全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(5): 764−771 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31000738), 国家科技支撑计划项目(2007BAD49A01)和“农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室”
资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 屈冬玉, E-mail: dyqu@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82105943
第一作者联系方式: E-mail: xujf@caas.net.cn
Received(收稿日期): 2010-11-18; Accepted(接受日期): 2011-03-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00764
利用磁珠富集马铃薯 BAC 文库中 NBS-LRR 类晚疫病抗性基因
徐建飞 金黎平 庞万福 卞春松 段绍光 刘 杰 黄三文 屈冬玉*
中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081
摘 要: 栽培马铃薯是高度杂合的四倍体作物, 利用传统的基因克隆方式进行晚疫病抗性基因分离难度很大。然而,
晚疫病抗性基因具有序列保守性, 属于 NBS-LRR类基因。本研究中, 根据晚疫病抗性基因 R3a家族的序列比对结果
设计 R3a基因家族的保守探针, 并将含有 R3a基因的 BAC SH23G23部分酶切成 7~11 kb DNA片段。通过结合保守
探针的磁珠系统对上述 7~11 kb DNA片段进行 R3a基因分离, 将磁珠富集的片段克隆到双元载体 pBINPLUS上。通
过阳性克隆和菌落 PCR鉴定表明, 含有 R3a基因的克隆比率达到 82.76%, 相对于磁珠系统富集前, 提高 R3a基因比
率近 19倍。本研究建立了抗病基因及其同源序列的磁珠分离系统, 为分离马铃薯等多倍体作物中具有保守结构的基
因提供了实验基础。
关键词: 马铃薯; 晚疫病; 抗性基因; 磁珠富集
Isolation of NBS-LRR Late Blight Resistance Genes from Potato BAC Library
by System of Magnetic Separation
XU Jian-Fei, JIN Li-Ping, PANG Wan-Fu, BIAN Chun-Song, DUAN Shao-Guang, LIU Jie, HUANG
San-Wen, and QU Dong-Yu*
Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Cultivated potato (Solanum tuberosum) is an auto-tetraploid crop, which is very difficult to isolate late blight resistance
genes. Nevertheless, it is discovered that there is conseved NBS-LRR domain among late blight resistance genes. In this study,
conserved probes of R3a late blight resistance genes family were developed by alignment of sequences. And then, the DNA of
BAC SH23G23 containing the R3a gene was partially digested into 7–11 kb fragments. By magnetic separation system combined
with conserved probes, the 7–11 kb fragments were enriched and cloned into binary vector pBINPLUS. Through identification of
positive clones and colony PCR, the ratio of clones including R3a gene to all positive clones reached 82.76%, which was nearly
19 times higher than enrichment before. The system of magnetic separation for R genes and their analogs established in this study
provides a new strategy for conserved domain genes cloning from polyploid crops.
Keywords: Potato; Late blight; Resistance genes; Magnetic separation
栽培马铃薯是高度杂合的四倍体作物 (2n=
4x=48)。四体遗传特性表明在减数分裂过程中, 有 4
条同源染色体发生配对, 而且高度异质的远缘杂种
常导致在一个遗传位点存在多种等位基因组合形
式[1]。
在马铃薯基因克隆方面 , 图位克隆 (positional
cloning)、同源克隆 (homology-based cloning)和
cDNA克隆是通常的策略。对于图位克隆, 以细菌人
工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)末端
测序为基础的染色体步行(chromosome walking)要
求在 BAC末端尽可能低地出现重复序列, 以防止步
行方向错误。图位克隆在二倍体马铃薯基因克隆方
面应用较多, 然而, 对于四倍体马铃薯来说, 存在 4
条同源染色体, 这就使 BAC末端出现重复序列的概
率大增, 导致染色体步行困难, 以致无法构建物理
图谱和完成最终的基因克隆。同源克隆是指依据模
第 5期 徐建飞等: 利用磁珠富集马铃薯 BAC文库中 NBS-LRR类晚疫病抗性基因 765


