全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 1944−1951 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08009-084B), 国家自然科学基金重大项目(31290210)和国家高技术研究发
展计划(863计划)项目(2012AA10A309)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 孙其信, E-mail: qxsun@cau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: worryrrow@139.com **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-03-18; Accepted(接受日期): 2013-06-25; Published online(网络出版日期): 2013-08-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130812.1750.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01944
小麦 TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定
王 瑞 1,2,** 吴华玲 3,** 王会芳 1,2 黄 珂 1,2 霍春艳 1,2 倪中福 1,2
孙其信 1,2,*
1农业生物技术国家重点实验室 / 北京市作物遗传改良重点实验室 / 中国农业大学, 北京 100193; 2国家植物基因研究北京中心, 北
京 100193; 3广东省农业科学院茶叶研究所, 广东广州 510640
摘 要: WRKY是植物特有的转录因子基因, 在植物对外界胁迫响应及生长发育的过程中发挥重要作用。本研究克隆
了一个新的小麦 WRKY转录因子基因 TaWRKY44, 获得其全长 cDNA, 其中开放阅读框长度为 897 bp, 编码 298个氨
基酸。半定量 RT-PCR的结果表明, TaWRKY44在叶片中表达水平较高, 并且受干旱和低温胁迫诱导表达。转基因功
能分析结果表明, TaWRKY44 的拟南芥超表达株系叶片变小, 叶柄缩短, 并且叶片细胞也明显小于野生型。另外, 转
基因系对 ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性也高于野生型, 说明该基因可能作为一个转录抑制子参与逆境胁迫信
号转导过程。
关键词: 小麦; WRKY; 基因表达; 叶片; 逆境胁迫; 功能分析
Cloning, Characterization, and Functional Analysis of TaWRKY44 Gene from
Wheat
WANG Rui1,2,**, WU Hua-Ling3,**, WANG Hui-Fang1,2, HUANG Ke1,2, HUO Chun-Yan1,2, NI Zhong-Fu1,2,
and SUN Qi-Xin1,2,*
1 State Key Laboratory for Agrobiotechnology / Beijing Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / China Agricultural University, Beijing
100193, China; 2 National Plant Gene Research Centre (Beijing), Beijing 100193, China; 3 Tea Research Institute, Guangdong Academy of
Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China.
Abstract: WRKY transcription factors are specific in plants and related in response to stress as well as plant development. In this
study, we cloned the full-length cDNA of a new WRKY transcription factor gene, TaWRKY44, from wheat (Triticum aestivum L.).
The open reading frame of TaWRKY44 is 897 bp in length, which encodes 298 animo acid residues. The semi-quantitative
RT-PCR result indicated that TaWRKY44 was highly expressed in leaf, and responsive to drought and clod stresses. TaWRKY44
over-expressed lines of Arabidopsis exhibited smaller leaves, shorter leaf petioles, and smaller leaf epidermis cell than the wild
type. In addition, the transgenic lines were more sensitive to abscisic acid, drought, and salt stresses. These results indicated
TaWRKY44 could be a negative regulator in stress signal transduction pathway.
Keywords: Wheat; WRKY; Gene expression; Leaf; Abiotic stress; Functional analysis
WRKY 基因是植物中特有的一个转录因子家族,
得名于其保守结构域中包含有一个 WRKYGQK 的
序列 [1]。早在 1994 年 , Ishiguro 等克隆出第一个
WRKY 蛋白 SPF1, 此后在许多生物相继有研究报
道。最近研究结果显示, 拟南芥、水稻和玉米分别
存在 72、107和 139个 WRKY基因[2-3], 说明 WRKY
基因是由多个成员组成的大家族。在小麦中, 迄今
仅克隆了 58 个 WRKY 基因[4-5]。因此, 分离和克隆
小麦新的 WRKY 基因 , 并鉴定其功能 , 将为探讨
WRKY基因与小麦生长发育的关系奠定重要基础。
研究发现, 植物 WRKY 转录因子基因广泛参与
植物对生物及非生物胁迫的响应。在逆境胁迫下 ,
第 11期 王 瑞等: 小麦 TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1945


