全 文 ：Science of Sericulture 蚕业科学
收稿日期:2011 － 09 － 06 接受日期:2011 － 10 － 19
资助项目:西南大学博士启动基金项目(No． swu110059) ，四川应用
基础研究项目(No． 2011JC0083)。
第一作者信息:陈仁芳(1958 －) ，男，博士，副教授。
E-mail:crf55@ 163． com
* Corresponding author． E-mail:crf55@ 163． com
2012，38(1) :0002 － 0007
ISSN 0257 － 4799;CN 32 － 1115 /S
E-mail:CYKE@ chinajournal． net． cn
基于 ITS分析云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的亲缘关系
及分化时间
陈仁芳1 陈祥平2 范小敏2 陈家元1 刘泽听1 虞志伟1
(1西南大学生物技术学院，农业部蚕桑学重点开放实验室，重庆 400716; 2四川省丝绸科学研究院，四川省丝绸工程技术研究中心，成都
610031)
摘 要 云南光叶桑、钦州长果桑在形态分类学上均属同一桑种 Morus macroura。通过 PCR 扩增 2 份地方品种资源材料的
ITS序列并分析序列差异及构建系统进化树，阐明各自在桑属中的遗传分化关系。2 份材料的 ITS 序列长度均为 576 bp，其
中:云南光叶桑的 G + C含量为 59. 90%，碱基序列 45 位 A变 G，560 位 T变 G，与昆明奶桑(Morus macroura)、荥经川桑(Morus
notabilis)、云南毛叶奶桑(Morus macroura var． mawa)、云南长穗桑(Morus wittiorum)、云南奶桑(Morus macroura)、雅安华桑
(Morus cathayana)同在第Ⅰ类群，有较近的亲缘关系;钦州长果桑的 G + C 含量为 59. 72%，碱基序列 45 位为 A，560 位 T 变
G，与云南华桑(Morus cathayana)同在第Ⅱ类群，有较近的亲缘关系。应用松散分子钟方法估算云南光叶桑与荥经川桑、雅安
华桑、云南长穗桑的分化时间为 8. 23 Ma，钦州长果桑与云南华桑的分化时间为 9. 67 Ma，二者起源的地质年代是新第三纪中
新世与上新世之交，是为了抵御地球寒冷、旱化，向南、向山地迁移形成的物种。
关键词 核糖体 DNA内转录间隔区;桑属;云南光叶桑;钦州长果桑;亲缘关系;分歧年代
中图分类号 S888． 3;Q948． 2 文献标识码 A 文章编号 0257 － 4799(2012)01 － 0002 － 06
An Analysis on Phylogenetic Relationship and Divergence Time of Yunnan
Guangye Sang and Qinzhou Changguo Sang in Morus Genus Based on ITS Se-
quence
CHEN Ren-Fang1* CHEN Xiang-Ping2 FAN Xiao-Min2 CHEN Jia-Yuan1 LIU Ze-Ting1 YU Zhi-Wei1
(1College of Biotechnology，Southwest University，The Key Sericultural Laboratory of Agricultural Ministry，Chongqing
400716，China;2Sichuan Provincial Silk Science Research Institute，Sichuan Provincial Silk Engineering Research Cen-
ter，Chengdu 610031，China)
Abstract Yunnan Guangye Sang and Qinzhou Changguo Sang belong to the same mulberry species，Morus macroura，
in morphological taxonomy． In this study，the ITS sequences of both local variety materials were PCR amplified，analyzed
on their sequence difference，and used to construct phylogenetic trees for elucidation of their inheritance and divergence
behavior in the Morus genus． The ITS sequence of both materials is 576 bp． However，the G + C content in Yunnan
Guangye Sang is 59. 90%，and A has been replaced by G at nucleotide 45 and T by G at nucleotide 560． It has close
phylogenetic relationship with Kunming Nai Sang (Morus macroura) ，Yingjing Chuan Sang (Morus notabilis) ，Yunnan
