
号为XM_006339695)序列, 但关于马铃薯HD-Zip I类
转录因子的功能的研究还未见报道。本研究根据
ATHB12-like基因的 cDNA序列设计引物 , 克隆了
ATHB12基因, 对其进行了生物信息学分析和不同胁
迫条件下的表达分析, 并通过转基因技术在马铃薯中
过表达后对其功能进行了鉴定, 取得的结果对于进一
步研究马铃薯HD-Zip I转录因子的功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料、菌株、载体和试剂
将马铃薯栽培品种甘农薯2号的无菌苗剪成带
有腋芽的茎段, 转接到含50 mL MS+3%蔗糖液体培
养基的150 mL三角瓶中 , 每瓶接5株。在光照800
mol s–1 m–2、光照时间16 h d–1、温度(23±1)℃下培
养3周形成壮苗。参照张宁等[12]的方法诱导试管薯。
大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态购自北京全
式金生物技术有限公司; 质粒载体pMD18-T购自大
连宝生物工程公司; 表达载体pBI121、根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404由甘肃省
作物遗传改良与种质创新重点实验室保存。Taq PCR
Mastermix、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)荧光染料、RNA
提取试剂盒(RNAprep Pure Plant Kit)、高纯质粒小提
试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购于
TIANGEN公司 ; 反转录试剂盒 (RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit)购自Thermo Fermentas;
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物, 其
余试剂均为国产分析纯。
1.2 总 RNA提取、反转录及目的基因的克隆
参照RNAprep Pure Plant Kit说明书提取生长3
周后整株幼苗的RNA, 参照RevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA第1链。根据马
铃 薯 ATHB-12-like 基 因 (GenBank 登 录 号 为
XM_006339695)序列, 利用Primer Premier 5.0设计
包含全长开放阅读框序列的基因特异正向引物
ATHB12-F (5-GCTCTAGAGAACATTCCAGTTCCA
ATCC-3)和反向引物ATHB12-R (5-CGGGATCCTC
AAATGTACAAGAGTCGCG-3) (其中画线部分分别
为Xba I和Bam H I酶切位点, 斜体部分为保护碱基),
预期扩增片段为911 bp。PCR体系含 : Taq PCR
Mastermix 12.5 µL 、 10 µmol L–1ATHB12-F 和
ATHB12-R各1 µL、500 ng µL–1 cDNA模板1 µL,
ddH2O补足至25 µL。PCR条件为: 94℃预变性4 min;
94℃变性30 s, 59℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 循环
35次; 72℃继续延伸10 min。PCR产物经电泳回收后
连接到载体pMD18-T, 转化DH5α感受态细胞, 经菌
落PCR鉴定, 选取阳性克隆送上海生工生物工程有
限公司测序, 将其命名为ATHB12基因。
1.3 ATHB12基因的生物信息学分析
用 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)
分析 ATHB12基因编码氨基酸的理化性质, 用 PGSC
(http://www.potatogenome.net/index.php/Main_Page)
确定基因在染色体组中的位置信息 , 用在线网站
PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)预测并
分析基因的顺式作用元件 ; 在 NCBI (http://www.