植物能够感知并传递胁迫信号, 激活下游转录因子,
启动抗逆相关基因的表达, 从而促使植物体内发生
一系列的生理生化反应, 抵御不良环境的危害并提
高植物的耐逆性。HvWRKY38 在大麦中参与调控对
干旱胁迫的响应[6], AtWRKY8 在拟南芥中则参与盐
胁迫调控[7]。另外, 一些 WRKY基因在植物生长发育
过程中起重要作用。GaWRKY1在棉花中参与次生代
谢物的合成, AtWRKY6调控叶片衰老及成熟[8-10]。由
此可见, WRKY 转录因子对于植物胁迫响应及调控
生长发育具有重要的作用。
最近, Niu等[4]克隆了 43个小麦WRKY基因, 并
对其中 2 个基因(TaWRKY2 和 TaWRKY19)的功能进
行了鉴定, 发现 TaWRKY2和 TaWRKY19可能参与植
物非生物逆境胁迫过程。在本研究中, 我们克隆了
一个小麦 WRKY 基因 TaWRKY44, 在表达模式分析
的基础上 , 对其功能进行了鉴定 , 为深入探讨
TaWRKY44基因与植物生长发育的关系奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及处理
2011年9月在中国农业大学上庄试验站田间种
植小麦品种农大3338, 取分蘖盛期的叶片、分蘖节、
根系、开花期叶片、衰老期叶片及授粉后12 d的种
子提取RNA, 其中全长cDNA克隆材料为分蘖节。在
光照培养箱中 , 将小麦种子置培养皿滤纸上萌发 ,
培养条件为26 (16 h)/20 (8 h)(℃ ℃ 昼/夜), 相对湿度
75%。至三叶期, 对幼苗进行干旱(20% PEG, 2 h和4 h)、
低温(3 , 30 min℃ 和60 min)、高温(40 , 20 min℃ 和
40 min)及高盐(10% NaCl, 20 min和40 min)胁迫处
理 , 并以正常生长幼苗为对照。取各处理叶片提取
RNA进行表达分析。
亚细胞定位材料为新鲜洋葱表皮。
1.2 总 DNA、RNA的提取纯化和 cDNA的制备
采用CTAB法提取农大3338总DNA。用TRIzol
(TIANGEN)提取小麦不同组织和不同处理时间点叶
片的总RNA。按照TransScript First-Strand cDNA
Synthesis SuperMix Kit (TransGen Biotech)操作说明
合成cDNA, –20℃保存备用。
1.3 基因克隆和同源进化分析
按照吴华玲等 [5]报道的方法, 以拟南芥和水稻
中已报道的WRKY基因为搜索序列, 在GenBank数据
库中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源
比对搜索, 找出小麦中相关的EST序列后进行电子
拼接, 获得包含完整开放阅读框(ORF)的cDNA序列
后进行氨基酸序列比对分析, 筛选出未报道的新基
因, 然后设计基因特异引物P1-L和P1-R (表1), 再分
别以农大3338 DNA和分蘖节cDNA为模板进行PCR
扩增, 反应总体积为20 μL, 包括反转录产物2 μL、
10 mmol L−1 dNTPs 0.4 μL、20 ng μL−1基因特异引物
2 μL、Taq DNA聚合酶1 U。PCR扩增程序为94 5 ℃ min;
94℃ 1 min, 63℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 35个循环; 最
后72 5 min℃ 。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳后,
将目标片段进行回收、克隆和测序。根据RT-PCR产
物的测序结果 , 设计 5′和 3′RACE引物 (表 1), 用
5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒和3′-Full RACE
Core Set with PrimeScript RTase (TaKaRa)进行全长
cDNA的克隆。同源进化分析采用ClustalX软件。
1.4 基因表达模式的分析
取农大3338分蘖盛期的叶片、根、分蘖节、授
粉后12 d的种子、苗期、开花期和衰老期的叶片, 提
取RNA并反转录。同时取苗期农大3338幼苗进行胁
迫处理, 提取RNA并反转录。以β-actin为内标基因进
行半定量RT-PCR分析, 引物序列见表1。反应总体积为
20 μL, 包括反转录产物2 μL、10×buffer 2 μL、10 mmol L−1
dNTPs 0.4 μL、20 ng μL−1基因特异引物(P1-L和
P1-R) 2 μL、Taq DNA聚合酶1 U。PCR扩增程序为
94 , 5 min; 94℃ ℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 25
个循环; 最后72℃延伸5 min。设3个生物学重复。
1.5 WRKY转录因子的亚细胞定位
为设计引物构建融合表达载体 , 在WRKY基因
特异引物上游和下游分别引入EcoR I与Hind III的酶
切位点(P2-L和P2-R, 表1), 从农大3338分蘖盛期叶
片cDNA中扩增出带有以上酶切位点的ORF片段 ,
将片段从琼脂糖胶回收后连接到T-easy (TaKaRa)载
体上, 然后以EcoR I和Hind III对连接载体进行双酶
切, 凝胶电泳后回收片段与同样双酶切后线性化的
pEGAD载体(由中国农业大学生物学院巩志忠教授
提供)连接, 获得绿色荧光蛋白与目的基因的融合蛋
白表达载体。
取一块长、宽大约4 cm的洋葱幼嫩表皮, 在固
体MS培养基上22℃培养3~4 h。采用PDS-1000/He基
因枪 (Bio-Rad)轰击洋葱表皮细胞 , 可裂膜压力为
1100 psi, 轰击距离约为5 cm。轰击的洋葱表皮细胞
于22℃培养箱中培养14~16 h, 于激光共聚焦显微镜
下(Leica, TCS SP2)观察GFP的表达定位。
1.6 拟南芥超表达载体构建和转化
在WRKY基因特异引物的两端引入酶切位点
(Xba I和Kpn I)(P3-L和P3-R, 表1), 用于构建超表达
1946 作 物 学 报 第 39卷


