全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(2): 190200 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家公益性行业(农业)科研专项经费项目(201403064), 国家自然科学基金项目(31360190)和国家现代农业产业技术体系建设
专项(CARS-22)资助。
This study was supported by China Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201403064), the National Natural Sci-
ence Foundation of China (31360190), and the China Agriculture Research System (CARS-22).
* 通讯作者(Corresponding author): 余茂德, E-mail: yumd@163.com, Tel: 023-68250191
第一作者联系方式: E-mail: lmj0929xjj@126.com, Tel: 18306031717
Received(收稿日期): 2015-06-11; Accepted(接受日期): 2015-09-06; Published online(网络出版日期): 2015-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151008.1403.024.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00190
果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析
李孟娇 吕蕊花 余 建 蔡雨翔 王传宏 赵爱春 鲁 成 余茂德*
西南大学生物技术学院, 重庆 400716
摘 要: 多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)是一种细胞壁结构蛋白, 可以催化果胶分子多聚 α-(1,4)-聚半乳糖
醛酸的裂解, 使细胞壁结构解体, 导致果实软化。本文采用 qRT-PCR 方法, 分析不同生长阶段菌丝侵染的油菜叶片
中多聚半乳糖醛酸酶基因的表达模式。结果表明: (1)采用 RT-PCR从果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)菌核中扩
增多聚半乳糖醛酸酶基因 cDNA, 其全长为 1143 bp, 命名为 CsPG1 (GenBank登录号为 KR296662), 编码 380个氨基
酸残基。根据侵染油菜叶片的表达量, 确认 CsPG1为基因家族的主效基因; (2)将 CsPG1基因连接 pET28a(+)载体并
转化大肠杆菌 E. coli BL21 (DE3), 获得包涵体形式, 但对底物(聚半乳糖醛酸)没有活性的蛋白; (3)最适CsPG1包涵体
溶解的尿素浓度 6 mol L–1, 采用缓慢稀释低温复性的方法对重组蛋白 CsPG1进行了重折叠复性试验, 经高亲和力的
Ni-NTA树脂纯化后为得到单一条带, 获得可溶性蛋白, 复性后的多聚半乳糖醛酸酶比活力为 5.02 U mg–1; (4)生物试
验表明, CsPG1蛋白能够加速嘉陵 40 (Morus atropurpurea Roxb.)桑椹的成熟和软化, 推测该蛋白与肥大性菌核病菌
对桑椹的侵染有关。这一结果揭示了不同果桑品种对菌核病敏感性的差异, 为果桑生产中菌核病的防控提供了分子
证据。
关键词: 果桑; 肥大性菌核病菌; CsPG1; 蛋白表达活性
Cloning and Functional Analysis of Polygalacturonase Genes from Ciboria
shiraiana
LI Meng-Jiao, LÜ Rui-Hua, YU Jian, CAI Yu-Xiang, WANG Chuan-Hong, ZHAO Ai-Chun, LU Cheng, and
YU Mao-De*
College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: Polygalacturonase (PG) is a kind of cell wall structural proteins that can catalyes the decompocition of alpha-
(1,4)-polymer of galacturonia acid, which makes the cell wall structure disintegration and fruit softening. In the paper, we ana-
lyzed the expression patterns of PG genes in the leaf infection by the hypha of C. shiraiana at different growth stages by using
qRT-PCR methods. The results showed that the cDNA of CsPG1 gene was amplified from the sclerotia of C. shiraiana by
RT-PCR, namely CsPG1 (GenBank accession number: KR296662) with 1143 bp of full length, encoding 380 amino acid residues.
On the basis of the highest level of gene expression in the process of infecting rape leaf, the main gene of the CsPG gene family
was confirmed. CsPG1 was cloned into pET-28a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant CsPG1 protein
was expressed in the form of inclusion bodies without activity towards polygalaturonic acid. The optimal urea concentration for
dissolving CsPG1 inclusion bodies was 6 mol L–1, CsPG1was renaturated by dilution gradiently at low temperature. We sorted out
single band after purified by High-Affinity Ni-NTA Resin, and obtained soluble protein. The specific activity of renatured CsPG1
was 5.02 U mg–1. The result of biological test showed that the recombinant protein accelerated the fruit maturity and softening of
Jialing 40 (Morus atropurpurea Roxb.). Therefor, we speculated that the CsPG1 protein is related to the infection of C. shiraiana
to mulberry fruits. The result reveals the sensitivity difference among mulberry varieties to sclerotial disease, providing the
第 2期 李孟娇等: 果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析 191
molecular evidence for preventing and controlling the sclerotial disease in mulberry cultivation.
