全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(1): 3141 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由山东省花生良种产业化工程项目, 山东省现代农业产业技术体系花生创新团队建设项目(SDAIT-05-011-02), 国家现代农业
产业技术体系建设专项(CARS-14), 国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD35B04)和国家自然科学基金项目(31271757)资助。
通讯作者(Corresponding author): 刘风珍, E-mail: liufz@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8241540
第一作者联系方式: E-mail: 13553158892@126.com
Received(收稿日期): 2014-04-16; Accepted(接受日期): 2014-09-30; Published online(网络出版日期): 2014-11-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141111.1557.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00031
花生转录因子基因 NAC4的等位变异分析
李 文 万 千 刘风珍* 张 昆 张秀荣 厉广辉 万勇善
山东农业大学农学院 / 作物生物学国家重点实验室 / 山东省作物生物学重点实验室, 山东泰安 271018
摘 要: NAC 转录因子在植物应答非生物胁迫中起重要作用。利用生物信息学分析推测花生栽培种转录因子基因
AhNAC4 (登录号为 HM776131.1)属于抗旱相关转录因子基因, 对比栽培品种山花 11 号 AhNAC4 的 2 条 cDNA 序列
(ShrNAC4-a和 ShrNAC4-b)及其相应的 DNA序列(ShNAC4-a和 ShNAC4-b)表明, AhNAC4全长为 1244 bp, 编码区长度
为 1050 bp, 含有 2个内含子, 分别位于 182~279 bp和 547~642 bp处, 编码蛋白包含 349个氨基酸。从抗旱性不同的
32个栽培品种分离得到 4类 AhNAC4, 分别命名为 AhNAC4-a1、AhNAC4-a2、AhNAC4-b1和 AhNAC4-b2, 缩写为 a1、
a2、b1和 b2。a1和 a2为等位基因, 二者在 717 bp处存在 1个碱基差异, 引起第 174位氨基酸的改变, b1和 b2为等
位基因, 二者存在 14个 SNP位点, 其中 717 bp和 924 bp处碱基的差异引起第 174位和第 244位氨基酸的改变。供
试品种中基因型为 a1a1b1b1、a1a1b2b2、a2a2b1b1、a2a2b2b2 的品种数分别为 10、5、15 和 2。从 19 个野生种中
分离得到 11 类 NAC4 的 DNA 序列(Aw1NAC4–Aw11NAC4), Aw1NAC4 与栽培种 b1、b2 的核苷酸序列同源性最高,
Aw2NAC4与栽培种 a1、a2核苷酸序列同源性最高。推测栽培种 a1基因编码蛋白对花生抵御干旱起关键作用, a1和
b1基因编码蛋白的功能与野生种更接近。
关键词: 花生; 转录因子; NAC; 等位变异
Allelic Variation of Transcription Factor Genes NAC4 in Arachis Species
LI Wen, WAN Qian, LIU Feng-Zhen*, ZHANG Kun, ZHANG Xiu-Rong, LI Guang-Hui, and WAN
Yong-Shan
State Key Laboratory of Crop Biology / Shandong Key Laboratory of Crop Biology / College of Agronomic Sciences, Shandong Agricultural Univer-
sity, Tai’an 271018, China
Abstract: NAC transcription factors play an important role in response to abiotic stress of plant. In this paper, bioinformatic
analysis indicated that transcription factor gene AhNAC4 (accession number HM776131.1) can response to drought signal. The
comparison of cDNAs (ShrNAC4-a and ShrNAC4-b) and genomic DNAs (ShNAC4-a and ShNAC4-b) from Shanhua 11 showed
that AhNAC4 has a full length of 1244 bp and an ORF of 1050 bp, containing two introns at 182–279 bp and 547–642 bp, and
encoding 349 amino acids. Four kinds of AhNAC4 genes, named as AhNAC4-a1, AhNAC4-a2, AhNAC4-b1, and AhNAC4-b2 (ab-
breviations: a1, a2, b1, and b2), were cloned from 32 cultivars with different drought resistances. Among them a1 and a2 were
alleles, with only one locus different between the two genes, leading to the difference of corresponding amino acids at site 174; b1
and b2 were alleles, with 14 SNPs, of which two SNPs led to differences of the corresponding amino acids at sites 174 and 244.