式植物相关基因序列或基因家族序列保守型, 进行
引物或探针设计, 从而达到目标基因的分离。cDNA
克隆是基于 RNA 表达差异而获得目标基因 EST 进
而获得基因全长的克隆策略。然而同源克隆和
cDNA 克隆虽然克隆效率较高, 但常涉及 PCR 扩增
反应, 易导致碱基突变而造成分离的目标基因序列
的不准确性。在四倍体马铃薯上, 将目标基因序列
的保真性和基因克隆的高效性相结合具有重要的意
义, 磁珠吸附技术的出现为此提供了技术基础。磁
珠表面共价结合链霉亲和素 (streptavidin), 吸附探
针连接生物素(biotin), 利用生物素与链霉亲和素间
特异的高亲和力可以快速、高效地分离与探针互补
的目标 DNA片段。
近年来, 从植物中克隆了大量抗病 R 基因, 其
中最大一类 R基因编码 NBS-LRR (nucleotide bind-
ing site plus leucine-rich repeat)类结构域。按照 N
末端结构的不同分为 TIR-NBS-LRR 和 CC-NBS-
LRR两种类型[2]。目前, 已克隆的晚疫病抗性基因
R1、R3a、RB/Rpi-blb1、Rpi-blb2和 Rpi-blb3 都属
于 CC-NBS-LRR 类型[3-7], 这些基因在 CC-NBS 结
构域中是高度保守的。本研究利用晚疫病抗性基因
及其同源序列保守的 CC-NBS 结构域设计生物素
标记探针 , 利用包被链霉亲和素的磁珠来富集马
铃薯 BAC 文库中抗病基因同源片段 (resistance
gene analogs, RGAs), 以期为多倍体植物抗病基因
克隆提供探索和尝试。
1 材料与方法
1.1 供试材料及 DNA处理
BAC SH23G23 源自马铃材料 SH83-92-488
BAC 文库[8], 含有晚疫病抗性基因 R3a。参照《分
子克隆》[9]提取 BAC DNA。
双元载体 pBINPLUS DNA用 BamH I 37℃酶切
2 h, 反应体系为 5 µg pBINPLUS DNA, 10×BamH I
buffer 10 µL, 100× BSA 1 µL, 20 U BamH I, 用水补
齐反应体积至 100 µL。利用 Qiangen试剂盒纯化酶
切产物, 并用去磷酸化酶 CIP 37℃反应 1 h, 反应体
系为纯化后的、BamH I酶切的 pBINPLUS DNA 1.2
µg, 10×CIP buffer 3.5 μL, 2 U CIP, 用水补齐反应体
积至 35 µL。
1.2 探针设计
依据 70条马铃薯晚疫病抗性基因R3a及其同源
家族基因的序列信息比对结果 (私人通讯 ), 利用
Primer 5.0 软件在它们的保守区域 CC 区和 LRR 区
设计保守的 2 个上游引物(序列互补)和 2 个下游引
物(序列互补), 共形成 4对引物组合。引物序列如表
1所示, 引物均由上海生物工程技术公司合成。
利用磁珠对 4 对引物组合的扩增产物进行吸附
(方法见下文), 获得结合在磁珠上的、生物素标记的
4种探针 Probe-A、Probe-B、Probe-C和 Probe-D。

表 1 R3a 基因家族 CC 和 LRR 区域保守引物及序列信息
Table 1 Sequences of conserved primers for R3a family
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
生物素标记
Biotin labeled
(Y/N)
保守结构域位置
Position of conserved domain
(bp)
扩增产物名称及长度
PCR products and length
(bp)
Probe-1F GGYAAGACAACACTTGCTAAAGC Y CC 635-657
PE-1R AGTTGTCATTCCACACATCATCC N CC 861-883
Probe-A 249
Probe-1R GCTTTAGCAAGTGTTGTCTTRCC Y CC 635-657
PE-1F AAGCAACCAGCAAGTAAGTGACC N CC 330-352
Probe-B 328
Probe-3F GCCAGCACTAGGACARCTYCCTT Y LRR 2415-2437
PE-3R CATTGCTTCCACTCCGGCATATC N LRR 2554-2576
Probe-C 162
Probe-3R AAGGRAGYTGTCCTAGTGCTGGC Y LRR 2415-2437
PE-3F TGTGAAGGCAAAGATGAGGGAGA N LRR 2169-2191
Probe-D 269