Keywords: Mulberry; Ciboria shiraiana; CsPG1; Protein expression activity
果胶酶是参与果胶降解的一组复合细胞壁降解
酶, 能将高等植物的初生细胞壁和中胶层的果胶多
聚物降解成聚合度逐步减低的寡聚半乳糖醛酸链和
半乳糖醛酸单体[1]。根据果胶酶的作用底物和方式
不同, 可将果胶酶分为果胶水解酶、果胶裂解酶、
果胶酯酶和原果胶酶[2]。多聚半乳糖醛酸酶(polyga-
lacturonase, PG) 是果胶水解酶类的一种, 可以降解
植物细胞壁中的果胶, 破坏细胞的完整性, 从而为
病原菌的生长和发育提供大量的营养物质 [3-4]。
Claudia 等[5]认为 PG 是通过降解植物细胞壁中同源
的多聚半乳糖醛酸区域起作用, 产生真菌的致病性
和毒性, 从而引起组织溶解和原生质体死亡。
PG 的多基因家族成员在植物发育不同阶段和
不同组织中的表达量不同, PG 能促进果实软化, 硬
度下降, 已在番茄[6-7]、桃[8]、猕猴桃[9]、鳄梨[10-11]、
草莓[12-13]等果实成熟过程中得到验证。同时与器官
脱落[14]、豆荚和花药裂开[15]、花粉粒成熟和花粉管
生长有关[16]。因此, PG一直是学者研究植物果实发
育和成熟衰老的热点。
果桑肥大性菌核病菌感染桑椹时会产生大量的
纤维素酶, 分解细胞壁中的纤维素等 [17], 推测果胶
酶中的 PGs能够分解桑椹细胞壁的多聚 α-(1,4)-聚半
乳糖醛酸, 生成 D(+)半乳糖醛酸。肥大性菌核病菌
能够吸收桑椹中分解了的小分子营养物质, 为自身
生长发育与侵染桑椹提供良好的营养源。本研究以
果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)为材料, 从
Sclerotinia sclerotiorum 数据库信息入手, 克隆果桑
肥大性菌核病菌的 PG 家族基因(CsPG), 并研究其
主效基因的生物功能, 旨在为探索果桑肥大性菌核
病菌的致病机制提供分子生物学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraian, 中国典
型培养物保藏中心编号: CCTCCAF 2014019)由本实
验室分离、鉴定并保存。大肠杆菌菌株 DH5α、
BL21(DE3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
pET28a(+)载体为本实验室保存 , T/A 克隆载体
pMD19-T simple vector 购自宝生物工程(大连)有限
公司。T4 DNA连接酶、限制性内切酶 EcoR I、Hind
III、Taq DNA聚合酶、RNAiso Plus试剂盒、反转录
酶 M-MLV、蛋白质 Maker均购自宝生物工程(大连)
有限公司; 胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自
Omega公司; Ni-NTA亲和树脂购自南京金斯瑞生物
科技有限公司。牛血清白蛋白(BSA)购自生工生物工
程有限公司; 其他试剂均为国产分析纯。果实硬度
计(型号 GY-2)购自上海思为仪器制造有限公司。
接种油菜所用品种为中双 10 号, 在 GXZ 智能
光照培养箱内培养。接种果桑所用品种为嘉陵 40 (重
庆市审定桑树品种), 种植于西南大学桑树资源圃。
1.2 CsPG家族基因的克隆
利用已公布物种的多聚半乳糖醛酸酶基因序列,
在 Sclerotinia sclerotiorum数据库中比对分析, 获得
多聚半乳糖醛酸酶基因序列。对所获序列进一步鉴
定, 获得 6 条 PGs, 即 AF501307.1、AF501308.1、
AY496277.1、AY312510.1、AY312511.1、AY312512.1。
利用 Primer 5.0设计引物(表 1), 引物由南京金斯瑞
公司合成。以 C. shiraian菌核为材料, 按照 TaKaRa
说明书反转录得到的 cDNA 为模板进行扩增。PCR
产物经电泳检测后回收, 与 pMD19-T simple vector
载体连接并转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 将阳
性单克隆送北京六合华大基因有限公司测序。
1.3 果桑肥大性菌核病菌侵染不同时期 PG 基因
的表达量分析
待油菜长到 6~8 片真叶时, 取生长一致的油菜
叶片, 按照方中达[18 ]、吕蕊花等[19]方法其表面消毒,
用灭菌的牙签轻轻刺伤表面, 然后在受伤部位接种
生长旺盛的 C. shiraian的菌丝块, 置灭菌培养皿中,
每个处理重复 3 次, 移入培养箱(25℃恒温, 相对湿
度 90%), 每 24 h取一次样, 分别收集 C. shiraian的
菌核、菌核萌发产生的子实体, 以及在查彼培养液
培养 5 d 产生的菌丝。以果桑肥大性菌核病菌
β-tubulin 为内参基因 [17] , 设计引物 (表 1), 参照
TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex Taq试剂盒操作说
明书进行 Real-time PCR 分析, 反应体系为 20 μL,
每个引物最终浓度为 400 nmol L–1, 热启动程序为
95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 共 40个循环。分别
提 RNA进行 qRT-PCR测定, 每个样品设 3次重复取
其平均值, 试验于 Step OnePlus Real-time PCR 仪
(ABI 公司)上进行, 将获得的数据采用 2–ΔΔCt法进行
192 作 物 学 报 第 42卷
基因相对表达量[20]。对定量结果进行分析, 选取表
达量最高的为主效基因 , 命名为 CsPG1, 使用
ExPasy 在线工具 ProtParam (http://web.expasy.org/
protparam/)预测该主效基因编码氨基酸的基本理化
性质, 使用 ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)
分析亲水性与疏水性, 使用 SignalP (http: //www.cbs.