1114 作 物 学 报 第 42卷
ncbi.nlm.nih.gov/)进行 Blast 同源性比对, 并选择同
源性较高的8种植物, 运用 DNAMAN软件进行氨基
酸多序列比对分析 ; 采用在线工具 GSDS (http://
gsds.cbi.pku.edu.cn/)确定 ATHB12基因的内含子和外
显子。
1.4 胁迫处理
选取液体培养3周且生长基本一致的马铃薯试
管苗 , 倒掉三角瓶中的液体培养基 , 分别加入含
20% PEG-6000、0.1 mmol L–1 ABA和200 mmol L–1
NaCl的3%MS液体培养基, 并分别设置对照, 置800
mol s–1 m–2, 16 h d–1光照, 温度(23±1)℃下胁迫处
理; 置800 mol s–1 m–2, 16 h d–1光照的4℃培养箱低
温处理。在处理后0、4、8、12和24 h后采集整株幼
苗, 用液氮速冻后于–80℃超低温冰箱保存备用。
1.5 以 qRT-PCR 分析基因的组织表达和胁迫诱
导下的表达特性
取 3%MS液体培养基培养 3周的马铃薯试管苗
的根、茎和叶 , 以及胁迫处理的马铃薯材料提取
RNA, RNA提取及 cDNA合成方法见 1.2。用实时荧
光定量 PCR(qRT-PCR)分析基因的表达特性。用软件
primer premier 5.0设计 ATHB12基因的 qRT-PCR引
物 ATHB12-qF (5-TCGGGTTAGATGACGATGCAG
-3)和 ATHB12-qR (5-ATCGTCGTTTAGACTGCCC
C-3)。用马铃薯延伸因子(ef1a) (GenBank登录号为
XM_006347752)基因作内参基因, 引物序列为 ef1a-
F (5-TCACTGGGTACCAAGCCTCA-3)和 ef1a-R (5-
CCAGCACCTTCACCGGATAC-3)。参照 TIANGEN
公司 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒说
明书进行实时定量 PCR。PCR体系含 cDNA模板 2
µL、 2×SuperReal PreMix Plus 10 µL、 50×ROX
Reference Dye 0.4 µL、10 µmol L–1引物各 0.6 µL, 加
ddH2O至终体积 20 µL。反应在 Mxpro Mx3005p仪
器上进行, PCR程序为 95℃预变性 30 s; 95℃ 15 s,
60℃ 33 s, 72℃ 1 min, 共 40个循环, 最后 72℃延
伸 10 min。用 2–ΔΔCt法进行相对定量分析[13]。试验 3
次生物学重复, 所有样品均进行 3 次技术重复取平
均值, 并以生物学重复计算其标准偏差。用 Origin
8.0 软件作图 , 用 SPSS17 软件进行方差分析 , 用
Duncan’s法进行显著性分析(P < 0.05)。
1.6 基因过表达载体的构建
分别用Xba I和Bam H I双酶切ATHB12基因的克
隆载体质粒和表达载体pBI121, 将酶切后纯化的克
隆载体小片段(ATHB12基因)和表达载体大片段混合,
用T4 DNA连接酶16℃过夜连接 , 转化大肠杆菌感
受态 DH5α, 经酶切鉴定后将重组质粒命名为
pBI121-ATHB12。采用冻融法将重组质粒导入农杆
菌LBA4404制备工程菌液用于遗传转化[14]。
1.7 马铃薯的遗传转化及检测
参照张宁等[12]的操作方法, 以马铃薯栽培品种
甘农薯 2号的试管薯作为遗传转化受体。按照
Edwards等 [15]的方法从转化马铃薯植株中提取基因
组总DNA, 以未转化的植株作阴性对照, 重组质粒
pBI121-ATHB12作阳性对照。以总DNA为模板, 用
pBI121表达载体上的选择标记基因nptII设计引物进
行PCR扩增, 引物序列为nptII-F (5-GCTATGACTG
GGCACAACAG-3)和nptII-R (5-ATACCGTAAAGC
ACGAGGAA-3)。PCR扩增程序为 94℃ 3 min; 94
℃ 30 s, 57℃ 40 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃延伸
10 min, 预期的扩增片段为676 bp。用qRT-PCR分析
转基因植株与对照植株整株幼苗中ATHB12基因的
相对表达量, 方法同1.5。
1.8 转基因植株丙二醛和脯氨酸含量的测定及
表型观察
将转基因马铃薯无菌试管苗分别剪取带有顶芽
的长1 cm外植体, 转接到含有45 mL 3%MS固体培
养基的100 mL试管中 , 每管接种1个顶芽 , 置于
800 mol s–1 m–2, 16 h d–1光照下培养3周, 测定试管
苗的株高(根原基以上部分长度)、根鲜重及干重(鲜
重即从培养基中取出所有根后蒸馏水洗净, 滤纸吸
干水分后的重量; 干重是将鲜样在80℃烘箱干燥至
恒重的重量)。每个转基因植株与对照共设5个重复。
按照1.4中描述的方法PEG-6000胁迫处理5 d后取植
株所有叶片, 参照陈建勋和王晓峰[16]的方法测定丙
二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量。在数据处理时候运
用相对值, 即统计分析每个材料PEG处理后的值与
未处理的值之比。混合每瓶5株植株所有叶片为一个
处理, 每个处理与对照共设5个重复。试验重复3次,
取平均值。用Origin8.0软件整理数据和作图 , 用
SPSS.17.0软件统计分析。
2 结果与分析
2.1 ATHB12基因 cDNA克隆及生物信息学分析
以马铃薯总RNA反转录获得的cDNA为模板 ,
用ATHB12基因的引物ATHB12-F和ATHB12-R扩增
得到长度约900 bp的PCR扩增片段(图1), 将PCR产
物切胶回收后连接至载体pMD18-T, 转化大肠杆菌
第 8期 武亮亮等: 马铃薯 HD-Zip I家族 ATHB12基因的克隆及功能鉴定 1115
DH5α, 提取质粒测序表明其序列与马铃薯ATHB-
12-like (GenBank登录号为XM_006339695)同源性达
到100%。
图 1 马铃薯 ATHB12基因 PCR扩增
Fig. 1 PCR of ATHB12 gene in potato
1: ATHB12 cDNA片段扩增条带; M: DNA分子量标准。
1: ATHB12 cDNA amplification fragments; M: DNA marker.