表 1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
引物序列
Sequence information (5′−3′)
用途
Purpose
P1-F ACTCCATTTCCGATCGGTCGATT 基因克隆
P1-R AAGAACTGTCCCACACGTCAGACAAG Gene Cloning
3′GSP-1 CATCGAGGTGCACGACGATTTC 扩增全长基因所用的 3′RACE 引物
3′GSP-2 CTACTGTACGGGCCCATGTTCTTC 3′RACE primers for amplifying the full length of the gene
3′AP CTGATCTAGAGGTACCGGATCC
3′RACE CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTT
5′GSP-1 AGGAGTAGGTGATGAGCAC 扩增全长基因所用的 5′RACE 引物
5′GSP-2 CCTTCGAGCTACTGCACCTGTAG 5′RACE primers for amplifying the full length of the gene
5′GSP-3 GTCCATGCAACACGATCGGAG
5′AAP GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG
5′AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC
β-actin-F CAGCAACTGGGATGATATGG 内标对照
β-actin-R ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT Reference gene as control
P2-F CCGGAATTCATGGACGGCGAGTGGAGC 亚细胞定位所用引物
P2-R CCCAAGCTTGCTCACGTCATGGCAGTGC Primers for subcellular location
P3-F TGCTCTAGACATGGACGGCGAGTGGAG 超表达所用引物
P3-R CGGGGTACCGCTCACGTCATGGCAGTGC Primers for overexpression