dtu.dk/services/)预测蛋白质信号肽, 使用 NetNGlyc
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测蛋白
质糖基化位点。
1.4 CsPG1基因原核表达载体的构建及诱导
预测信号肽切割位点后, 将 CsPG1 基因成熟肽
cDNA片段链接到表达载体 pET28a(+)中构建融合表
达载体。根据所克隆的 CsPG1的序列以及原核表达
载体 pET28a(+)多克隆位点序列, 设计 1对引物, 其
画线处为分别 EcoR I、Hind III酶切位点(表 1), 用
EcoR I和 Hind III双酶切 PCR产物和 pET28a(+)质
粒, 分别回收目的片段, 二者经 T4 DNA 连接酶连
接后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 随机挑取抗
性克隆, 然后将 PCR 及双酶切鉴定后的阳性克隆送
南京金斯瑞生物科技有限公司测序, 将测序正确的
重组表达载体命名为 pET28a(+)-CsPG1。
将鉴定正确的含有 pET28a(+)-CsPG1 的阳性克
隆子扩大培养后提取质粒, 质粒经热激转化 E. coli
BL21 (DE3), 涂布于含卡那霉素的 LB平板上。挑选
出 pET28a(+)-CsPG1/BL21 (DE3)阳性克隆的菌接种
于摇瓶生长至 OD600 = 0.6~0.8时, 加入终浓度为 0.4
mmol L–1的 IPTG, 在 28℃下诱导 5 h, 每小时取一次
样, 同时以诱导的 pET28a(+)空载菌株作为对照。以
SDS-PAGE分析菌株中蛋白质表达情况。
1.5 CsPG1包涵体的溶解
包涵体溶解程序是在 Schoner 等[21]设计的基础
上略有改进, 将诱导菌液在 4℃、13 225×g下离心 5
min 收集菌体 , 将菌体重悬于细胞裂解缓冲液
(Tris-HCl 50 mmol L–1, EDTA 1 mmol L–1, NaCl 100
mmol L–1, pH 8.0)中。将菌悬液进行超声波破碎, 破
碎条件为 Amplitude 37%, 破碎 2 s, 停 3 s, 共 10
min。15 521×g离心 20 min。弃去上清液, 沉淀依次
重悬于 1 mL含 2、4、6和 8 mol L–1尿素的包涵体
溶解缓冲液(Tris-HCl 50 mmol L–1, EDTA 1 mmol L–1,
NaCl 100 mmol L–1, β-巯基乙醇 1%, pH 8.0, 加入不
同浓度的尿素, 缓冲液现用现配[22])中, 在 37℃摇床
温育 30 min后, 15 521×g离心 15 min。各取适量上
清液进行 SDS-PAGE 分析, 确认溶解效果最佳的尿
素浓度。
1.6 CsPG1包涵体复性及纯化
采用稀释法对溶解的 CsPG1包涵体进行复性。
采用 1.5 中筛选得到的最适尿素浓度充分溶解包涵
体沉淀。4℃、15 521×g离心 15 min, 上清液中缓慢
加入稀释复性缓冲液(Tris-HCl 50 mmol L–1, 甘油
10%, NaCl 0.5 mmol L–1, 0.4 mol L–1 L-Arg, pH 8.0)
进行稀释, 分别稀释 5、10、50、100、150 和 200
倍。将稀释酶液在 4℃静置 1 h进行充分复性。测定
表 1 引物编号与序列
Table 1 List of primers and their sequences
引物编号
Primer name
引物序列
Primer sequence (5–3)
引物编号
Primer name
引物序列
Primer sequence (5–3)
AF501307.1-F ATGGTTCACATTCTTTCCTC AF501308.1-qF ATGCTGCCAGTGGTACTTTG
AF501307.1-R TTAACACTTGACACCAGATG AF501308.1-qR ACAGCTACGCAGTCATCCTG
AF501308.1-F ATGCATAGAGACTTTTCCAT AY496277.1-qF ACAACGCTAATGGGTTGACA
AF501308.1-R CTACTTAGGACAGCCGGTTG AY496277.1-qR GTGACACTGGTGCTGTCTCC