Maoyenai Sang (Morus macroura var． mawa) ，Yunnan Changsui Sang (Morus wittiorum) ，Yunnan Nai Sang (Morus
macroura) ，and Yaan Hua Sang (Morus cathayana) ，all
of which belong to group Ⅰ in the constructed phylo-
genetic tree． The G + C content in Qinzhou Changguo
Sang is 59. 72% with A at nucleotide 45 and with substitu-
tion of T by G at nucleotide 560． It has close phylogenetic
relationship with Yunnan Hua Sang (Morus cathayana) ，
DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2012.01.006
第 1 期 陈仁芳等:基于 ITS分析云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的亲缘关系及分化时间 3
both of which belong to group Ⅱ in the constructed phylogenetic tree． Estimation by loose molecular clock method
showed that the divergence time of Yingjing Chuan Sang，Yaan Hua Sang，and Yunnan Changsui Sang is 8. 23 Ma，and
that of Qinzhou Changguo Sang and Yunnan Hua Sang is 9. 67 Ma． The geologic age of their origination was the transi-
ent time between the Miocene epoch and the Pliocene epoch in Neogene Period． They are the species evolved in the mi-
gration towards southern and hilly areas to resist cold and arid environment of the earth．
Key words Internal transcribed spacer (ITS)of ribosomal DNA;Morus genus;Yunnan Guangye Sang;Qinzhou
Changguo Sang;Phylogenetic relationship;Divergence time
云南光叶桑［1］来源于云南省思茅地区，形态分
类归属为 Morus maroura，由于成熟叶片表面具光泽
而得名。该品种为落叶乔木，老树皮呈灰白褐色，叶
卵形至阔卵形，基部浅心形至圆形，先端渐尖至尾
尖，叶缘细锯齿，雌雄异株，花期 3 ～ 4 月，果期 4 ～ 5
月，果长圆柱形、下垂，长 7 ～ 15 cm，雌花无花柱，
《中国植物志》［2］将其分在桑组(Sect． Morus)。云
南光叶桑生长快，树干光滑，可作木材用桑，皮可造
纸，根、茎、叶可提取桑色素［3］。钦州长果桑来源于
广西壮族自治区的钦州地区，因桑果特长，故而得
名，在形态分类上同样归属为 Morus maroura，与云
南光叶桑属同一桑种，该品种产果多，果形大，是果
用桑树地方品种。
云南光叶桑、钦州长果桑作为桑树多功能开发
的品种资源已见药用成分、生态分布、果用栽培技术
的研究［4 － 8］，但未见亲缘关系、分歧年代的报道。本
研究选取云南光叶桑、钦州长果桑和其它桑属的 21
个品种为材料，通过 PCR 扩增核糖体 DNA 内转录
间隔区(ITS)序列，分析序列差异及系统发育关系，
并利用松散分子钟方法估算云南光叶桑、钦州长果
桑的系统发育分支起源时间，为桑树特殊用途品种
资源的研究积累基础信息。
1 材料与方法
1． 1 材料
云南光叶桑来自云南昆明植物园，钦州长果桑来
自广西钦州青龙山庄百香果基地，其它桑属材料分别
来自于西南大学、广西壮族自治区蚕业科学研究院、
湖北省农业科学院经济作物研究所、云南省农业科
学院蚕桑蜜蜂研究所，外类群构树(Broussonetia pa-
pyrifera)来自重庆市。所有供试材料(表 1)经鉴定
后采摘上部枝条的叶片用于提取基因组 DNA。
表 1 供试桑树品种(材料)名称及来源
Table 1 Names and origins of mulberry varieties (materials)for test
编号
No．
品种或材料名称
Variety or material name
来源地
Origin
拉丁学名
Scientifc name
1 云南光叶桑 Yunnan Guangye Sang 云南昆明 Kunming，Yunnan Morus macroura
2 昆明奶桑 Kunming Nai Sang 云南昆明 Kunming，Yunnan Morus macroura
