全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17( 1) : 10～14
Journal of Wuhan Botanical Research
盐生杜氏藻质膜 ATPase及其
对高渗震动的反应
杜延茹 贾 媛 李洪泉
(哈尔滨师范大学生物系 哈尔滨 150080)
提 要 用水溶性多聚物 ( dex tr an T500/ PEG 3350)两相法制备盐生杜氏藻细胞质膜, 经检
测质膜纯度较高, 原位膜约占 78%。质膜 AT Pase 的动力学常数 K m 和 V max分别为
0. 58 mmol/ L和 43. 59 mol Pi/ ( mg pro tein·h) ; 最适 pH 值是 7. 5。质膜 AT Pase的活性随
MgCl2 和 CaCl2浓度的升高而增加, 但较高浓度的 MgCl2和 CaCl2 有轻微的抑制作用; KCl
促进质膜 AT Pase 的活性, 在 100 mmol/ L 时达到最大,高于 100 mmol/ L 时抑制效应显著。
钒酸钠、DES、DCCD和 NEM 明显地抑制质膜 ATPase的活性; 而 NaN 3、NaNO 3、NaMoO 4和
KCN 对质膜 ATPase 的活性影响不大。高渗震动刺激了质膜 ATPase 的活性。
关键词 盐生杜氏藻, 质膜 ATPase, 高渗震动
盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是一种无细胞壁的单细胞绿藻, 可以在 0. 1～5. 5 mo l/ L 的 NaCl溶
液中生存, 并且能快速地适应外界渗透势的剧烈变化, 因此成为研究植物细胞对渗透胁迫反应的理想材
料〔1〕。许多学者对其渗透调节机理进行了详细的研究〔2～5〕,发现细胞内甘油是主要的渗透调节物质。在
低渗震动 5 min 之内, 胞内甘油即开始转化为淀粉, 从而降低了胞内的渗透势; 而高渗情况下, 淀粉则较
快地降解为甘油, 提高细胞内渗透势〔5〕。但是, 关于启动甘油代谢的因子尚无定论。Kuchitsu 等〔6〕认为胞
内 pH 和无机 P i浓度可能是盐生杜氏藻渗透调节的主要因子 ; O ren Shamir 等〔7〕和陈志〔2〕用质膜 AT -
Pase 的抑制剂钒酸钠、乙烯雌酚( DES )间接证明质膜 ATPase 在盐生杜氏藻渗透调节中起着重要的作
用, 但关于质膜 AT Pase的特性及其在渗透震动过程中的活性变化还缺乏研究。我们用经过两相法制备
的盐生杜氏藻质膜为材料, 研究质膜 ATPase的一些特性和其对高渗震动的反应,探讨了盐生杜氏藻渗
透的调节机制。
1 材料与方法
( 1) 藻细胞的培养: D . salina参照P ick〔8〕的培养方法, 营养液中含 2 m ol/ L NaCl, 每日光照12 h,光
强为 PAR 60 mo l/ ( m2·s) ,温度 25±1℃ ,用对数期的藻细胞作实验材料。用于高渗震动实验的藻细胞
预先经无磷酸盐的培养液处理 24 h。
( 2) 质膜制备: 按照 Einspahr 等〔9〕的方法略作改动。500 mL 藻细胞悬浮液经过 2 000×g 离心
10 min, 用含 2 mo l/ L NaCl, 2 m mol/ L MgCl2的 10 mmo l/ L 磷酸缓冲液( pH7. 0)洗涤后,悬浮于 6倍体
积预冷的渗透破胞液中 ( 10 mmol/ L NaCl, 2 mm ol/ L MgCl2, 0. 1 mg / mL BAS , 1 mmol/ L DTT ,
收稿日: 1997-07-25,修回日: 1998-04-07。第一作者:女, 48岁,副教授,现从事低等生物生理生化方面研究。
蔡火石生物科学发展基金资助项目。
5 mm ol/ L , -氨基乙酸, 100 mmo l/ L 磷酸缓冲液( pH8. 0) , 0℃ 30 min,减压抽气并间歇振荡, 使藻细胞
胀破(以下操作皆在 0～4℃进行)。经 2 600×g 离心 4 min, 沉淀即为叶绿体部分;上清液经 20 000×g
离心 15 m in, 除去线粒体; 取上清液加到 dex tr an/ PEG 两相系统〔6. 7% dex tr an T 500 ( w / w ) , 6. 7%
PEG 3350 ( w / w ) , 30 mmo l/ L NaCl, 0. 44 mmol/ L M gCl2, 0. 89 m mol/ L EDT A , 178 mmo l/ L 甘露醇,
44. 6 mmol/ L 磷酸缓冲液( pH8. 0)〕, 混和, 660×g 离心 10 min,取出上相 ( PEG 相) ,再经过 150 000×g
离心 1 h ( MSE-75 型超速冷冻离心机) ,沉淀颗粒即为质膜制剂。下相( dex tr an 相)富含有细胞内膜,用
缓冲液稀释后, 150 000×g 离心 1 h。将上相和下相的沉淀颗粒分别匀浆后, 悬浮于 1 mmol/ L DTT ,