载体。将扩增得到的片段从凝胶电泳回收后 , 与
T-easy载体连接, 然后用Xba I和Kpn I双酶切, 凝胶
电泳后回收片段与同样双酶切后线性化的
PCAMBIA Super1300载体(载体由中国农业大学生
物学院巩志忠教授提供)相连接, 获得超表达载体。
将超表达载体进行农杆菌转化 (农杆菌菌株为
GV3101, 由中国农业大学生物学院巩志忠教授提
供), 得到的阳性菌液采用蘸花法侵染拟南芥野生型
植株(种子由中国农业大学生物学院巩志忠教授提
供), 收获成熟T0代种子。T0代种子经消毒后, 点播在
MS选择培养板上(30 mg L−1潮霉素)。4℃下春化3 d
后, 移入光照培养箱中(22℃恒温, 24 h光照, 光强
30~40 µmol m−2 s−1)。10 d后挑选真叶健康并呈深绿
色, 根伸长至培养基中的转化体。将转化体幼苗移
入土中(营养土体积∶蛭石体积=1∶1), 至收获T1代
种子。经卡方检测, 筛选出符合3∶1分离比例的T1
代种子; 种植该T1代种子, 获得T2代纯系种子。
为检测转基因株系中WRKY基因插入片段的拷
贝数 , 剪取3个转基因株系叶片 , 提取DNA后进行
Southern blot分析, 野生型叶片作为对照。使用EcoR
I和Kpn I双酶切基因组DNA,在含有TAE缓冲液的
0.8% (W/V)琼脂糖胶中电泳, 将DNA片段转移到尼
龙膜上, 用α−32P-dCTP标记的WRKY基因PCR扩增片
段为探针进行杂交,最后经过放射显影。同时, 提取3
个转基因株系和野生型叶片RNA后进行反转录, 用
RT-PCR方法检测WRKY基因在转基因株系中是否正
常表达, 检测引物同WRKY基因表达引物。
1.7 拟南芥超表达株系与野生型表型及抗逆性
分析
将转小麦WRKY基因的拟南芥T2代幼苗移栽到
土中, 生长16 d后取完全展开的第3叶片, 剪成约1 cm2
的小段, 煮沸10 min, 倒弃上清液; 转至95%乙醇中,
煮沸约1 h至组织完全脱色; 迅速将已褪色的材料置
预先加热至96℃的85%乳酸中, 约8 min后可观察到
透明组织; 将已透明的材料转移至室温乳酸中, 取表
皮细胞制片, 于倒置显微镜(Olympus, IX71)下拍照。
对拟南芥超表达株系与野生型进行抗逆性分析,
选取在温室中MS培养基上竖直萌发5 d后的幼苗(16 h
昼/8 h夜, 22 , ℃ 相对湿度40%), 待根长约2 cm时在
无菌条件下移至分别加有甘露醇(400 mmol L−1)、
NaCl (100 mmol L−1)和ABA (30 µmol L−1)的MS培养
基平板上, 观察转基因植株和野生型在逆境胁迫下
的表型差异。
2 结果与分析
2.1 TaWRKY44的全长 cDNA克隆
采用电子克隆方法获得含有完整ORF的小麦
WRKY新基因, 其特异引物扩增产物长度约为900 bp。
第 11期 王 瑞等: 小麦 TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1947


扩增产物经克隆测序后发现ORF长度为897 bp, 编
码298个氨基酸, 将该基因命名为TaWRKY44。利用
RACE方法克隆了3′和5′非翻译区(UTR)的序列 , 长
度分别为312 bp和178 bp。将RT-PCR与RACE序列进
行拼接获得一条长度为1397 bp的全长cDNA。
氨基酸序列分析表明 , TaWRKY44基因编码的
蛋白具有典型的WRKY结构域及C2H2锌指结构
(图1-A)。TaWRKY44与水稻OsWRKY13和OsWRK-
Y14及拟南芥AtWRKY65和AtWRKY69归为一个小
的类群(图1-B)。
基因组序列分析结果显示 , TaWRKY44编码区
内仅含有一个内含子 , 长度为184 bp。在拟南芥中 ,
WRKY家族基因的内含子位置高度保守 , 可以分
为两种类型 , 一种是位于编码R的位点 , 在密码子