生物信息学分析显示该基因包含一个759 bp的
开放读码框, 编码252个氨基酸残基, 等电点为5.64,
分子量约28.71 kD, 位于马铃薯第1染色体。氨基酸
序列多重对比发现不同物种间ATHB12基因编码蛋
白在HD区域存在很高的保守型, LZ基序差异较大
(图2)。基因结构分析发现ATHB12基因包含1个内含
子和2个外显子。对ATHB12起始密码子上游1500 bp
的启动子区序列分析发现除含有 TATA-box和
CAAT-box等基本转录元件外, 还存在多种激素响应
元件 , 包括 ABA响应元件 ABRE、MYB1AT和
MYCCONSENSUSAT; 赤霉素应答元件、水杨酸应
答元件GL1CONSENSUS等 ; 同时 , ATHB12启动子
区域还包含了许多胁迫应答相关的顺式作用元件 ,
如脱水响应元件MYB1AT和MYB2AT, 低温应答元
件LTRECOREATCOR15; 黄酮类化合物和花青素合
成相关元件EBOXBNNAPA和MYBCORE (表1)。
2.2 ATHB12基因在马铃薯不同组织中的表达分析
通过qRT-PCR检测到ATHB12在马铃薯试管苗
不同部位(根、茎、叶)中均有表达, 其相对表达量为
根>叶>茎, 在根中表达较高, 是茎中表达量的3.5倍
(图3)。
2.3 ATHB12基因胁迫诱导下的表达特性分析
利用 qRT-PCR方法分析了 PEG、NaCl、ABA、
低温等非生物胁迫条件下马铃薯整株幼苗中
ATHB12的表达模式。结果表明该基因的表达明显受
PEG、NaCl 和 ABA 诱导, 而受低温抑制(图 4)。在
PEG胁迫 8 h, ATHB12基因表达快速上调至最高水
平, 然后逐渐下降, 至 12 h表达水平略高于 4 h, 24 h
又迅速上升(图 4); ATHB12基因在受到 NaCl胁迫时
表现出上升趋势, 12 h表达量达到最高值, 24 h表达
量有所下降(图 4); 在 ABA处理下, ATHB12基因的
表达量在 4 h 快速上升至最高水平, 随着处理时间
表 1 ATHB12启动子区顺式作用元件预测分析
Table 1 Putative cis-acting regulatory elements in the ATHB12 promoter
元件名称
cis-element name
序列
Sequence (5–3)
个数
Number
功能
Function
MYCCONSENSUSAT CANNTG 8 MYC识别位点; ABA应答 MYC recognition site; ABA response
WBOXATNPR1 TTGACC 3 应答环境胁迫 Response to environmental stress
TATABOX5 TTATTT 7 叶绿体谷氨酰胺合成 Chloroplast glutamine synthetase
WRKY71OS TTGAC 6 WRKY识别位点; ABA应答 WRKY recognition site; ABA response
MYB2CONSENSUSAT YAACKG 2 MYB识别位点; 胁迫脱水应答 MYB recognition site; Dehydration stress response
MYBCORE CNGTTR 3 MYB识别位点; 黄酮类化合物合成 MYB recognition site; Flavonoid synthesis
OSE1ROOTNODULE AAAGAT 3 影响侧根的发展 Effect on lateral root development
DOFCOREZM AAAG 19 呼吸作用 Respiration
MYB2AT TAACTG 1 MYB识别位点; 脱水应答 MYB recognition site; Dehydration response
MYB1AT WAACCA 4 MYB识别位点; 脱水及 ABA应答
MYB recognition site; Dehydration and ABA responses
ABRELATERD1 ACGTG 2 ABRE-like; 早期脱水应答 ABRE-like; Early response to dehydration