0. 25 mmol/ L 蔗糖, 10 mmo l/ L T ris-MES ( pH7. 2)的缓冲液中, 4 500×g 离心 40 min,将沉淀颗粒匀浆
分装, 于- 20℃保存。
( 3) 蛋白含量测定: 按李琳等〔10〕介绍的考马斯亮蓝 G-250 染色法进行。
表 1 盐生杜氏藻质膜制剂的纯度分析
Table 1 Analy sis of purity o f the plasma membrane fr om D . salina
项 目
Item
质膜制剂
Plasma
m emb rane
细胞膜
Cellular
mem bran es
叶绿体膜
Chlorop las t
m embr anes
质膜蛋白( g/ 1010cells )
M embrane pr otein
10. 43 39. 71 137. 51
核酸( mg/ m g protein)
( Nucleic acid)
0. 11 0. 65 0. 22
Ch l ( g/ mg protein) 1. 67 39. 50 103. 80
基础活性〔m ol Pi/ ( mg protein·h)〕
AT Pase act ity basal
Basal 36. 70 - -
+ KCl ( 50 mm ol / L) 39. 68 - -
+ KCl+ N a3VO 4( 0. 1 mm ol/ L) 14. 43 - -
+ KCl+ T riton X-100 ( 0. 05% ) 65. 22 - -
( 4) 核酸含量测定: 按张
龙翔等〔11〕的方法。
( 5) 叶绿素含量测定: 按
叶济宇等〔12〕介绍的方法。
( 6) AT Pase活力测定: 按
焦新之等〔13〕的方法。
2 实验结果
2. 1 质膜制剂纯度的鉴定
质膜制备后, 进行了纯度
分析, 结果见表 1。由表 1 可以
看出质膜蛋白约占总蛋白的
5% ,质膜制剂中仍含有少量的
核酸和叶绿素; 质膜上的 ATPase 活性被 KCl激活, 被钒酸钠抑制; T riton X-100 处理使潜在的 AT Pase
活性增加约 78% , 说明质膜制剂中主要是原位膜。原生质膜 ATPase的专一性抑制剂钒酸钠通常被用来
鉴定质膜制剂的纯度。我们的结果表明, 钒酸钠明显抑制质膜 ATPase的活性(表 1) ;而 NaN 3、NaNO 3、
NaMoO 4 对质膜 AT Pase 活性的影响不大。因此所获得的质膜制剂纯度较高。
2. 2 质膜 ATPase的酶学特性
动力学分析表明,盐生杜氏藻质膜 AT Pase的米氏常数 K m 约为 0. 58 mmol/ L ; 最大反应速度 V max
约为 43. 59 m ol P i/ ( mg prot ein·h) (图 1)。
图 1 质膜 ATPase的Lineweaver-Burk图
Fig. 1 T he Linew eaver-Burk plot of
p lasmalemma AT Pase
ATP 酶活性〔mol Pi/ ( mg protein·h )〕
AT Pase act ivity
pH
图 2 质膜 ATPase活性对介质 pH的依赖性
Fig. 2 pH dependence for plasmalemma
AT Pase act ivity
11 第 1期 杜延茹等:盐生杜氏藻质膜 AT Pase 及其对高渗震动的反应
反应介质的 pH 影响质膜 AT Pase的活性。从图 2可以看出盐生杜氏藻质膜 AT Pase的最适 pH 为
7. 5。
2. 3 MgCl 2、CaCl2和 KCl对质膜 ATPase 活性的影响
随着 MgCl2 和 CaCl2 浓度的升高, 质膜 ATPase 的活性增加; 较高浓度的 MgCl2 和 CaCl2使质膜
ATPase 活性有轻微的下降。MgCl2所引起的活性增加量比 CaCl2所引起的多(图 3)。
KCl 的盐生杜氏藻质膜AT Pase活性有明显的促进作用。在 KCl浓度 100 mmol/ L 时,质膜 AT Pase
的活性最高; 当 KCl浓度大于 100 mm ol/ L 时,质膜 ATPase活性显著下降; 但在 350 mmo l/ L 的范围
内, AT Pase的活性仍比对照高(图 4)。
相对 ATP 酶活性( % )
Relat ive ATPase act ivity
浓度 Concen trat ion ( mmol/ L)
图 3 MgCl 2和 CaCl2 浓度对 ATPase活性的影响
Fig. 3 Ef fect s of M gCl2 and C aCl 2 concent rat ions
on plasmalemm a AT Pase act ivity
相对 AT P酶活性( % )
Relat ive AT Pase activity
浓度 Concent rat ion ( mmol / L)
图 4 KCl浓度对质膜 ATPase活性的影响