There were four genotypes of AhNAC4 in the 32 cultivars, containing 10 a1a1b1b1, 5 a1a1b2b2, 15 a2a2b1b1, and 2 a2a2b2b2.
Meanwhile, 11 NAC4 genes (Aw1NAC4–Aw11NAC4) were isolated from 19 wild peanut accessions in Arachis. Aw2NAC4 had the
highest homology of nucleotide sequence with a1 or a2, and b1 or b2 had the highest homology of nucleotide sequence with
Aw1NAC4. It is speculated that the protein encoding a1 plays a key role in responding drought stress, and the function of the pro-
teins encoding a1 and b1 genes is closer with that of wild species.
Keywords: Peanut; Transcription factor; NAC; Allelic variation
32 作 物 学 报 第 41卷
最早在矮牵牛 (Pharbifis nil) NAM、拟南芥
(Arabidopsis thaliana) ATAF1/2和CUC2的N端发现
一段高度保守的氨基酸序列 , 命名为NAC结构域 ,
并将包含NAC结构域的蛋白称为NAC转录因子[1]。
NAC转录因子是植物特有的转录调控因子, 是最大
的转录因子家族之一[2]。NAC转录因子显著结构特
点是 , N端含有约150个氨基酸组成的高度保守的
NAC结构域, C端有高度多样性的转录激活区[2-3]。
NAC转录因子不仅参与植物器官发育[3-4]、次生壁的
形成[5]、细胞周期的调控[6], 而且在植物抗逆境胁迫
中具有重要的调控作用[7-8]。Tran等[9]从拟南芥中分
离到3个受干旱、高盐和ABA诱导表达的NAC基因
(AtNAC019、AtNAC055和AtNAC072), 在3个基因的
转基因植株中皆超量表达, 并显著增强拟南芥抗旱
性。水稻中已分离的受干旱胁迫诱导表达的NAC转
录因子基因有OsNAC6[10]、ONAC045[11]和OsNAC52[12]
和SNAC1[13], Hu等[13]研究表明, 过量表达SNAC1基
因促进转基因水稻叶片气孔关闭, 减少水分丧失速
率 , 增强抗旱能力 , 结实率提高22%~34%。刘美英
等 [14]分离得到小麦NAC转录因子的基因TaNAC, 干
旱诱导24 h, TaNAC基因转录水平表达量显著升高,
过量表达TaNAC的转基因烟草在模拟干旱胁迫处理
下, 抗旱性明显高于非转基因烟草。因此, NAC转录
因子在植物应答干旱胁迫中起着重要作用。
在花生中已分离的NAC基因包括AhNAC1[15]、
AhNAC2和AhNAC3[16]以及AhNAC4 (HM776131.1)。
AhNAC1基因属于ATAF亚族, 与大豆GmNAC2[17]氨
基酸序列一致性为78%, 过量表达GmNAC2的转基
因烟草中活性氧清除系统基因的表达受抑制, 降低
了其对非生物胁迫的耐性。在ABA诱导、控水和低
温条件下, AhNAC2和AhNAC3在花生组织中的表达
均上调, 二者表达模式不同。AhNAC2属于AtNAC3
亚族, 可被ABA高效诱导表达, 通过调节气孔大小
来抵御干旱胁迫 [18]; AhNAC3不能明显地被ABA诱
导, 可以通过增强SOD活性减少活性氧的积累来抵
御干旱胁迫, 推测其调控一种特殊的路径[19]。2012
年, Liu等在GenBank中注册了AhNAC4的全长cDNA
序列, 其在花生中功能尚未见报道。本研究利用生
物信息学分析推测花生NAC4的功能和核苷酸序列
及其编码蛋白氨基酸序列的差异, 揭示栽培品种及
其与二倍体野生种间基因的等位变异, 为深入研究
不同核苷酸序列AhNAC4基因的功能和花生抗旱育
种提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
包括32个栽培品种和19个花生属二倍体野生种