AY496277.1-F ATGGTTAACCTTTCTGCCCC AY312510.1-qF TGGAACCACTTCCGATGATA
AY496277.1-R CTACAAGGAGCAAGAGACGC AY312510.1-qR GAACCCTCTCCATCCCAGTA
AY312510.1-F ATGAAAATCAACAACCAACT AY312511.1-qF TTGAAGGCGGTGACAAGTAA
AY312510.1-R TTATGCAGGGCATCCAGAAG AY312511.1-qR TGCTGTTGGGTTTGAATGAT
AY312511.1-F ATGAATGGAGTTAATGGGGC AY312512.1-qF GAAGGCCATGGATTGATTAAG
AY312511.1-R CTAAACACAATTGATGCCCA AY312512.1-qR ACGGAACTGTGGTGTTTCTG
AY312512.1-F ATGAGATCTTTTCATCTCGC β-tubulin-qF TTGGATTTGCTCCTTTGACCAG
AY312512.1-R CTAATACAAATAACAAGACT β-tubulin-qR AGCGGCCATCATGTTCTTAGG
AF501307.1-qF CTTGCAGCAGTCGAGAAGAG CsPG1-EF CCGGAATTCAACGTTGCCGATGCTCTTGC
AF501307.1-qR AGTCAAGTCGAGGGTGGTTC CsPG1-HR CCAAGCTTACACTTGACACCAGATG
第 2期 李孟娇等: 果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析 193
每个稀释度的酶液酶活性且利用 Bradford 法测定重
组蛋白浓度。采用 Ni-NTA 亲和层析柱纯化参照金
斯瑞蛋白纯化试剂盒经过重折叠复性的 CsPG1蛋白
溶液。
1.7 CsPG1活性测定及功能检测
在 Lindsay[23]描述方法的基础上改进酶活性测
定方法, 利用 DNS法测定 PG的活性并以生成 D(+)
半乳糖醛酸的量来表示。取 0.5%的多聚半乳糖醛酸
溶液(用 100 mmol L–1 NaAc-HAc, pH 5.0的缓冲液配
制) 500 μL, 加 CsPG1 300 μL, 用 100 mmol L–1
NaAc缓冲液补齐 1 mL, 50℃水浴 0.5 h。然后加入
1 mL DNS 试剂, 沸水浴 5 min, 冷却后用水稀释至
5 mL, 在紫外分光光度计 540 nm波长下比色, 以不
加 CsPG1蛋白作对照, 记录其 A值。平行测定 3次
取其平均值在标准曲线上查出反应液中相当于 D-半
乳糖醛酸的毫克数。一个酶活性单位定义为在标准
反应条件下(pH 5.0, 50℃, 反应 30 min), 每分钟释
放 1 μg D-半乳糖醛酸所需要的酶量。
取嘉陵40红色转为紫色的桑椹分为相等数量的
试验组和对照组 , 试验组用毛笔刷沾取复性后的
CsPG1蛋白液, 均匀地涂于桑椹的表面, 5 min 后用
吹风机在冷风下吹干, 以沾取缓冲液的为对照组。
两组在相同条件下, 经0、12和24 h观察桑椹颜色的
变化。手握探头直径为2 mm的果实硬度计, 使硬度
计垂直于桑椹表面, 探头均匀压入桑椹内, 此时驱
动指针开始驱动, 指示指针同步旋转, 当探头压到
的深度为3 mm 处停止[24], 指示针指示的读数即为
桑椹的硬度, 取3次平均值。试验组和对照组均3次
重复。
2 结果与分析
2.1 CsPG家族基因的鉴定与生物信息学分析
利用生物信息学方法从 Sclerotinia sclerotiorum
数据库筛选得到了 6个CsPG相关基因, 其登录号分
别为 AF501307.1、AF501308.1、AY496277.1、AY312510.1、
AY312511.1、AY312512.1。根据生物信息学分析结
果, 我们从果 C. shiraian 菌核的 cDNA 进行 CsPG
家族基因克隆 , 试验结果如图 1 所示 , 进而预测
CsPG家族基因的序列特征, 结果如表 2所示。
2.2 CsPG家族基因的表达及主效基因的确定
从 Sclerotinia sclerotiorum 数据库获得的 CsPG
家族基因, 经 qRT-PCR 数据分析, 发现 AF501307.1
随着侵染时间的增加而表达量逐渐减少 , 但 C.