3 浙江火桑 Zhejiang Huo Sang 浙江杭州 Hangzhou，Zhejiang Morus mizuho
4 昆明鬼桑 Kunming Gui Sang 云南昆明 Kunming，Yunnan Morus mongolica var． diabolica
5 斯里兰卡桑 Srilanka Sang 斯里兰卡 Srilanka Morus alba
6 广东荆桑 Guangdong Jing Sang 广东广州 Guangzhou，Guangdong Mrous atropurpurea
7 荥经川桑 Yingjing Chuan Sang 四川荥经 Yingjing，Sichuan Morus notabilis
8 雅安山桑 Yaan Shan Sang 四川雅安 Yaan，Sichuan Morus bombycis
9 保康蒙桑 Baokang Meng Sang 湖北保康 Baokang，Hubei Morus mongolica
10 新疆黑桑 Xinjiang Hei Sang 新疆和田 Hetian，Xinjiang Morus nigra
11 神农架鸡桑 Shennongjia Ji Sang 湖北神农架 Shennongjia，Hubei Morus australis
12 云南毛叶奶桑 Yunnan Maoyenai Sang 云南西双版纳 Xishuangbanna，Yunnan Morus macroura var． mawa
13 雅安华桑 Yaan Hua Sang 四川雅安 Yaan，Sichuan Morus cathayana
14 金佛山华桑 Jinfoshan Hua Sang 重庆金佛山 Jinfoshan，Chongqing Morus cathayana
15 钦州长果桑 Qinzhou Changguo Sang 广西钦州 Qinzhou，Guangxi Morus macroura
4 蚕 业 科 学 2012;38 (1)
续表 1 Table 1 continued
编号
No．
品种或材料名称
Variety or material name
来源
Origin
拉丁学名
Scientifc name
16 广西鸡桑 Guangxi Ji Sang 广西南宁 Nanning，Guangxi Morus australis
17 云南华桑 Yunnan Hua Sang 云南草坝 Caoba，Yunnan Morus cathayana
18 云南奶桑 Yunnan Nai Sang 云南草坝 Caoba，Yunnan Morus macroura
19 云南长穗桑 Yunnan Changsui Sang 云南草坝 Caoba，Yunnan Morus wittiorum
20 剑持 Jianchi 日本 Japan Morus bombycis
21 利川长穗桑 Lichuan Changsui Sang 湖北利川 Lichuan，Hubei Morus wittiorum
22 咸丰长穗桑 Xianfeng Changsui Sang 湖北咸丰 Xianfeng，Hubei Morus wittiorum
23 重庆鬼桑 Chongqing Gui Sang 四川石棉 Shimian，Sichuan Morus mongolica var． diabolica
24 重庆构树 Chongqing Goushu 重庆北碚 Beibei，Chongqing Broussonetia papyrifera
1． 2 桑树基因组 DNA提取及浓度检测
采用 CTAB 法［9］并稍加改进。从 0. 15 g 左右
的硅胶干燥桑叶中提取基因组 DNA，经 0. 4%琼脂
糖凝胶电泳后，以 λDNA /Hind Ⅲ marker 为标准，用
GeneQuant紫外分光核酸测定仪(Eppendorf，Germa-
ny)检测基因组 DNA浓度。
1． 3 ITS序列扩增与测序
根据 GenBank登录的 ITS 序列设计引物，并参
照 White等［10］的研究对引物序列略加调整。引物
序列为 ITS5 (5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-
3)、ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) ，由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 扩
增反应总体系为 20 μL，其中含 10 ng DNA模板、50
μmol /L正反向引物各 1 μL、2. 5 mmo /L dNTPs 1. 5
μL、10 × PCR buffer 1. 5 μL和 Taq DNA聚合酶 5 U，
用纯水补充至 20 μL。扩增程序为:94 ℃ 4 min;
94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共 33 个循环;
72 ℃ 7 min。
扩增产物用 Microcon YM100 超滤离心管(Mil-
lipore公司)纯化，并调整 DNA 浓度，送往上海生工
生物工程技术服务有限公司测序。
1． 4 序列分析
测序结果用 Sequencher 4． 1． 4 软件进行拼接;
根据 GenBank 已发表的鲁桑 18S rRNA 基因 3端