1.3 磁珠准备
取一管有活性的磁珠(购自 Promega 公司), 通
过轻弹管底悬浮 0.6 mL 管中的磁珠直至其完全分
散。将管放入磁力架上直至磁珠被吸附到管壁一侧
(大约 30 s)。小心吸去上清液, 勿离心磁珠。0.5×SSC
洗涤磁珠 3 次(每次 300 μL), 每次洗涤后用磁力架
捕获磁珠, 小心吸去洗涤液。在 100 μL 0.5×SSC中
悬浮磁珠。
1.4 探针杂交
将 20 μL结合在磁珠上的探针(50 pmol μL−1)、
20× SSC 150 μL、10% SDS 5 μL、水 25 μL和 80 ng
μL−1 7~11 kb目的 DNA 200 μL混合, 制成杂交混合
766 作 物 学 报 第 37卷

液, 94℃变性 15 min, 不时颠倒混匀。将变性好的杂
交混合液, 直接置相应杂交温度的水浴锅中杂交 1 h,
不时颠倒混匀。然后缓慢冷却至室温。
1.5 磁珠吸附
将含有杂交液的离心管置磁力架上 , 于磁场
中吸附磁珠 , 小心吸走无磁珠干扰的上清液(保存
好此步获得的上清液, 标为为 E1), 直到确信吸附
完全和 DNA 达到满意溶解。用 0.1×SSC 洗涤磁珠
4次(每次 300 μL)。每次洗涤都需轻弹管底直至全
部磁珠悬浮, 然后置磁力架上, 在不干扰磁珠的情
况下吸去上清液(保存好 4 次洗涤获得的洗液, 标
为 E2)。
1.6 溶解 DNA
加 100 μL无菌水到含磁珠的管中, 轻弹管底悬
浮磁珠。94℃水浴变性 10 min, 磁力架快速吸附磁
珠, 将 DNA溶解液转到灭菌管中, 不要丢弃磁珠。
如果有磁珠被转移到 DNA 溶解液中 , 通过 4℃
9 000×g离心 5~10 min除去。用 150 μL灭菌水悬浮
磁珠, 重复稀释步骤。重复磁珠吸附步骤, 将新的溶
解液加到上步的溶解液中(总体积 250 μL)。将磁珠
保存在 100 μL 灭菌水中, 直到确认 DNA 完全溶解
为止。将 250 μL 溶解液与过互补探针柱的 250 μL
溶解液合并, 94℃水浴变性 10 min, 过 DNA纯化柱,
洗脱液 200 μL, 将异丙醇沉淀浓缩成 30 μL, 用琼脂
糖凝胶电泳检测片段大小和浓度。
1.7 RGAs与 pBINPLUS载体连接
连接体系及反应条件为 60 ng μL−1 DNA 5 μL,
30 ng μL−1 pBINPLUS 1 μL, 连接 buffer 1 μL, 3 U
μL−1 T4连接酶(Tiangen公司) 1 μL, 用水补至 10 μL,
16℃连接 16 h, 65℃热失活 10 min。取 millipore的
分子透析膜 1/4, 光面朝上, 将其置装好超纯水的小
型平皿中, 待膜全部铺展开来后, 将需要脱盐的 10
µL样品点样到膜上, 脱盐 1 h。脱盐后, 一般体积会
缩小为 6~7 µL。
1.8 转化及菌落 PCR
参照《分子克隆》[9]进行电击转化大肠杆菌及
菌落 PCR。
1.9 阳性克隆鉴定
利用质粒小提法提取平板中白斑质粒, 对质粒
DNA进行双酶切以验证阳性克隆率。酶切体系及反
应条件为 200 ng质粒 DNA, 1 U EcoR I, 1 U Xba I,
10×buffer 1.5 μL, 100×BSA 0.15 μL, 用水补至 15 μL,
37℃温浴 1 h, 琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 R3a家族保守探针的设计及延长探针的制备
根据已克隆的晚疫病抗性基因 R3a 及其同源序
列的比对结果, 在其 CC 区域设计 2 条引物, 在其
LRR 区域设计两条引物, 这 4 条引物均为生物素标
记(表 1, Probe开头)。考虑到这些引物长度过短, 无
法吸附 7~11 kb 长度的部分酶切片段, 所以设计相
应的在 R3a 基因及其同源序列中保守的上游或下游
引物(表 1, PE开头)。利用这 4对引物组合, 以 BAC
SH23G23 DNA为模板制作磁珠吸附的延长探针(图
1)。根据对延长探针的琼脂糖凝胶检测, 可知制备的
探针长度符合设计的长度要求, 即 Probe-A 249 bp、
Probe-B 328 bp、Probe-C 162 bp和 Probe-D 269 bp。

图 1 制备的延长探针检测
Fig. 1 Detection of extended probes
M: DNA marker I (本文 Marker系列均产自 Tiangen公司)。
M: DNA marker I (product of Tiangen).