(表1)。栽培品种分为三类[20-22], 抗旱性强的包括濮
花28号、莱宾大豆、NC6、山花17号、花育31、鲁
花8号、远杂9102、徐州68-4、山花12号、冀0212-4、
山花13号、山花9号、鲁花14、阜花10号、豫花15、
桂花1026、山花11号; 抗旱性中等的包括潍花10号、
02P175、锦花14、湘花2008、山花8号、鲁花12、花
育17、湛油41、开农49、79266; 抗旱性弱的包括吉
花4号、锦花10号、桂花836、阜花12号、白沙1016。
栽培品种由山东农业大学花生研究所提供 , 野生
种由中国农业科学院油料作物研究所姜慧芳研究
员提供。
表 1 供试的 19个野生花生材料
Table 1 Nineteen germplasm accessions of diploid wild peanut for the experiment
编号
Code
种名
Species
区组
Section
编号
Code
种名
Species
区组
Section
W.h4366 A. rigonii 匍匐 Procumbentes W.h4383 A. cardenasii 花生 Arachis
W.h4367 A. rigonii 匍匐 Procumbentes W.h4401 A. batizocoi 花生 Arachis
W.h4354 A. paraganensis 直立 Erectoides W.h4407 A. batizocoi 花生 Arachis
W.h10057 A. appressipila 匍匐 Procumbentes W.h4363 A. stenoaperma 花生 Arachis
W.h4378 A. macedoi 围脉 Exranervosae W.h4342 A. stenosperma 花生 Arachis
W.h4362 A. dardani 异形花 Heteranthae W.h4346 A. correntina 花生 Arachis
W.h4379 A. duranensis 花生 Arachis W.h4344 A. correntina 花生 Arachis
W.h4380 A. kuhlmannii 花生 Arachis W.h4339 A. villosa 花生 Arachis
W.h4348 A. chacoense 花生 Arachis W.h4400 A. hoehnei 花生 Arachis
W.h4382 A. cardenasii 花生 Arachis
第 1期 李 文等: 花生转录因子基因 NAC4的等位变异分析 33
1.2 载体和主要试剂
TIANgel胶回收试剂盒和植物总 RNA提取试剂
盒, 购自天根生化科技有限公司。pEASY-T1 Vector、
大肠杆菌菌株 DH5α、EasyScript First-Strand cDNA
Synthesis Kit, 购自北京全式金生物技术有限公司。
其他试剂均为进口或国产分析纯。引物由上海生物
工程有限公司合成, 测序工作由北京六合华大基因
科技有限公司完成。
1.3 试验材料的处理
选取栽培品种山花11号大小一致的种子沙盒种
植 , 用Hoaglangd’s溶液培养至幼苗主茎3个幼叶完
全展开 , 以15% PEG-6000溶液(用Hoaglangd’s溶液
配制)胁迫处理, 在处理后2 h时取幼叶, 液氮速冻,
–80℃保存, 用于总RNA的提取。
1.4 DNA、RNA提取及 cDNA链的合成
以栽培种和野生种幼叶为材料 , 用CTAB法提
取总DNA。参照植物总RNA提取试剂盒说明书提取
山花11号幼叶总RNA, 以RNA为模板、Oligo(dT)为
引物 , 按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis
Kit描述的方法, 合成cDNA第1链。
1.5 花生 NAC4基因的 PCR扩增
参考AhNAC4的cDNA序列 (GenBank登录号为
HM776131.1)设计引物, 上游引物F: 5-ATGGGAAT
TCAAGAGAAAGACC-3; 下游引物R: 5-TTCCTC
ACCCTGGTTCATT-3; 以花生栽培品种山花11号总
RNA经反转录生成的cDNA第1链为模板 , 用引物F
和R扩增AhNAC4的cDNA序列。分别以32个栽培品
种和19个野生种基因组DNA为模板, 用引物F和R扩