shiraian在不同生长阶段(图 2, A~C)及菌丝侵染油菜
的不同时间(图 2, D-H), 其表达量均高于其他 5个基
因; AF501308.1和 AY312510.1在 C. shiraian不同的
生长阶段及其菌丝侵染油菜不同的时间表达量均较
低, AY496277.1、AY312511.1和 AY312512.1的表达
量均偏低(图 3)。以 β-tubulin 内参基因作对照, C.
shiraian 的菌丝侵染油菜, 第 1 天侵染病斑不大, 但
AF501307.1的 CsPG表达量是对照的 12倍; 第 2天
侵染病斑的面积是第 1 天的 5 倍, 但 CsPG 表达量
图 1 CsPG家族基因 cDNA电泳鉴定图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of CsPG gene family cDNA
products
M: Trans 5000; 1: AF501307.1, 1143 bp; 2: AF501308.1, 1113 bp;
3: AY312510.1, 1560 bp; 4: AY312511.1, 786 bp; 5: AY312512.1,
555 bp; 6: AY496277.1, 1143 bp.
表 2 CsPG家族基因的序列特征预测
Table 2 Characteristics of the predicted CsPG gene family
GenBank登录号
GenBank accession number
CDS长度
CDS length (bp)
预测蛋白分子量
Theoretical MW (kD)a
编码氨基酸个数
Protein size
理论等电点
Theoretical pIb
AF501307.1 1143 37.70 381 6.93
AF501308.1 1113 38.03 371 6.27
AY496277.1 1143 37.94 381 4.55
AY312510.1 1560 52.28 520 6.18
AY312511.1 786 27.59 262 6.03
AY312512.1 555 20.56 185 6.79
a和 b Protparam软件在线预测结果。
a and b results of Protparam predicted online.
194 作 物 学 报 第 42卷
图 2 C. shiraiana各个生长阶段及其菌丝侵染油菜叶片(中双 10号)的情况
Fig. 2 Different development stages of C. shiraiana and the results of the myphae infection of rape leaf (Zhongshuang 10)
A: 菌核; B: 子实体; C: 菌丝; D: 菌丝侵染油菜第 1天; E: 菌丝侵染油菜第 2天; F: 菌丝侵染油菜第 3天; G: 菌丝侵染油菜第 4天;
H: 菌丝侵染油菜第 5天。
A: sclerotia; B: sporophore; C: myphae; D: 1st day of infection; E: 2nd day of infection; F: 3rd day of infection; G: 4th day of infection;
H: 5th day of infection.
图 3 CsPG基因家族的表达
Fig. 3 Relative expression level of CsPG gene family
是对照的 6 倍, 为第 1 天表达量的 50%, 第 3 天、
第 4 天、第 5 天的 CsPG 表达量逐渐减少, 油菜叶
片全部被感染时的表达量是对照的 2倍。以上结果
表明, C. shiraian 在不同的生长阶段以及菌丝侵染
油菜不同的时间中, AF501307.1的表达量均很高。
参照 Lü 等[17]果桑肥大性菌核病菌纤维素酶主效基
因的确定, 我们认为, AF501307.1 是 CsPG 家族的
主效基因。
2.3 CsPG1序列的获得与编码蛋白理化性质分析
以 C. shiraian 菌核的 cDNA 为模板 , 通过
RT-PCR扩增, 获得了大约 1000 bp的条带。将该片段
克隆到 pMD19-T simple vector 载体上, 测序结果表
明, 该序列全长 1143 bp, 含一个开放阅读框(ORF),
编码一个由 380 个氨基酸残基组成的蛋白质(图 4)。
在线软件预测该蛋白质的分子量 37.72 kD, 理论等电
点为 6.93, 分子式 C1638H2634N448O55S9, 带负电荷残基
第 2期 李孟娇等: 果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析 195
24 个, 带正电荷残基 24 个, 平均亲水性(GRAVY)
0.139, 不稳定指数为 21.54, 推测该蛋白属于稳定蛋
白。将该 cDNA及其推导的氨基酸序列在 NCBI网站
上进行 Blast 比对, 表明该 cDNA 及其推导的氨基酸
序列与已报道的 PG基因及其推导的氨基酸的序列同
源性最高。分析结果表明, 本研究所克隆片段为 C.
shiraian 的 PG 基因, 将其命名为 CsPG1, 并提交给
GenBank, 获得登录号为 KR296662。蛋白质疏水性分
析表明, 疏水性最大值为 2.633, 最小值为–2.400, 而
就整体来看, 疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,
且多于亲水性氨基酸。因此, 整个多肽链表现为疏水
性, 没有明显的亲水区域。预测分析发现存在 2个糖
基化位点, 分别在蛋白序列中第 314位和第 361位处,
其中第 361位是天冬氨酸 N-糖基化位点。
图 4 CsPG1 cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig. 4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CsPG1 cDNA
单下画线为信号肽; ATG 为起始密码子; TAA 为终止密码子; 粗体为参与二硫键形成的 Cys残基; 阴影部分为潜在的 N-糖基化位点。
Single underlines indicate the signal peptide; ATG indicates the start codon; TAA indicates the stop codon; the bold letters indicate the Cys
residues contributing to the formation of disulfide bond; dashed areas indicate the potential N-glycosylation sites.