对制备的双链探针进行胶回收, 然后进行磁珠
吸附, 以去除未标记生物素单链 DNA。通过磁珠吸
附, 生物素标记的单链探针被吸附在包被链霉亲和
素的磁珠上 , 待以此生物素标记的单链探针吸附
BAC DNA的部分酶切片段。
2.2 BAC DNA部分酶切
对于已克隆的晚疫病抗性基因及其类似物序列
分析表明, 完整的基因长度都在 10 kb以下, 所以我
们对包含 R3a基因的 BAC SH23G23 DNA进行部分
酶切, 以期获得 7~11 kb的部分酶切片段, 供磁珠富
集系统吸附。为了确定部分酶切的反应体系, 首先
做了酶切梯度试验, 即在等量DNA和相同反应时间
的条件下, 确定合适的限制性内切酶酶量。图 2 表
明, 在 10 μL反应体系下, 400 ng DNA模板, Sau3A I
酶量以 1/16 U消化为适。
利用酶梯度实验确定的反应体系 , 对 50 μg
BAC DNA 进行部分消化, 利用 Qiagen 试剂盒对消
化产物、进行凝胶回收。如图 3 所示, 回收片段大
小基本在 7~11 kb之间, 符合设计要求。
第 5期 徐建飞等: 利用磁珠富集马铃薯 BAC文库中 NBS-LRR类晚疫病抗性基因 767



图 2 SH23G23 DNA 部分酶切梯度检测
Fig. 2 Detection of partial digestion for SH23G23 DNA
M: marker DL15000, DNA: 400 ng/泳道。1: Sau3A I 2 U; 2: Sau3A
I 1 U, 以后泳道酶量顺次减半。
M: marker DL15000, DNA: 400 ng/lane. 1: Sau3A I 2 U; 2: Sau3A
I 1 U, 1/2 enzyme amount by turn.

图 3 回收的部分酶切片段检测
Fig. 3 Detection of partial digestion fragments by gel extraction
M: marker DL15000; 1: λDNA 50 ng; 2: λDNA 100 ng; 3: λDNA 150
ng; 4: λDNA 200 ng; 5: 回收的部分酶切片段。
M: marker DL15000; 1: λDNA 50 ng; 2: λDNA 100 ng; 3: λDNA 150
ng; 4: λDNA, 200 ng; 5: partial digestion fragments by gel extraction.

2.3 载体与部分酶切片段的连接、转化与菌落
PCR
双元载体 pBINPLUS, 可同时转化大肠杆菌和
农杆菌, 便于文库构建和基因转化。限制性内切酶
BamH I与 Sau3A I为同尾酶, 用其消化 pBINPLUS,
便于回收的部分酶切片段与载体连接。首先, 利用
BamH I对载体 pBINPLUS进行完全酶切, 酶切产物
经 Qiagen质粒试剂盒纯化后进行去磷酸化反应, 去
磷酸化产物同样经试剂盒纯化, 制得供部分酶切的
BAC DNA片段连接的载体(图 4)。

图 4 经 BamH I 和 CIP 消化的 pBINPLUS 检测
Fig. 4 Detection of pBINPLUS digested by BamH I and CIP
M: marker DL15000; 1: λDNA 50 ng; 2: λDNA 100 ng; 3: λDNA
150 ng; 4: λDNA 200 ng; 5: 未经消化的 pBINPLUS; 泳道 6:
BamH I和 CIP消化的 pBINPLUS。
M: marker DL15000; 1: λDNA 50 ng; 2: λDNA 100 ng; 3: λDNA
150 ng; 4: λDNA, 200 ng; 5: pBINPLUS; 6: pBINPLUS digested
by BamH I and CIP.