增花生NAC4的DNA序列。PCR程序为94℃ 5 min;
94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1.5 min, 35个循环; 72℃
7 min。
1.6 PCR产物的克隆、测序
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后, 按照
DNA胶回收试剂盒说明书进行胶回收 , 再与
pEASY-T1克隆载体连接, 转化至大肠杆菌DH5α中
进行抗卡那霉素筛选。挑选白色单菌落, PCR检测鉴
定后送北京六合华大基因科技有限公司测序, 从每
个栽培品种选6~10个克隆, 野生种选3~5个。
1.7 生物信息学分析
利用NCBI(http://ncbi.nlm.ncih.gov/)和DNAMAN
软件分析核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性;
用(http://blast.jcvi.org/euk-blast/plantta_ blast.cgi)搜索
拟南芥的NAC序列; 采用MEGA5.0软件的Neighbor-
Joining算法构建系统进化树 , 行BootStrap检验 , 并
重复 1000次。以 ProtParam (http://expasy.org/tools/
protparam.html)检验氨基酸基本理化性质 ; NCBI
CDD数据库(Conserved Domain Databases)比对蛋白
质保守结构域 ; TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/
services/TMHMM/) 预 测 蛋 白 跨 膜 结 构 ; PSORT
(http://psort.hgc.jp/form.html)预测蛋白质的亚细胞
位置。
2 结果与分析
2.1 AhNAC4基因生物信息学分析
AhNAC4蛋白理论分子量为39.13 kD, 等电点pI
为7.66, 含有典型的NAC保守结构域, 无跨膜区域,
定位于过氧化物酶体。
比较分析花生NAC4与已知功能的14个NAC的
氨基酸序列(图1), 发现其与拟南芥及花生已知的3
个转录因子NAC的5个保守结构域序列一致性较高。
系统进化树分析(图2)表明, 花生NAC4与花生NAC2
遗传距离最接近, 同属于AtNAC3亚族。
2.2 AhNAC4基因的克隆
用引物F和R对山花11号的cDNA进行PCR扩增,
琼脂糖凝胶电泳检测获得约1.1 kb的特异性条带 ,
经克隆、测序获得AhNAC4的2条cDNA序列, 分别命
名为ShrNAC4-1和ShrNAC4-2。
以32个栽培品种和19个野生种(表1)的DNA为
模板进行PCR扩增, 获得约1.3 kb的片段, 经克隆、
测序检测, 每个栽培品种得到2条不同的DNA序列,
依据核苷酸序列差异分为4类(图3); 每个野生种得
到NAC4的一条DNA序列 , 依据核苷酸序列差异分
为11类(表2)。
2.3 AhNAC4分子特征分析
来自栽培品种山花11号的2条cDNA序列ShrNAC4-
a和ShrNAC4-b同源性为98.19%, 与发表序列同源性
分别为99.90%和98.10%。对应的2条DNA序列, 分别
命名为ShNAC4-a和ShNAC4-b, 全长均为1244 bp,
包含1050 bp的编码区 , 2个内含子分别位于182~
279 bp和547~642 bp处(图3), 编码蛋白包含349个
氨基酸。
2.4 AhNAC4等位变异分析
2.4.1 AhNAC4核苷酸序列差异分析 根据核酸
序列的差异, 将栽培品种的4类AhNAC4序列命名为
AhNAC4-a1、AhNAC4-a2、AhNAC4-b1和AhNAC4-b2,
缩写为a1、a2、b1和b2 (图3)。a1和a2间同源性最高,
34 作 物 学 报 第 41卷
图 1 AhNAC4与其他 NAC蛋白保守结构域对比
Fig. 1 Comparison of NAC domain alignments between AhNAC4 and some other NAC proteins
黑框代表 NAC结构域中 5个保守的亚结构域。
Conserved subdomains in the NAC domainare shown by black frame.