序列、26S rRNA 基因 5端序列(GenBank 登录号:
AM042003) ，确定本试验各材料的 ITS 序列范围，
用 ClustalX1． 83c 软件进行序列比对;用 DNAstar
软件分析序列长度、G + C 含量及变异位点;采用
PAUP Version 4. 0 beta 10 软件的 MP 法分析信息
位点(informative site) ，并与 Modeltest V3 ． 06 软
件［11］配合使用建立碱基进化模型，基于此模型
用 MP 法分析亲缘关系;用 BEAST 软件［12 － 14］计
算分歧年代。
2 结果与分析
2． 1 云南光叶桑、钦州长果桑的 ITS序列分析
各材料样品的 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检
测、回收、纯化、测序后登录于 GenBank。用 DNAstar
软件分析 ITS 序列长度、G + C 含量、变异位点，其
中:云南光叶桑、钦州长果桑的 ITS 序列长度均为
576 bp，G + C含量分别为 59. 90%、59. 72%，云南光
叶桑 45 位 A变 G，560 位 T变 G，钦州长果桑 45 位
为 A，560 位 T变 G(图 1)。
2． 2 云南光叶桑、钦州长果桑与桑属其它品种材料
的亲缘关系
PAUP Version 4． 0 beta 10 和 Modeltest V3． 06
软件配合使用，用 MP法分析云南光叶桑、钦州长果
桑的亲缘关系。分支图树长(tree length)为 91，一
致性指数(CI)为 0. 989 0，保持性指数(RI)为 0. 956 5，
调整后的一致性指数(RC)为 0. 946 0。比对序列总
长 599 bp，其中 511 个不变位点，80 个变异非信息
位点，8 个信息位点。分支图首先将新疆黑桑
(Mrous nigra)分出，自举检验(bootstrap)支持率为
89%，其它材料分为 2 个类群，但支持率不高，均未
达到 50%。云南光叶桑被分在第Ⅰ 类群(group
Ⅰ) ，与昆明奶桑(Morus macroura)、荥经川桑(Mo-
rus notabilis)、云南毛叶奶桑(Morus macroura var．
mawa)、云南长穗桑(Morus wittiorum)、云南奶桑
(Morus macroura)、雅安华桑(Morus cathayana)有较
近的亲缘关系;钦州长果桑被分在第Ⅱ类群(group
Ⅱ) ，与云南华桑(Morus cathayana)有较近的亲缘关
系(图 2)。
第 1 期 陈仁芳等:基于 ITS分析云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的亲缘关系及分化时间 5
左边品种材料的编号与表 1 一致，其中 1 号为云南光叶桑，15 号为钦州长果桑。
Variety material numbers on the left side are the same as shown in Table 1，
among which No． 1 is Yunnan Guangye Sang and No． 15 is Qinzhou Changguo Sang．
图 1 云南光叶桑与钦州长果桑 ITS序列的变异位点
Fig． 1 Variation sites of ITS sequences in Yunnan Guangye Sang and Qinzhou Changguo Sang
右边品种材料的编号与表 1 一致，其中 1 号为云南光叶桑，15 号为钦州长果桑。图 3 同。
Variety material numbers on the right side are the same as shown in Table 1，
among which No． 1 is Yunnan Guangye Sang and No． 15 is Qinzhou Changguo Sang． The same in Fig． 3．
图 2 基于 ITS序列的云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的系统进化树
Fig． 2 Phylogenetic tree of Yunnan Guangye Sang and Qinzhou Changguo Sang in the Morus genus based on ITS sequences
6 蚕 业 科 学 2012;38 (1)
2． 3 云南光叶桑、钦州长果桑在系统进化中的分歧
年代
根据桑属在桑科中的分歧年代为 55 Ma［15］，
用上一节计算亲缘关系的数据文件(NEXUS) ，输
入 BEAST 软件进行分析［16］。松散分子钟法估算
云南光叶桑(Morus macroura)与荥经川桑(Morus
notabilis)、雅安华桑(Morus cathayana)、云南长穗
桑(Morus wittiorum)的分化时间为 8. 23 Ma，钦州
长果桑与云南华桑(Morus cathayana)的分化时间
为 9. 67 Ma(图 3)。
图 3 基于 ITS序列的云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的系统分化时间