196 作 物 学 报 第 42卷
2.4 CsPG1 编码氨基酸序列比对及分子进化关
系分析
利用BlastP在NCBI上进行比对, 利用MEGA4.0构
建系统进化树(图5), 结果表明, PG在整体上是趋异进
化, 进化树总体上是根据物种类型而聚类, 明显地划
分为细菌PG、真菌PG和植物PG类, 细菌PG位于树的
基部, 在进化地位上是最原始的类型, 其次是真菌和
植物PG, 结果符合生物起源进化的特证。CsPG1与
Botryotinia fuckeliana (灰葡萄孢霉)的PG基因有100%
的同源性, 与Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母)、
Aspergillus flavus (黄曲霉)、Penicillium digitatum (绿霉
菌 )、Aspergillus aculeatus (棘孢曲霉 )、Penicillium
expansum (青霉菌等真菌)的物种进化同源性较近。而
与Plant PGs和Bacterial PGs等物种进化同源性较远。
图 5 基于 NJ法构建的 CsPG1氨基酸序列系统进化树
Fig. 5 Phylogenic tree of CsPG1 amino acid sequence by Neighbor-Joining method
▲代表 CsPG1基因编码的氨基酸序列。▲ stands for amino acid sequence coded by CsPG1 gene.
2.5 CsPG1原核表达载体的构建和重组子鉴定
以 CsPG1-EF 和 CsPG1-HR 为引物, 克隆到一
条大约1000 bp 的条带(图6, 泳道1), 目的片段和
pET28a(+)分别经 EcoR I和 Hind III双酶切后, 连接
转化大肠杆菌, 挑选阳性克隆, 提质粒检测(图6, 泳
道2), 经 EcoR I 和 Hind III 对阳性质粒 pET28a-
CsPG1双酶切鉴定, 分别在1000 bp 和5000 bp 处出
现2条亮带(图6, 泳道3)。表明 CsPG1基因原核表达
载体 pET28a-CsPG1构建成功。
2.6 CsPG1在大肠杆菌 BL21中的异源表达
将重组表达载体 pET28a-CsPG1 转化大肠杆菌
BL21 (DE3)进行异源表达, 同时以含有 pET28a(+)
空载体的菌株作为对照。经 0.4 mmol L–1 IPTG诱导
表达后, 进行 SDS-PAGE 分析, 融合蛋白产生了一
条约 37.7 kD 的特异蛋白条带, 与理论分子质量一
图 6 pET28a-CsPG1双酶切鉴定图
Fig. 6 Agarose gel electrophoresis of the double enzyme
digestion of pET28a-CsPG1
M: DL2000 marker; 1: CsPG1基因的 PCR产物; 2: pET28a-CsPG1
载体; 3: pET28a-CsPG1双酶切产物。
M: DL2000 marker; 1: PCR product of CsPG1 gene;
2: pET28a-CsPG1 vector; 3: double enzyme digestion
of pET28a-CsPG1.
第 2期 李孟娇等: 果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析 197
致(图 7)。28℃、200 r min–1的诱导条件下, 目的蛋
白 2 h后即高效表达且 5 h后表达量最高。诱导后大
肠杆菌 BL21 (DE3)菌液超声波破碎后 , 经 SDS-
PAGE分别电泳检测上清液和沉淀(图 8, 泳道 1、2),
结果表明, 上清液中没有目的蛋白, 沉淀中的目的
蛋白以包涵体形式存在。
2.7 CsPG1包涵体的复性和纯化
依次使用不同浓度尿素(2、4、6 和 8 mol L–1)
的缓冲液溶解包涵体, 经 SDS-PAGE 分析, 使用 6
图 7 重组 CsPG1蛋白表达产物 SDS-PAGE分析
Fig. 7 SDS-PAGE analysis of the expressed product of
recombinant CsPG1
黑色框中为目的蛋白条带; M: 蛋白分子量标准; 1: pET28a(+)空
载诱导 6 h; 2~6: pET28a-PGIP 28℃诱导 1、2、3、4和 5 h
Black box indicates the target protein bands; M: protein molecular
weight standard; 1: strains harbouring pET-28a(+) after induced for
6 hours; 2–6: total proteins of engineering bacteria strains after
induction for 1, 2, 3, 4, and 5 hours.