Fig. 4 Ef fect of KCl con cen tr at ions on
plasmalemm a AT Pase act ivity
2. 4 抑制剂对质膜 ATPase活性的影响
表 2 列出了各种抑制剂对质膜 AT Pase 活性的作用。质膜 AT Pase 的典型抑制剂钒酸钠、DES、
DCCD和巯基试剂 NEM 显著地抑制质膜 ATPase 的活性, 其中 DES 效应最大, 抑制了 72. 87% ;而线粒
体内膜 AT Pase的抑制剂 NaN 3、液泡膜 ATPase 的抑制剂 NaNO 3、酸性磷酸酶的抑制剂 NaMoO 4和代
谢抑制剂 KCN 对质膜 ATPase活性的影响不大。
2. 5 高渗震动对质膜 ATPase 活性的影响
盐生杜氏藻细胞经历 2. 0～3. 0 mo l/ L NaCl高渗震动 20 min 时, 质膜 ATPase 活性明显增加。KCl
仍然有刺激作用, 钒酸钠有抑制作用(图 5)。
表 2 各种抑制剂对质膜 ATPase活性的影响
Table 2 Influence of inhibitor s on
plasmalemma ATPase activit y
抑制剂
Inhib itor
渗透浓度
( mmol/ L)
Concent rat ion
ATPase 活性
( % )
AT Pase activity
Non e( CK) - 100
Na3VO 4 0. 1 36. 32
DES 0. 1 27. 13
DCCD 0. 1 47. 3
NaN 3 1. 0 99. 10
NaNO 3 50. 0 100. 42
NaMoO 4 0. 1 98. 22
KCN 2. 0 103. 44
NEM 5. 0 54. 85
相对A TP 酶活性( % )
Relat ive ATPase act ivity
□对照( Cont ral) ; □震动( Sh ock)
图 5 高渗震动对质膜ATPase活性的影响
Fig. 5 Effect of hyperosmot ic sh ock ( 2. 0～3. 0 mol / L
NaCl ) on plasm a AT Pase act ivity ( Th e plasma
m embr ane w as prepared 20 min after shock . Th e
concent rat ions of KCl and Na3VO 4 w ere
50 mmol/ L an d 0. 1 mmol /L respect ively)
12 武汉 植物 学研 究 第 17卷
3 讨论
植物细胞质膜 ATPase是植物生命活动过程中的“主宰酶”( master enzyme) , 参与了营养物质与离
子的运输、细胞伸长、向性生长、气孔运动与渗透调节等重要的生理过程〔13～15〕。分离纯化细胞膜技术为
直接研究质膜 AT Pase 的特性提供了方便。Weiss 等〔16〕采用分步离心法, 即先离心除去叶绿体、细胞核
和细胞内膜,再把粗膜制剂加到 6%～7%的甘油中, 获得了纯化的盐生杜氏藻质膜。但此法操作复杂,
费时。我们采用水溶性多聚物( dex tr an T500/ PEG3350)两相法, 不仅提高了效率,而且保证了质膜的纯
度。上相( PEG 相)的 ATPase 活性很高,可被 K + 离子激活,而钒酸钠对其有抑制作用(表 1, 图 4, 图 5)。
对钒酸盐、DES、DCCD 和巯基试剂 MEM 敏感是质膜 AT Pase的典型特征〔16〕。研究结果表明,上述试剂
均较大程度地抑制质膜 AT Pase 活性, 其中 DES 的效应最显著 (表 2) ; 而 NaN 3、NaNO 3、NaMoO4、和
KCN 对质膜 ATPase活性的影响不大,说明了所获得的质膜制剂纯度较高。但质膜制剂中仍含有少量
的核酸和叶绿素(表 1) ,这可能是类囊体碎片和核糖体污染的结果。
盐生杜氏藻质膜 AT Pase的最适 pH 值为 7. 5,比水稻、燕麦等高等植物的高一些〔13〕, 这可能是因为
盐生杜氏藻细胞长期生活在高 pH 环境中产生了某种适应机制。MgCl2、CaCl2、KCl对AT Pase有不同程
度的激活作用, MgCl2的作用大于 CaCl2的作用,并且高浓度时表现出抑制效应。这与 Kaaden 等〔17〕和
Weiss 等〔16〕的结果一致。有人认为在AT Pase中存在着阴阳离子的结合部位,这个部位是酶活性所必需
的〔13〕。M g2+ 可以与底物 AT P 结合形成 Mg 2+ -ATP 复合物, K+ 对 ATPase 水解 Mg 2+ -ATP 复合物释放
出无机磷有刺激作用〔13〕。MgCl2 和 KCl对盐生杜氏藻质膜 AT Pase的作用与对其它植物 ATPase的作
用相似〔16〕; 而 CaCl2对其他植物质膜 AT Pase活性通常表现出抑制效应。
近年来, 质膜 ATPase 在环境胁迫中的作用问题受到了广泛的关注〔1, 14, 18〕。我们发现盐生杜氏藻在