T/GBOXATPIN2 AACGTG 1 MYC识别位点; JA应答 MYC recognition site; JA response
EBOXBNNAPA CACGTGMOTIF 8 花青素合成相关 nthocyanin synthesis-related
LTRECOREATCOR15 CCGAC 2 ABA、冷害和干旱胁迫相关 ABA, cold and drought stress-related
GL1CONSENSUS AACGTT 13 水杨酸诱导表达; PR相关蛋白 Salicylic acid induced expression; PR-related protein
1116 作 物 学 报 第 42卷
图 2 马铃薯 ATHB12氨基酸序列与其他物种同源氨基酸序列多重比对结果
Fig. 2 Alignment of the potato ATHB12 amino acid sequence and its homologous amino acid sequences from other species
下画线: HD结构域; 虚线: LZ基序。Underline: HD domain; Dot line: LZ motif.
图 3 马铃薯 ATHB12基因在不同器官中的 qRT-PCR表达检测
Fig. 3 qRT-PCR assay of ATHB12 gene in different organs of
potato
内参基因: ef1a, n=3; 误差线表示 3个重复间的标准偏差; 柱上
不同字母表示差异显著(P<0.05), 图 4同。
Reference gene: ef1a, n=3; Error bars indicate standard deviation
for three replicates; Bars superscripted by different letters are
significantly different at P<0.05. The same as in Fig. 4.
的延长, 表达水平逐步下降, 至 24 h 接近未处理时
的表达水平(图 4)。ATHB12 在低温胁迫下, 表现出
相反的表达模式, 即呈下调趋势。在低温胁迫 4 h后
明显被抑制, 之后逐渐上升(图 4)。这些结果表明
ATHB12基因参与了马铃薯对 PEG、NaCl、ABA和
低温的应答反应。
2.4 转基因马铃薯植株的获得及鉴定
马铃薯试管薯薄片在芽分化培养基上经过 2 周
的培养, 转化薯片直接长出绿色小芽(图 5-A)。剪接
至生根选择培养基经过 2 周培养, 未转化植株不生
根, 而转化植株能够正常生根(图 5-B)。分别提取未
转化植株和转化马铃薯植株的总 DNA, 用 nptII 基
因作为筛选标记进行 PCR检测, 获得 PCR呈阳性的
植株 8株(图 6)。对鉴定为阳性的转基因马铃薯进行
qRT-PCR分析表明, ATHB12基因已在转基因植株中
得到了不同程度的超量表达 (L5 的表达量有所下
降)(图 7)。选取其中 2 个表达量较高的转基因株系
(L1和 L7)进行后续的表型观察和生理指标测定。
2.5 丙二醛和脯氨酸含量的测定
未处理前, MDA含量在 L1、L7和 CK中无显著
差异; PEG处理 5 d后 CK叶片中 MDA含量是处理
前的 2.43 倍(图 8 和表 2)。MDA 含量相对值在 CK
中大于 L1、L7, 但无显著差异(表 2)。未处理前, Pro
含量在 L1、L7叶片中高于 CK; PEG处理 5 d后, Pro
含量在 CK和 L1、L7叶片中都上升(图 8)。Pro含量
相对值在 CK中显著小于 L1、L7 (表 2)。
第 8期 武亮亮等: 马铃薯 HD-Zip I家族 ATHB12基因的克隆及功能鉴定 1117
图 4 马铃薯 ATHB12基因在不同胁迫条件下的 qRT-PCR表达检测
Fig. 4 qRT-PCR assay of ATHB12 gene of potato under different stress treatments
A: 聚乙二醇; B: 氯化钠; C: 脱落酸; D: 低温。A: PEG; B: NaCl; C: ABA; D: cold.