图 8 重组 CsPG1蛋白表达产物 SDS-PAGE分析
Fig. 8 SDS-PAGE analysis of the expressed product of
recombinant CsPG1
黑色框中为目的蛋白条带: M: 蛋白分子量标准; 1: 上清液;
2: 沉淀; 3~6: 分别 2、4、6和 8 mol L–1的缓冲液溶解包涵体;
7: pET28a(+)空载诱导; 8: pET28a-CsPG1的纯化。
Black box indicates the target protein bands; M: protein molecular
weight standard; 1: supernatant; 2: sediment; 3–6: 2, 4, 6, and 8 mol
L–1 buffer dissolve inclusion body, respectively; 7: strains harbour-
ing pET-28a(+) after induced for 5 hours; 8: purification of
pET28a-CsPG1.
mol L–1 的尿素浓度的溶解效果最好 (图 8, 泳道
3~6)。经Ni+离子亲和层析后可纯化得到单一条带(图
8, 泳道 8)。采用 Bradford法测定重组蛋白浓度, 标
准曲线方程 y = 2.0389x+0.443, R2=0.9977, 线性范围
0.2~1.2 μg。以 6 mol L–1的尿素缓冲液溶解包涵体,
测定全蛋白含量为 6.57 μg μL–1。利用梯度稀释法对
上清液进行复性, 并且测定复性后 PG 的活性。D-
半乳糖醛酸标准曲线公式 y = 1.6097x–0.0052,
R2 = 0.9995, 线性范围 0~0.8 mg。从图 9 可以看出,
当稀释倍数超过 100 倍后, 酶活力基本保持稳定,
达到 33 U m L–1 以上, 此时酶的比活力为 5.02 U
mg–1, 说明采用尿素溶解结合缓慢稀释复性方法 ,
对重组 CsPG1包涵体复性是成功的。
图 9 重组 CsPG包涵体复性效果
Fig. 9 Renaturation of recombinant CsPG
5、10、50、100、150和 200是上清液中加入稀释复性缓冲液稀
释的倍数。
5, 10, 50, 100, 150, and 200 represent dilution multiples of super-
natant diluted by refolding buffer.
2.8 CsPG1蛋白功能验证
试验结果表明, 对照组 0 h 时, 颜色为紫红色,
12 h时紫红色, 24 h为紫黑色, 桑椹的颗粒饱满(图
10); 试验组 0 h时颜色为紫红色, 12 h后为紫黑色,
24 h后为黑色, 桑椹由饱满变为干瘪(图 10)。硬度测
定结果表明, 12 h时, 试验组比对照组降低了 29.3%,
24 h 时试验组比对照组降低了 51.2% (图 11), 试验
组对桑椹的软化程度远远大于对照组。
3 讨论
本研究从Sclerotinia sclerotiorum数据库中, 经
比对分析, 鉴定出CsPG基因家族中6个基因, 分别
为AF501307.1、AF501308.1、AY496277.1、AY3125
10.1、AY312511.1、AY312512.1。利用qRT-PCR分
析, 发现AF501307.1的表达量与对照进行比较, 其
表达量为最高, 为此, 我们认为它是CsPG基因家族
中的主效基因, 命名为CsPG1。进一步采用RT-PCR
从C. shiraian菌核中扩增CsPG1基因cDNA, 经分析
198 作 物 学 报 第 42卷
图 10 CsPG1作用于嘉陵 40桑椹的不同时间效果
Fig. 10 Effects of CsPG1 act on Jialing 40 mulberry at
different time
对照组和试验组桑椹分别在 0、12、24 h的颜色变化。
The color changes between control and experimental groups at 0, 12,
24 hours, respectively.
图 11 嘉陵 40桑椹不同时间硬度的测定
Fig. 11 Jialing 40 mulberry hardness measured at different
time
对照组和试验组分别在 0、12和 24 h桑椹硬度的测定。
The hardness measurement between control and experimental
groups at 0, 12, 24 hours respectively.