图 1 TaWRKY44系统进化树
Fig. 1 Phytogenic tree of TaWRKY44
A图中, 星号(*)表示 WRKY保守氨基酸残基。
Asterisks in panel A show the conserved amino acid residues.
1948 作 物 学 报 第 39卷


AGG中的2个GG之间剪接 , 称为R型内含子 ; 另一
种内含子在编码V (缬氨酸)的位点前剪接 , V位于
锌指结构C2H2的第2个C (半胱氨酸 )之后的第6个
位点 , 称为V型内含子 [2]。分析发现 , TaWRKY44的
内含子位于氨基酸R的位点 , 所以属于R型内含子
(图2)。


图 2 TaWRKY44基因组内含子位置
Fig. 2 Intron site of TaWRKY44
方框表示 WRKY保守结构域。Box represents conserved WRKY domain.

2.2 TaWRKY44基因的表达模式分析
该基因在小麦分蘖盛期的叶片中表达较高, 在
根和分蘖节中相对偏低, 在授粉后12 d的种子中没
有表达(图3-A)。以不同发育时期的叶片为材料研究
发现, TaWRKY44基因在苗期和开花期叶片中表达水
平明显低于衰老期叶片(图3-B)。另外, TaWRKY44在
低温胁迫30 min时表达显著上调, 而到60 min时则
下调表达(图3-C); 干旱胁迫处理4 h时TaWRKY44表
达明显上调(图3-D)。但是该基因在高温(40 )℃ 和高
盐(10% NaCl)条件下表达模式与对照相比并未发生
明显变化。


图 3 TaWRKY44的组织表达特异性(A)叶片表达模式(B)及低温
(C)和干旱胁迫(D)表达响应
Fig. 3 Tissue-specific expression of TaWRKY44(A) expression
patterns of leaves (B) and low temperature (C) and drought
stress (D) expression in response
1: 授粉后 12 d的种子; 2: 分蘖盛期的分蘖节; 3: 分蘖盛期的分
蘖叶; 4: 分蘖盛期的分蘖根。5: 幼叶; 6: 开花期叶片; 7: 衰老叶
片。8: 室温 (30 min); 9: 3 (30 min);℃ 10: 室温 (60 min); 11: 3 ℃
(60 min)。12: H2O (2 h); 13: 20% PEG (2 h); 14: H2O (4 h); 15:
20%PEG (4 h)。
1: seeds of 12 days after pollination; 2: inter-node at tillering stage;
3: leaves at tillering stage; 4: root at tillering stage. 5: young leaves;
6: leaves at flowing stage; 7: aged leaves. 8: room temperature for
30 min; 9: 3 °C for 30 min; 10: room temperature for 60 min; 11: 3 °C
for 60 min. 12: H2O for 2 h; 13: 20% PEG treatment for 2 h; 14:
H2O for 4 h; 15: 20% PEG for 4 h.

2.3 TaWRKY44蛋白的亚细胞定位
对TaWRKY44基因亚细胞定位融合载体用基因
枪轰击法转入洋葱表皮细胞, 用pEGAD表达载体作
为对照。经过培养后, 在激光共聚焦显微镜下观察,
显示对照GFP蛋白可以在整个细胞中见到比较均一
的明亮的绿色荧光 (图 4-a, b, c), 而 pEGAD-
TaWRKY44融合蛋白则位于细胞核中(图4-d, e), 说
明TaWRKY44蛋白是核定位的转录因子。


图 4 TaWRKY44蛋白亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular localization of TaWRKY44 protein
GFP: pEGAD载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达在暗场(a)、明
场(b)和暗场、明场叠加(c)观察。
TaWRKY44:GFP: pEGAD-TaWRKY44融合表达载体在洋葱表皮
细胞中的瞬时表达暗场(d)、明场(e)和暗场、明场叠加(f)观察。
GFP: images of green fluorescence GFP of pEGAD vector in onion
epidermal cells under dark-field (a)、bright-field (b) and overlapped
field (c). TaWRKY44:GFP: images of green fluorescence GFP of
pEGAD-TaWRKY44 vector in onion epidermal cells under
dark-field (d)、bright-field (e) and overlapped field (f).