图 5 马铃薯的转化
Fig. 5 Potato transformation
A: 试管薯薄片长出芽; B: 转化植株生根筛选; L1, L2, L3: 转化
植株; CK1, CK2, CK3: 非转化植株。
A: shoot regeneration from potato microtuber; B: rooting selection
of transformed plants; L1, L2, L3: transformed plants; CK1, CK2,
CK3: non-transformed plants.
图 6 转化马铃薯的 PCR检测
Fig. 6 PCR identification of ATHB12 transgenic potato plants
M: DNA分子量标准; P: 质粒; CK: 非转化植株; L1~L8: 转化植株。
M: DNA marker; P: plasmid; CK: non-transformed plants; L1–L8:
transformed plants.
图 7 以 qRT-PCR分析转基因植株中 ATHB12基因的
表达水平
Fig. 7 Expression level of ATHB12 gene in the transgenic
plants assayed by qRT-PCR
CK: 非转基因植株; L1~L8: 转基因植株; 内参基因: ef1a, n=3。
CK: non-transgenic plants; L1–L8: transgenic plants; Reference
gene: ef1a, n=3.
2.6 转 ATHB12基因试管苗生物学性状的差异
为了验证ATHB12在转基因植株中的作用, 观察
了试管苗在根系方面差异, 结果发现与非转基因的
对照相比, 转基因植株的根系增多, 而株高无明显
变化(图9和表3); 转基因株系L1和L7的根鲜重和干
重均高于非转基因的对照(表3)。
1118 作 物 学 报 第 42卷
图 8 转基因植株的丙二醛和脯氨酸含量
Fig. 8 MDA and proline content in the transgenic potato plants
A: 丙二醛含量, B: 脯氨酸含量; CK: 非转基因植株; L1, L7: 转基因植株。数据为 5次生物学重复的平均值±标准偏差, 柱上不同字母
表示差异显著(P<0.05)。
A: MDA content, B: proline content; CK: non-transgenic plants; L1, L7: transgenic plants. Values are the mean ±SD of five biological repli-
cates. Bars superscripted by different letters are significantly different at P<0.05.
表 2 转基因植株的丙二醛和脯氨酸含量相对值
Table 2 Relative value of MDA and proline content in the transgenic potato plants
相对值(PEG处理后/未处理)
Relative value (PEG treated/untreated) CK L1 L7
丙二醛 MDA 2.43±0.31 a 1.99±0.34 a 1.95±0.23 a
脯氨酸 Proline 1.95±0.26 a 2.76±0.22 b 2.81±0.40 b
同行中具有不同字母的平均值间差异显著(P<0.05); n = 5。
Values followed by different letter within the same line are significant by different at P<0.05; n = 5.
表 3 转基因植株试管苗株高和根重
Table 3 Plant height and root weight of the transgenic test-tube plant
株系 Line 株高 Plant height (cm) 根鲜重 Root fresh weight (mg) 根干重 Root dry weight (mg)
CK 6.0±0.77 a 20.9±1.5 a 1.3±0.38 a
L1 6.2±1.20 a 35.4±2.3 b 2.7±0.74 b
L7 6.5±0.93 a 37.8±4.2 c 3.2±0.83 b
同列中具有不同字母的平均值间差异显著(P<0.05); 试管苗转接 3周后统计相关指标。数据为 5次生物学重复的平均值±标准偏差。
Values followed by different letter within the same line are significant different at P<0.05. Statistics related indicators were calculated
after three weeks of plantlets subculture. The data represent the mean ± standard deviation of five biological replicates.