经历高渗震动时, 质膜 ATPase 的活性明显提高(图 5) ,这和 Lerner 等〔18〕用盐生植物滨藜为材料所得到
的结果相同。已经证明,植物受到盐胁迫时, 质膜 AT Pase 是细胞内 AT P 的重要消费者〔7〕。因此高渗震
动过程中, 盐生杜氏藻质膜 ATPase 活性升高的同时, ATP 的含量会下降;而经历无磷酸盐培养液处理
后的藻细胞内 ATP 和 P i含量之和是个常数;当 ATP 含量下降时, P i的含量必然上升; Pi含量的升高启
动了藻细胞内甘油的合成〔6, 19〕, 进而增加细胞内的渗透势, 适应新的高渗环境。目前,关于藻细胞适应过
程中的许多细节,如渗透震动信号是如何被感受和传导的,胞内 Pi和 AT P 是如何影响甘油代谢的,都
还不清楚, 有待于进一步研究。
参 考 文 献
1 Cow an A K, Rose P D, Horne L G. Dunal iel la salina: A model sys tem for s tudying the response of plant cells to
st ress . J Exp Bot, 1992, 43: 1 534～1547
2 陈志,焦新之,刘虹.盐生杜氏藻质膜 H-AT P 在渗透调节过程中的可能作用.植物生理学报, 1991, 17: 333～338
3 李红萍,焦新之.盐生杜氏藻渗透调节过程中的甘油代谢途径.植物生理学报, 1994, 20: 91～99
4 Ben-Am otz A, Avron M . Accumulat ion of metabolit es by halotoeran t alga and i ts indus t rial potent ial. Ann Rev
Micr obiol , 1983, 37: 95～103
5 Th ompson G A. M ech anisms of osmoregu lation in the green alga Dunal iel la sal ina. J Exp Zool , 1994, 268: 127～
132
6 Kuch its uk K, Katsuhara M , Miyaohi S. Rapid cytoplasmic alkalizat ion and dynamic of in tr acellular comparmenta-
tion of inorgan ic phosph ate durin g adapt ion agains t salt s t res s in a halotoleran t unicellular gr een alga D . t erti ol eo-
ta: P-NMR s tudy. Plant Cel l Physiol, 1989, 30: 407～414
7 Oren-Shamir M , Pick U, Avr on M . Involvement of the plasma mem bran e ATPase in the osmoregu latory mech a-
nism of th e alga Dunal iel la sal ina. P lant P hy siol , 1989, 89: 1 258～1 263
13 第 1期 杜延茹等:盐生杜氏藻质膜 AT Pase 及其对高渗震动的反应
8 Pick U, Ben-Amotz A, Karn i L et al. Part ial character izat ion of K+ and Ca2+ uptake sys tems in the halotolerant al-
ga D . salina. Plant Physiol, 1986, 81: 875～881
9 Einspah r K J , Peeler T C , Th om pson G A. Phosphat idylin os itol 4, 5-bisph osphate phospholipase C and ph ospho-
monoes terase in Dunal iel la sal ina membranes . Plant Physiol, 1989, 90: 1 115～1 120
10 李琳,焦新之.应用蛋白质染色剂考马斯蓝 G-250测定蛋白质的方法,植物生理学通讯, 1980, 6: 52～54
11 张龙翔,张庭芳,李令媛.生物化学实验方法与技术.北京:人民教育出版社, 1981. 216
12 叶济宇,钱月琴.希尔反应活力的分光光度法测定.植物生理学实验手册.上海:上海科学技术出版社, 1985. 105
13 焦新之,倪晋山,李维琳等.水稻及燕麦根细胞的原生质膜、线粒体内膜与液泡膜 AT Pase 的比较研究.实验生物
学报, 1988, 21: 410～416
14 胡章立,李琳,荆家海等. 水分胁迫对玉米幼叶生长区细胞质膜 H-AT Pase活性的影响.植物生理学报, 1993, 19:
124～130