2.4 TaWRKY44 拟南芥超表达株系的分析及其
与野生型的比较
为分析TaWRKY44转录因子基因的功能 , 构建
了TaWRKY44的拟南芥超表达载体, 并获得5个超表
达后代纯系。对其中3个 (35S:TaWRKY44-4、35S:
TaWRKY44-12 和 35S:TaWRKY44-16) 进 行 Southern
blot鉴定 , 发现转基因株系都含有一个目的基因拷
贝 , 说明TaWRKY44基因已经整合到拟南芥基因组
中 (图5-A)。RT-PCR表达分析结果表明 , 3个转基
因株系中都检测到外源目的基因的表达 , 而野生
型对照则无相应的扩增产物 , 说明TaWRKY44在
这些转基因植株中正常表达 , 并没有发生基因沉
默(图5-B)。
第 11期 王 瑞等: 小麦 TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1949




图 5 35S:TaWRKY44转基因株系的 Southern blot (A)和
RT-PCR (B)
Fig. 5 Analysis of 35S:TaWRKY44 transgenic lines
WT: wild type; 1: 35S:TaWRKY44-4; 2: 35S:TaWRKY44-12;
3: 35S:TaWRKY44-16.

与野生型相比 , TaWRKY44超表达拟南芥植株
的叶片变小且叶柄缩短(图6)。细胞学观察结果表
明, 超表达株系35S:TaWRKY44-4、35S:TaWRKY44-12
和 35S:TaWRKY44-16叶片表皮细胞大小分别为
1502、1660和1997 µm2, 分别比野生型低49.5%、
44.1%和32.8% (图7), 说明超表达株系中的叶片细
胞明显变小。
甘露醇、NaCl和ABA逆境处理3 d后, 在添加
ABA的MS培养基上 , 转基因植株的两片子叶已经
完全变白, 真叶也逐渐开始失绿白化, 而野生型植
株叶片除子叶颜色开始变白外, 其余的保持正常绿
色(图8-B); 在添加甘露醇的MS培养基上, 转基因植
株的2片子叶已经完全黄化, 而WT植株的子叶颜色
刚开始呈现变黄的趋势(图8-C); 在高盐NaCl处理条
件下, 转基因植株顶端生长点处已经出现明显的褐
化, 心叶逐渐死亡, 而WT植株还未出现顶端褐化的
现象(图8-D)。
3 讨论
WRKY转录因子是近年来研究较为广泛的植物
转录因子基因。在许多植物中克隆了WRKY基因, 并
对其功能进行了深入研究。近年来, Wu等[5]和Niu等[4]
分别在小麦中克隆了15个和43个WRKY基因, 并在拟
南芥中进行了功能验证。在本研究中, 我们克隆了一
个新的小麦WRKY基因, 命名为TaWRKY44, 其所编
码蛋白与水稻OsWRKY14同源性最高。该基因受干
旱诱导表达 , 并且在衰老的叶片中表达水平升高 ,
说明该基因可能参与了小麦逆境胁迫响应及叶片衰
老过程。
叶片大小是植物形态的一个重要特征, 是由细
胞数目和细胞大小相互协调的结果。在模式植物拟
南芥中, 一些控制叶片细胞大小的关键基因最近相
继被克隆和鉴定出来。例如, AtEXP10、ROTUND-
IFOLIA 3 (ROT3)、ANGUSTIFOLIA(AN)和ARGOS-
LIKE(ARL)通过促进细胞的伸长来调节器官发育[11-16]。


图 6 35S:TaWRKY44转基因株系和野生型叶片表型及叶片表面积统计
Fig. 6 Leaf area of 35S:TaWRKY44 transgenic lines and WT with their phenotype
WT: wild type; 1: 35S:TaWRKY44-4; 2: 35S:TaWRKY44-12; 3: 35S:TaWRKY44-16.
1950 作 物 学 报 第 39卷



图 7 35S:TaWRKY44转基因株系和野生型叶片细胞观察
Fig. 7 Leaf epidermis cell size of 35S:TaWRKY44 transgenic
lines and WT with microscopic view
WT: wild type; 1: 35S:TaWRKY44-4; 2: 35S:TaWRKY44-12;
3: 35S:TaWRKY44-16.