Fig． 3 Phylogenetic divergence time of Yunnan Guangye Sang and Qinzhou Changguo Sang
in the Morus genus based on ITS sequences
3 讨论
3． 1 云南光叶桑、钦州长果桑的 ITS 序列位点变
异与种性
云南光叶桑的 ITS碱基序列 45位 A变 G，560位
T变 G，钦州长果桑的 ITS碱基序列 45位为 A，560位
T变 G。然而，这种变异并非仅在这 2 个品种之间。
如 45位 A变 G，560位 T变 G，除云南光叶桑外，还有
雅安华桑(Morus cathayana)、云南毛叶奶桑(Morus
macroura var． mawa)、荥经川桑(Morus notabilis)、云
南奶桑(Morus macroura)、云南长穗桑(Morus wit-
torum)、昆明奶桑(Morus macroura) ，这些品种或材料
均能形成高大、直立乔木，具有叶片大，易形成自然多
倍体，生长速度快，不耐寒等特点;45 位为 A，560 位 T
变 G，除钦州长果桑外，还有云南华桑(Morus cathay-
ana)，属变异过渡类型，这些变异材料除具有上述品种
或材料的特征外，还具有叶片无毛、叶稍薄的特点［17］。
ITS碱基序列 45 位、560 位是种性维持的关键
位点。本实验中，归属华桑(Morus cathayana)的雅
安华桑以及归属奶桑(Morus macroura)、毛叶奶桑
(Morus macroura var． mawa)、川桑(Morus notabi-
lis)、长穗桑(Morus wittiorum)的材料的 45 位为 G，
560 位为 G;归属华桑(Morus cathayana)的金佛山华
桑以及归属白桑(Morus alba)、蒙桑(Morus mongoli-
ca)、鬼桑(Morus mongolica var． diabolica)、山桑
(Morus bombycis)、瑞穗桑(Morus mizuho)、广东桑
(Morus atropurpurea)、鸡桑(Morus australis)的材料
的 45 位为 A，560 位为 T。钦州长果桑 45 位为 A，
560 位 T 变 G，说明华桑、奶桑、毛叶奶桑、川桑、长
穗桑在演化过程中，与白桑、蒙桑、鬼桑、山桑、瑞穗
第 1 期 陈仁芳等:基于 ITS分析云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的亲缘关系及分化时间 7
桑、广东桑存在某种联系。
3． 2 云南光叶桑、钦州长果桑与桑属其它品种的亲
缘关系及栽培要点
在基于 ITS序列的系统发育图中，云南光叶桑
分在第Ⅰ类群，与昆明奶桑(Morus macroura)、荥经
川桑(Morus notabilis)、云南毛叶奶桑(Morus mac-
roura var． mawa)、云南长穗桑(Morus wittiorum)、云
南奶桑(Morus macroura)、雅安华桑(Morus cathay-
ana)有较近的亲缘关系。云南光叶桑在栽培上宜
养成高干乔木，作为木材用桑开发，由于不耐寒，宜
在长江以南地区栽植和选择粗壮的枝条繁殖。钦州
长果桑被分在第Ⅱ 类群，与云南华桑有较近的亲缘
关系，宜养成高干乔木，并在长江以南地区栽植。
3． 3 分支图基本参数的生物学意义
本研究采用 MP 法分析云南光叶桑、钦州长果
桑的亲缘关系，分支图树长为 91，一致性指数 (CI)
为 0. 989 0，保持性指数(RI)为 0. 956 5，调整后的
一致性指数(RC)为 0. 946 0。比对序列总长 599
bp，511 个不变位点，80 个变异非信息位点，8 个信
息位点。说明 ITS 序列在桑属中的变异不大，一致
性较高，信息位点不够。分支图首先将新疆黑桑分
出，其自举检验支持率为 89%，其它材料分为 2 个
类群，但支持率不高，均未达到 50%。除新疆黑桑
外，其它材料分成 2 个类群的支持率不够;但在第Ⅱ
类群中，将利川长穗桑、咸丰长穗桑明显分出的支持
率达 84%，将白桑、蒙桑、鬼桑、瑞穗桑、山桑、广东
桑、鸡桑分在一起的支持率达 65%。详细研究第Ⅱ
类群中各材料的 ITS 序列，大多相同。在传统分类
中，白桑、蒙桑、鸡桑的形态完全不同，但本实验中这
3 个桑种的材料的 ITS序列完全相同，说明 ITS序列
对桑属的系统学研究有一定缺陷，需另择基因片段，
或与其它基因片段联合分析。
3． 4 研究桑树分歧年代的意义
研究桑树的分歧年代，结合地理分布、古气候、
古地质分析，可为其起源及演变过程提供信息。本
研究根据 Zerega 等［15］基于 26S rDNA、ndhF 基因和
多个桑科化石校正，桑属在桑科中的分歧年代为 55
Ma。应用 BEAST软件，基于 ITS序列用松散分子钟
法粗略估算云南光叶桑和钦州长果桑在桑属中的分
歧年代在 8. 23 ～ 9. 67 Ma，在桑属中属较早出现的
类型。此期正是新第三纪中新世与上新世之交，地
质构造属喜马拉雅造山阶段，地球寒冷、旱化［18 － 19］，
云南光叶桑和钦州长果桑又分布在我国云南、广西、
四川以及东南亚至印度尼西亚苏门达腊、爪哇等山
区，在此期分化明显是为了抵御寒冷，向南、向山地
迁移形成的物种类型。
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