CsPG1的开放阅读框全长1143 bp, 编码380个氨基
酸残基, 将CsPG1序列提交GenBank, 获得登录号为
KR296662。CsPG1蛋白分子量37.72 kD, 等电点为
6.93, 信号肽为N端20个氨基酸残基, 具有2个潜在
的N-糖基化位点, 具有自身保守的半胱氨酸(Cys)残
基位点。PG序列比对结果表明, CsPG1与Botryotinia
fuckeliana的PG基因具100%的同源性 , 与Saccharo-
myces cerevisiae、 Aspergillus flavus、 Penicillium
digitatum、 Aspergillus aculeatus、 Penicillium ex-
pansum等真菌PG的物种进化同源性较近。而与植物
PG和细菌PG等物种进化同源性较远。
C. shiraian的菌丝侵染油菜第2天侵染病斑面积
是第1天的5倍 , 但CsPG1的表达量只有第1天的
50%。同样在Zafer等[25]的研究中, 核盘菌侵染同一
片油菜叶片时 , 发现高水平的SsPG1表达量在侵染
边缘的损伤部位而不是在坏死或无症状的区域。同
时在胡萝卜 [26]和向日葵子叶 [27]等中SsPg1的表达均
在16 h, 继续增加到36 h达到最大值。在感染的大豆
叶子[28], SsPg1表达量被发现在8 h, 在16 h表达量达
到了最高。由于菌丝刚侵染油菜的致病力比较强 ,
营养丰富, 酶活性较高, CsPG1可以分解果胶中的多
聚半乳糖醛酸为半乳糖醛酸的小分子。Lumsden等[29]
发现了黏性的还原型PGs在接种豆类植物后的12 h
出现酶活性 , 接种24 h后其酶活性达到一个高峰 ,
此时高峰的出现是因为对胶质多聚体降解作用, 而
后酶活性逐渐下降, 直到形成明显的侵染斑, 另一
个还原活性高峰出现。
本试验克隆到的聚半乳糖醛酸酶基因, 虽然在
大肠杆菌中得到表达 , 但超声波破碎后 , 通过
SDS-PAGE 检测破碎液上清液, 未发现聚半乳糖醛
酸酶, 而沉淀中的聚半乳糖醛酸酶没有活性。对异
源高效表达的聚半乳糖醛酸酶(CsPG1)包涵体的重
折叠, 本文摸索出了包涵体溶解缓冲液用 2、4、6
和 8 mol L–1的不同尿素的浓度来溶解包涵体, 试验
结果表明, 6 mol L–1的尿素溶解的效果最好, 用包涵
体溶解缓冲液处理包涵体时 , 尿素能很好地使
CsPG1 蛋白变性, 有效破坏非共价键结合的蛋白质,
大大提高蛋白质的可溶性, β-巯基乙醇用于二硫键
的还原, 用于保护 CsPG1 蛋白中自由的半胱氨酸巯
基之间不会错误形成二硫键。包涵体在 37℃摇床温
育 30 min, 使 CsPG1蛋白得到了充分的溶解。复性
后的包涵体离心后, 上清液中缓慢加入稀释复性缓
冲液, 每次保证在较低的浓度下进行, 并且每次添
加复性缓冲液时, 间隔足够的时间(1 h), 能使添加
的变性蛋白在复性过程中, 越过易于形成蛋白聚集
体的折叠中间体, 从而可以提高复性率。分别稀释
5、10、50、100、150和 200倍, 稀释酶液在 4℃静
置 1 h进行充分复性, 0.4 mol L–1 L-Arg具有抑制分
子间作用, 降低聚集体生成速度, 有助于增加复性
中间产物的溶解度。甘油具有稳定天然蛋白质的结
构, 促进正确折叠产物的生成, 复性后的多聚半乳
糖醛酸酶的比活力为 5.02 U mg–1。
在桑椹成熟过程中, 原果胶不断降解为可溶性
果胶, 即多聚半乳糖醛酸酶不断将聚半乳糖醛酸分
第 2期 李孟娇等: 果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析 199
解为半乳糖醛酸, 细胞结构随之受损, 胞间层电子
密度降低, 并且随着微纤维丝间果胶和纤维素物质
的溶解, 微纤维丝结构变得松弛而软化, 细胞壁变
薄 , 大量细胞壁结构消失 , 细胞变圆且趋于分散 ,
果肉硬度随之下降[30]。桑椹软化的过程伴随着颜色
的变化由红色变为紫红色, 变为紫黑色, 最后变为
黑色。当桑椹表面均匀地涂抹复性后的 CsPG1蛋白
液后, 试验组的桑椹颜色比对照组更快变深, 很快
变成黑色, 同时测定桑椹的硬度, 12 h时, 试验组比
对照组降低了 29.3%, 24 h时试验组比对照组降低了
51.2%。表明该基因表达的蛋白能够促使桑椹细胞壁
中的原果胶快速降解为可溶性果胶, 而有利果桑肥
大性菌核病菌丝的侵染。
4 结论
鉴定出 PG的基因家族共有 6个基因, AF501307.1
是 CsPG 基因家族的主效基因, 命名为 CsPG1。构
建原核表达载体, 实现了该基因编码蛋白在大肠杆
菌内的高效表达。经 SDS-PAGE 检测为包涵体, 经
过缓慢稀释低温复性获得了可溶性 CsPG1蛋白。该
蛋白能够加速桑椹的颜色变深和软化, 推测 CsPG1
蛋白有利于果桑肥大性菌核病菌丝对桑椹的侵染。
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