图 8 35S:TaWRKY44转基因株系和野生型(WT)胁迫处理后的表型
Fig. 8 Phenotype of 35S:TaWRKY44 transgenic lines and WT
under different stresses
A: MS培养基; B: ABA处理(30 µmol L−1); C: 甘露醇处理(400
mmol L−1); D: NaCl (100 mmol L−1)处理。
A: MS medium; B: MS+ABA (30 µmol L−1); C: MS+mennitol (400
mmol L−1); D: MS+NaCl (100 mmol L−1).

但是, BIGPETALp (BPEp)和RPT2a通过限制细胞的
伸长来控制器官生长[17-19]。在本研究中, TaWRKY44
基因的拟南芥超表达株系叶片变小及叶柄缩短 ,
并且细胞也明显小于野生型 , 说明该基因主要通
过调控细胞大小来影响叶片发育。进一步的研究
重点是深入解析该基因调控叶片发育的分子机制,
目前, 我们已建立超表达株系和野生型叶片转录组
差异表达谱, 筛选出一些候选下游基因, 正在进行功
能鉴定。
同源进化聚类结果显示, TaWRKY44与水稻的
OsWRKY13、OsWRKY14及拟南芥的AtWRKY65和
AtWRKY69归为一个小的类群。在水稻中 , OsW-
RKY13通过调控水杨酸和茉莉酸依赖的防御相关基
因提高抗病性[20]。OsWRKY14可能在MeOH诱导的Trp
及其次生衍生物的生物合成中发挥关键调节作用[21]。
迄今为止 , 拟南芥的AtWRKY65和AtWRKY69基因的
功能研究尚未见报道。我们发现TaWRKY44基因的拟
南芥超表达株系叶片明显变小, 并且对ABA、甘露醇
以及高盐处理更为敏感。我们推测TaWRKY44可能与
水稻的同源基因OsWRKY13和OsWRKY14在功能上存
在分化, 但需要进一步的实验证据。
4 结论
获得了 TaWRKY44 基因, 编码 Group II 型核定
位 WRKY转录因子。超表达拟南芥植株表现出叶片
变小、叶片细胞变小的现象, 并且对 ABA、甘露醇
以及盐胁迫处理更为敏感。
References
[1] Rushton P J, Macdonald H, Huttly A K, Lazarus C M, Hooley R.
Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a
conserved cis-element in the promoters of alpha-AMY2 genes.
Plant Mol Biol, 1995, 29: 691–702
[2] Wu K L, Guo Z J, Wang H H, Li J. The WRKY family of
transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins.
DNA Res, 2005, 12: 9–26
[3] Wei K F, Chen J, Chen Y F, Wu L J, Xie D X. Molecular
phylogenetic and expression analysis of the complete WRKY
transcription factor family in maize. DNA Res, 2012, pp. 1–12
[4] Niu C F, Wei W, Zhou Q Y, Tian A G, Hao Y J, Zhang W K, Ma B,
Lin Q, Zhang Z B, Zhang J S, Chen S Y. Wheat WRKY genes
TaWRKY2 and TaWRKY19 regulate abiotic stress tolerance in
transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell Environ, 2012, 35:
1156–1170
[5] Wu H, Ni Z, Yao Y, Guo G, Sun Q. Cloning and expression
profiles of 15 genes encoding WRKY transcription factor in wheat
(Triticum aestivem L.). Prog Nat Sci, 2008, 18: 697–705
[6] Mare C, Mazzucotelli E, Crosatti C, Francia E, Stanca A M,
Cattivelli L. Hv-WRKY38: a new transcription factor involved in
cold- and drought-response in barley. Plant Mol Biol, 2004, 55:
399–416
[7] Hu Y, Chen L, Wang H, Zhang L, Wang F, Yu D. Arabidopsis
transcription factor WRKY8 functions antagonistically with its
interacting partner VQ9 to modulate salinity stress tolerance.
Plant J, 2013, DOI: 10.1111/tpj.12159
[8] Xu Y H, Wang J W, Wang S, Wang J Y, Chen X Y.
Characterization of GaWRKY1, a cotton transcription factor that
regulates the sesquiterpene synthase gene (+)-delta-cadinene
synthase-A. Plant Physiol, 2004, 135: 507–515
第 11期 王 瑞等: 小麦 TaWRKY44基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1951