图 2 花生与拟南芥中基于编码蛋白氨基酸序列的 NAC基因聚类分析
Fig. 2 Clusting of NAC gene in Arabidopsis thaliana and peanut based on amino acid sequence
第 1期 李 文等: 花生转录因子基因 NAC4的等位变异分析 35
表 2 野生种与栽培种 NAC4核苷酸序列的同源性
Table 2 Homology of NAC4 nucleotide sequences in Arachis species (%)
基因 Gene 野生种 Wild species a1 a2 b1 b2
Aw1NAC4 A. appressipila (W.h10057) 98.23 98.15 100.00 98.87
Aw2NAC4 A. macedoi (W.h4378) 99.92 99.84 98.31 98.95
Aw3NAC4 A. stenoaperma (W.h4363), A. stenoaperma (W.h4342) 99.28 99.20 98.47 98.47
Aw4NAC4 A. cardenasii (W.h4383), A. villosa (W.h4329) 99.12 99.04 99.31 98.47
Aw5NAC4 A. batizocoi (W.h4384) 99.12 99.04 98.00 98.32
Aw6NAC4 A. paraganensis (W.h4354), A. duranensis (W.h4379), A. chacoense
(W.h4348), A. correntina (W.h4346), A. correntina (W.h4344)
99.04 98.85 98.15 98.31
Aw7NAC4 A. batizocoi (W.h4407) 99.04 98.95 99.38 98.55
Aw8NAC4 A. kuhlmannii (W.h4380), A. rigonii (W.h4366) 99.04 98.95 98.07 98.23
Aw9NAC4 A. cardenasii (W.h4382) 98.64 98.56 97.76 97.92
Aw10NAC4 A. dardani (W.h4362), A. hoehnei (W.h4346) 98.56 98.48 97.60 97.76
Aw11NAC4 A. rigonii (W.h4366) 97.43 97.35 98.07 97.59
图 3 栽培品种 4类 AhNAC4核苷酸序列的对比分析
Fig. 3 Alignment of four kinds of AhNAC4 nucleotides sequence in peanut cultivars
下画线标注内含子部分; 黑色阴影标注起始密码子 ATG和终止密码子 TGA; 灰色阴影标注 SNP位点。
Intron is underlined; initiator condon ATG and the stop condon TGA are shaded by dark blocks; the site of SNP are shaded by gray.
36 作 物 学 报 第 41卷
只有1个碱基的差异, 位于717 bp处, 每个栽培品种
只包含其中的1个基因。b1和b2有14个SNP位点, 每
个栽培品种只包含其中的1个基因。a1和b1有21个差
异位点, 其中20个为SNP位点; a1和b2有11个差异位
点, 10个为SNP位点。
2.4.2 AhNAC4编码蛋白氨基酸序列分析 a1、
a2、b1和b2对应的编码蛋白命名为A1、A2、B1和
B2。氨基酸序列分析表明, A1和A2间存在1个氨基酸
的差异, 位于第174个氨基酸的位置; A1和B1间有2
个氨基酸的差异, 位于第244和第311氨基酸的位置;
A1和B2间有2个氨基酸的差异, 位于第174和第311
氨基酸的位置; A2和B1间有3个氨基酸的差异, 位于
第174、第244和第311氨基酸的位置; A2和B2间有1
个氨基酸的差异, 位于第311氨基酸的位置; B1和B2
间有2个氨基酸的差异 , 位于第174和第244氨基酸
的位置(图4)。
257A1
257A2
257B1
257B2
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A
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F