15 Nelson N. St ructu re, function and revolut ion of proton-AT Pase. P lant P hy siol , 1988, 86: 1～3
16 Weiss M , Sekler I, Pick U. Ch aracterizat ion of s oluble and membrane-bound forms of a vanadate-sens it ive AT Pase
f rom p lasma membranes of the halotoleran t alga Dunal iel la sal ina. B iochem B iop hy A cta, 1989, 974: 254～260
17 Kaaden R, Gimmler H. C har acterizat ion of membrane-bound AT Pase is olated f rom th e h alotolerant green alg a
Dunali ella p arva. In: Cram W J, Janacek K, Ryboug R et al . M emb rane t ransport in plants. A cademia P raha,
1984, 16: 558～559
18 Lerner H R, Reinhold L, Guy R et al . Salt act ivition and inhib ition of memb ran e ATPase from roots of th e halo-
phyte A tr ipl ex nummularia.P lant Cell Env ir on, 1983, 6: 501～508
19 Belmans D, Laere V A. Ef fect of inophores on AT P-pool and glycerol content in cel ls of the halotolerant green
alga D . tert ioleota. J G en Microbiol, 1988, 134: 2 261～2 268
PLASMALEMMA ATPase OF DUNALIELLA
SALINA AND ITS RELATION TO
HYPEROSMOTIC SHOCK
Du Yanru Jia Yuan Li Hongquan
(Dep artment of Biology, H ar bin N orm al Univ ersity Harbin 150080)
Abstract A fr act ion enriched in plasma membrane from Dunaliella salina was obt ained by apueous
tw o-phase part itio n sy stem ( dex tran T 500/ po ly ethylene glyco l 3350) , w ith high quality and purity . The
K m of plasmalemm a AT Pase was found t o be 0. 58 mmo l/ L , it s V max w as 43. 59 m ol P i/ ( mg proteinh)
and t he opt imum pH 7. 5. Enzyme activit y wa s stimulated by the increa se of concentra tion of MgCl2, Ca-
Cl2 and KCl, but much higher concentr ations had a litt le inhibito r y effect . T he plasmalemma ATPase ex-
hibited gr eat sensitiv ities t o v anadate, dicy eclohexy l carbodiimide ( DCCD) , SH regent N-ethylmaleimide
( NEM ) , especially to diethy lstibestr o ( DES) , wher eas it w as insensit ive t o azide, nitr ate, molybdate and
cyanide. T he ATPase activity w as notably incr eased fo llow ing hypero smotic shock, and its possible r o le
in osmo regulat ion w as discussed.
Key words Dunaliella salina, Char act erizat ion o f plasmalem ma ATPase, Hypero smo tic shock
14 武汉 植物 学研 究 第 17卷