[9] Hinderhofer K, Zentgraf U. Identification of a transcription factor
specifically expressed at the onset of leaf senescence. Planta,
2001, 213: 469–473
[10] Robatzek S, Somssich I E. A new member of the Arabidopsis
WRKY transcription factor family, AtWRKY6, is associated with
both senescence- and defence-related processes. Plant J, 2001, 28:
123–133
[11] Tsuge T, Tsukaya H, Uchimiya H. Two independent and polarized
processes of cell elongation regulate leaf blade expansion in
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Development, 1996, 122:
1589–1600
[12] Kim G T, Tsukaya H, Uchimiya H. The ROTUNDIFOLIA3 gene
of Arabidopsis thaliana encodes a new member of the
cytochrome P-450 family that is required for the regulated polar
elongation of leaf cells. Genes Dev, 1998, 12: 2381–2391
[13] Kim G T, Tsukaya H, Saito Y, Uchimiya H. Changes in the shapes
of leaves and flowers upon overexpression of cytochrome P450
in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 9433–9437
[14] Cho H T, Cosgrove D J. Altered expression of expansin
modulates leaf growth and pedicel abscission in Arabidopsis
thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 9783–9788
[15] Kim G T, Shoda K, Tsuge T, Cho K H, Uchimiya H, Yokoyama R,
Nishitani K, Tsukaya H. The ANGUSTIFOLIA gene of
Arabidopsis, a plant CtBP gene, regulates leaf-cell expansion, the
arrangement of cortical microtubules in leaf cells and expression
of a gene involved in cell-wall formation. EMBO J, 2002, 21:
1267–1279
[16] Hu Y, Poh H M, Chua N H. The Arabidopsis ARGOS-LIKE gene
regulates cell expansion during organ growth. Plant J, 2006, 7:
1–9
[17] Szecsi J, Joly C, Bordji K, Varaud E, Cock J M, Dumas C,
Bendahmane M. BIGPETALp, a bHLH transcription factor is
involved in the control of Arabidopsis petal size. EMBO J,
2006, 5: 3912–3920
[18] Kurepa J, Wang S, Li Y, Zaitlin D, Pierce A J, Smalle J A. Loss of
26S proteasome function leads to increased cell size and
decreased cell number in Arabidopsis shoot organs. Plant Physiol,
2009, 150: 178–189
[19] Sonoda Y, Sako K, Maki Y, Yamazaki N, Yamamoto H, Ikeda
A, Yamaguchi J. Regulation of leaf organ size by the Arabidopsis
RPT2a 19S proteasome subunit. Plant J, 2009, 60: 68–78
[20] Qiu D, Xiao J, Ding X, Xiong M, Cai M, Cao Y, Li X, Xu C,
Wang S. OsWRKY13 mediates rice disease resistance by
regulating defense-related genes in salicylate-and jasmonate-
dependent signaling. Mol Plant Microbe Interact, 2007, 20:
492–499
[21] Kang K, Park S, Natsagdorj U, Kim Y S, Back K. Methanol is an
endogenous elicitor molecule for the synthesis of tryptophan and
tryptophan-derived secondary metabolites upon senescence of
detached rice leaves. Plant J, 2011, 66: 247–257

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