3 讨论
Ollson等[7]的研究结果表明HD-Zip I家族基因参
与了植物非生物胁迫响应和耐受性。已有的研究结果
表明, HD-Zip I家族的一些成员主要通过调节糖类代
谢信号通路基因[17]、叶片性状[18]、茎和节间长度[19]、
减少内源 ABA含量[20]、增强维生素 C的含量[21]等改
变外在形态结构或增加内源渗透调节物质来提高植
物的抗氧化能力以应对一系列逆境胁迫。
本研究利用马铃薯基因组测序后预测的
ATHB-12-like基因开放阅读框序列设计引物, 从马铃
薯品种甘农薯2号中克隆了ATHB12基因。该基因与拟
南芥ATHB5、ATHB7、ATHB12均具有很高的序列相
似性, 同属HD-Zip I亚家族。拟南芥ATHB5、ATHB7、
ATHB12已被证明参与了ABA相关的非生物胁迫调节
过程[7]。玉米、黄瓜中一些HD-Zip I家族基因的启动
子区域含有ABRE、DRE、LTRE等元件, 研究表明此
类基因参与植物响应胁迫调节[10,22]。花青素、类黄酮
化合物的积累是植物应答逆境胁迫的一个重要特性,
具有调节植物的耐旱性等功能[23]。基因的诱导表达与
其启动子区的顺式作用元件密切相关, ATHB12启动
子分析暗示其参与了胁迫响应和次生代谢物调节。
基因的组织表达特异性直接反映该基因在相应
部位的生物学功能, 相关研究证实了植物中HD-Zip
I基因具有组织表达特异性[24]。Capella等[19]的报道表
明AtHB1基因在拟南芥根部和下胚轴的表达量高于
第 8期 武亮亮等: 马铃薯 HD-Zip I家族 ATHB12基因的克隆及功能鉴定 1119
图 9 转基因植株试管苗表型差异
Fig. 9 Phenotype difference between the transgenic test-tube
plants and the control
CK: 非转基因植株; L1, L7: 转基因植株。
CK: non-transgenic plants; L1, L7: transgenic plants
茎、叶等器官, 具有促进下胚轴延伸的功能。Liu等[22]
发现黄瓜叶片和花器官中CsHDZI10基因的表达量
高于其他组织。本研究初步发现ATHB12在根部表达
量较高, 暗示该基因主要参与根系生长发育调节。
同一个转录因子在受多种胁迫诱导表达的同时, 往
往另外一种胁迫抑制其表达[25-26]。ZmNF-YA14转录
因子的表达受到盐胁迫诱导, PEG和ABA抑制其表
达[27]。Hou等[28]研究发现盐胁迫诱导MYB类转录因
子CsMYB55表达, 甘露醇抑制其表达。本研究结果
表明ATHB12的表达受干旱、高盐和ABA等胁迫的诱
导, 受低温抑制, 这与前人研究其他转录因子的结
果类似, 表明植物应答非生物胁迫的信号途径非常
复杂。生物信息学分析结合逆境表达试验结果, 表
明ATHB12基因参与了马铃薯对PEG、NaCl、ABA和
低温的响应。
Ariel等 [4]研究发现苜蓿中MtHB1基因过表达使
得侧根减少, 根系变长。水稻中Oshox4基因过表达
使地上部分变矮 [29]。这与我们的研究结果不一致 ,
可能是物种间的差异所致。非生物胁迫会使植物合
成渗透调节物质, 其含量的变化可以作为评价植物
耐性的指标, Pro是最普遍的渗透调节物质之一。植
物在正常条件下Pro含量很低, 逆境条件下, 植物体
内游离Pro便会大量积累, 积累量与植物的抗逆性呈
正相关[30]。本研究中, 转基因马铃薯叶片中Pro的相
对含量高于非转基因植株, 推测ATHB12基因超表达
提高马铃薯对PEG胁迫的抗性, 可能是通过促进叶
片内Pro的积累而减少渗透胁迫对细胞结构的损害,
保护细胞膜的完整性, 维持植物细胞正常的代谢活
动。非生物胁迫下, 植物体内会产生大量超氧自由
基(ROS), 造成植物细胞膜的过氧伤, MDA是膜脂过
氧化的产物之一, 是衡量氧化胁迫的标志物, 用来
评估氧化胁迫对膜的损伤程度[30]。本研究中转基因
株系叶片中MDA含量相对值低于非转基因植株, 说
明超表达ATHB12基因可减少膜脂过氧化程度, 减轻
对膜系统的损伤, 提高马铃薯对PEG胁迫的抗性。综
合结果分析说明马铃薯ATHB12基因可能参与了胁
迫应答, 但相关的分子机制有待进一步研究。
4 结论
ATHB12 基因启动子区含有胁迫应答相关的调
控元件, 该基因的表达受 PEG、NaCl 和 ABA 诱导,
受低温的抑制。ATHB12基因在马铃薯根、茎、叶中
均有表达, 其中根中表达量最高。ATHB12基因调控
马铃薯根系的发育和MDA与 Pro的含量, 推测该基
因可能参与调控植物对非生物胁迫因子的应答。
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