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f
F
F
F
F
q
Q
Q
Q
Q
图 4 AhNAC4编码蛋白氨基酸序列的对比分析
Fig. 4 Comparison of the four deduced amino acids sequences of AhNAC4
2.5 不同抗旱品种 NAC4基因组成分析
对抗旱性不同的32个品种进行NAC4的基因组
成分析, 其中莱宾大豆、NC6、远杂9102、山花12
号、冀0212-4、鲁花14、山花11号、潍花10号、02P175
和湘花2008基因型为a1a1b1b1; 濮花28、徐州68-4、
山花9号、花育17和开农49基因型为a1a1b2b2; 山花
17、花育31、鲁花8号、阜花10号、豫花15、桂花1026、
锦花14、山花8号、鲁花12、湛油41、吉花4号、桂
花836、锦花10号、阜花12号和白沙1016基因型为
a2a2b1b1; 山花13号和79266基因型为a2a2b2b2。对
比32个品种的抗旱性及其基因型表明 , 基因型为
a1a1b1b1的10个品种中表现强抗旱性的品种有7个,
3个品种属于中等抗旱性; 基因型为a1a1b2b2的5个
品种中表现强抗旱性的品种有3个, 2个品种属于中
等抗旱性; 基因型为a2a2b1b1的15个品种中表现强
抗旱性的品种有6个, 4个品种属于中等抗旱性, 5个
品种属于弱抗旱性; 基因型为a2a2b2b2的品种只有
2个, 山花13号为强抗旱性品种, 79266属于中等抗
旱品种。
2.6 花生野生种和栽培种 NAC4的变异分析
比较野生种与栽培种NAC4基因核苷酸序列的
差异, 按照序列同源性从高到低, 将野生种的11类
NAC4基因依次命名为 Aw1NAC4、 Aw2NAC4、
Aw3NAC4、 Aw4NAC4、 Aw5NAC4、 Aw6NAC4、
Aw7NAC4、 Aw8NAC4、 Aw9NAC4、 Aw10NAC4、
Aw11NAC4 (表2)。对11类野生种和4类栽培种NAC4
基因进行核苷酸序列分析(图5), 发现核苷酸序列共
有 58个 差异 位 点 , 其 中 有 53个 是 SNP位点 ,
Aw5NAC4在862 bp处存在6个核苷酸序列的插入变
异, Aw9NAC4、Aw10NAC4在911 bp处存在6个核苷酸
序列的插入变异。
2.7 花生野生种和栽培种 NAC4编码蛋白的氨基
酸序列分析
花生野生种NAC4的11条DNA序列Aw1NAC4~
Aw11NAC4分别编码蛋白AW1~AW11 (图6)。AW2、
AW3、AW6的氨基酸序列完全一致, AW9和AW10的
氨基酸序列也完全一致。AW5、AW9和AW10蛋白包
含351个氨基酸, 其他蛋白均为349个氨基酸。栽培
种4个NAC4基因编码蛋白的氨基酸序列差异位置分
别是第174位、244位和311位, 野生种第174位的氨
基酸与栽培种的A1和B1相同, 在244位的氨基酸与
栽培种的B1相同, 在311位与栽培种A1、A2相同的
野生种基因的有9个, 与栽培种的B1、B2相同的野生
种基因有2个。栽培种与野生种基因间存在差异的其
他10个氨基酸位点, 均表现为少数野生种基因的氨
基酸改变。推测a1和b1基因编码蛋白的功能与野生
种更接近。
3 讨论
花生栽培种(Arachis hypogaea L.)是异源四倍体
(AABB), 一般认为栽培种是由2个具有不同染色体
组的二倍体野生种自然杂交的杂种, 再经一次性加
倍事件进化形成[23]。本研究从每个栽培品种中克隆
得到AhNAC4的2条DNA序列, 依据核苷酸序列差异
第 1期 李 文等: 花生转录因子基因 NAC4的等位变异分析 37
(图 5)
38 作 物 学 报 第 41卷
图 5 野生种及栽培种 NAC核苷酸序列的对比分析
Fig. 5 Comparison of NAC nucletoide sequences in Arachis species
图 6 花生野生种和栽培种 NAC4的氨基酸序列比较
Fig. 6 Alignment of amino acid sequences of NAC4 in Arachis species
将来自32个栽培品种的4类AhNAC4命名为a1、a2、
b1和b2, 每个品种包含两类基因, 其中一类基因是
a1或a2, 另一类基因b1或b2, a1和a2不会在同一品
种内出现, b1和b2也不会在同一品种内出现, 据此
判断, a1和a2是来自同一染色体组的等位基因, b1和
b2是来自另一个染色体组的等位基因。野生种和栽
培种NAC4编码蛋白的氨基酸序列比较(图6)显示, a1
和b1基因编码蛋白的功能与野生种更接近。
本试验选用的32个花生品种分别于2011—2012
年进行了抗旱性鉴定, 抗旱等级的划分依据品种的
第 1期 李 文等: 花生转录因子基因 NAC4的等位变异分析 39
抗旱系数(drought resistance coefficient, DC), 抗旱
系数的计算公式为DC=Yd/Yp, 式中Yd为干旱胁迫下
产量或生物量, Yp为非胁迫下产量或生物量, 抗旱系
数是整株形态及生理生化性状对干旱综合反应的结
果, 是对品种综合抗性的评价[24-26]。作物的抗旱性
是多基因控制的数量性状, 受作物的形态特征、组
织器官结构、生理生化性状及抗旱相关基因的转录
与蛋白质翻译表达水平等诸多因素的控制, 不同品
种的抗旱机制存在差异[27-29]。本研究测试的32个品
种中, 基因型为a1a1b1b1和a1a1b2b2的品种共15份,
为强抗旱或中度抗旱。基因型为a2a2b1b1的品种共
15份, 包含了强、中、弱三种抗旱类型, 并且在所检
测的32个品种中 , 抗旱性弱的品种的基因型均为
a2a2b1b1。基因型为a2a2b2b2的品种只有2份, 山花
13号为抗旱品种 , 79266为中度抗旱品种 , 且79266
抗旱系数处于中度抗旱和弱抗旱性的临界值[20,30]。
推测栽培种a1基因编码蛋白对基因型为a1a1b1b1和
a1a1b2b2花生品种抵御干旱起关键作用, 基因型为
a2a2b1b1和a2a2b2b2的抗旱品种可能对其他抗旱基
因的表达起关键作用。
本研究中AhNAC4属于AtNAC3亚族 , AtNAC3
亚族基因与植物的抗旱性密切相关。序列比对发
现AtNAC3亚族存在一个同源性较高的区域 , 位于
第200~210个氨基酸处(图7)。在A1、A2、B1、B2
蛋白存在差异的第174个氨基酸位点保守性弱 , 在
拟南芥的ANAC055和AtNAC3中为M(甲硫氨酸 ),
在GmNAC3和GmNAC4中为A (丙氨酸)和V (缬氨
酸); 第244个和第311个氨基酸也是多变的。这3个
氨基酸位点对花生抵御干旱所起的作用尚需进一
步研究。
图 7 AtNAC3亚族氨基酸序列比对
Fig. 7 Comparison of amino acid sequence of AtNAC3 subfamily
黑框代表 AhNAC4蛋白的氨基酸差异位点。
The different sites of amino acid are shown by black frame.
花生野生种对环境具有广泛的适应性, 在各种
环境胁迫条件下, 比栽培品种具有更强的环境适应
和逆境耐受能力, 并且在形态学和分子水平都有丰
富的变异, 具有抗旱, 抗盐、抗病虫害等多种抗逆性
状, 是栽培种遗传改良极其宝贵的基因资源[31-32]。
陈本银等[33]从花生野生种中发掘了15份高抗青枯病
的种质, 抗病材料频率达到19%。本研究从19个野生
种中分离得到 11类NAC4的DNA序列 (Aw1NAC4-
Aw11NAC4), 相应编码蛋白有8类, 其中AW5、AW9、
AW10蛋白比其他蛋白多2个氨基酸 , 花生野生种
NAC4基因具有丰富的序列多态性 , 为进一步研究
不同核苷酸序列NAC4基因的功能和野生种花生抗
旱种质的发掘提供了参考。
4 结论
AhNAC4 (HM776131.1)编码的蛋白属于干旱胁
迫响应的转录因子。AhNAC4全长为 1244 bp, 编码
区长度为 1050 bp, 含有 2个内含子, 分别位于 182~
279 bp和 547~642 bp处, 编码蛋白包含 349个氨基
酸。从 32个栽培品种分离的 4类 AhNAC4中, a1和
a2为等位基因, 二者在 717 bp处存在 1个碱基差异,
引起第 174 位氨基酸的改变, b1 和 b2 为等位基因,
二者存在 14个 SNP位点, 其中 717 bp和 924 bp处
碱基的差异引起第 174 位和 244 位氨基酸的改变。
推测栽培种 a1 基因编码蛋白对花生抵御干旱起关
键作用。从 19 个野生种中分离得到 11 类 NAC4 的
DNA序列, 其中 Aw1NAC4与栽培种 b1、b2的核苷
酸序列同源性最高, Aw2NAC4与栽培种 a1、a2核苷
酸序列同源性最高。a1 和 b1 基因编码蛋白功能与
野生种的相似性大于 a2和 b2基因。
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