将经 BamH I 消化和去磷酸化的 pBINPLUS 与
经 Sau3A I部分消化的 7~11 kb SH23G23片段连接,
连接产物经透析去盐后电击转化大肠杆菌感受态细
胞DH5α, 转化菌落涂板培养后, 白斑比率占 90%以
上。挑取阳性克隆(白斑)即 BAC SH23G23 亚克隆,
进行 R3a特异引物菌落 PCR, SH23G23 DNA及其菌
液为阳性对照, pBINPLUS DNA及蓝斑为阴性对照。
结果表明, 在所有 135个阳性克隆中, 有 6个克隆含
有 R3a (图 5), 含 R3a 的克隆占所有克隆的比率为
4.44%。

图 5 对部分 SH23G23 亚克隆进行 R3a 菌落 PCR 检测
Fig. 5 Detection of R3a colony PCR for sub-clones of SH23G23
M: marker II; CK+: 阳性对照; CK–: 阴性对照; 1~67: 为 SH23G23亚克隆。
M: marker II; CK+: positive CK; CK–: negative CK; 1–67: sub-clones of SH23G23, respectively.
768 作 物 学 报 第 37卷

2.4 BAC亚克隆酶切鉴定
为了验证 SH23G23亚克隆的阳性率, 用限制性
内切酶 EcoR I和 Xba I双酶切。EcoR I和 Xba I在
载体 pBINPLUS的酶切位点位于 BamH I两侧, 即如
果克隆为阳性克隆, 其提取的质粒 DNA应被这 2个
酶切出数条带, 反之阴性克隆则质粒DNA无法被切
开。对从 135 个 SH23G23 亚克隆随机挑选出来的
18个亚克隆进行质粒提取并用 EcoR I和 Xba I双酶
切, 结果如图 6所示, 阳性率 100%。

图 6 SH23G23 亚克隆 EcoR I-Xba I 酶切检测
Fig. 6 Detection of sub-clones of BAC SH23G23 digested by
EcoR I-Xba I enzyme
M: marker DL15000; CK–: 阴性对照; 1~18: 从 135个亚克隆中
随机挑选出来的亚克隆。
M: marker DL15000; CK–: negative CK; 1–18: sub-clones random
selected from 135 sub-clones.

2.5 磁珠系统吸附 BAC部分酶切片段
利用已制备好的、吸附上探针 Probe C 的磁珠
系统按照流程富集 7~11 kb SH23G23部分酶切片段,
保存好此次富集得到的磁珠 DNA溶解液。将 Probe
C探针吸附过程中的 E1上清液进行 Probe D探针吸
附, 以获得与 Probe C探针富集到的 DNA单链的互
补链。将 Probe C和 Probe D探针富集到的 DNA溶
液混合并利用异丙醇沉淀浓缩, 检测浓度及片段大
小(图 7)。结果显示磁珠系统富集到了 BAC 部分酶
切片段, 其大小也在 7~11 kb之间。
2.6 磁珠系统富集片段与载体连接及转化
对上述磁珠富集到的 SH23G23 部分酶切片段
与载体 pBINPLUS 连接, 并转化大肠杆菌感受态细
胞 DH5α。挑取阳性克隆(白斑)进行 R3a 特异引物
菌落 PCR, 以 SH23G23菌液为阳性对照, 蓝斑为阴
性对照。结果表明 , 在所挑取的 30个白斑菌落中,
有 24个菌落扩增出 R3a基因特异条带(图 8)。

图 7 磁珠系统富集到的 DNA 片段检测
Fig. 7 Detection of DNA fragments enriched by magnetic
separation
M: marker DL15000; 1: λDNA 30 ng; 2: λDNA 50 ng; 3: λDNA
100 ng; 4: 富集前的 SH23G23部分酶切片段; 5: 富集后的
SH23G23部分酶切片段。
M: marker DL15000; 1: λDNA 30 ng; 2: λDNA 50 ng; 3: λDNA
100 ng; 4: partial digestion fragments of SH23G23 before magnetic
separation; 5: partial digestion fragments of SH23G23 after mag-
netic separation.

2.7 磁珠系统对 R3a基因的富集效率
对从 30 个磁珠富集的 SH23G23 亚克隆进行质
粒提取并用 EcoR I和 Xba I双酶切(图 9), 只有一个
亚克隆为假阳性 , 其余为阳性克隆 , 阳性率
96.67%。所以含 R3a 的克隆占所有克隆的比率为
82.76% (24/29)。
通过上述实验我们可知 , 未经磁珠富集的
SH23G23 亚克隆中, 含 R3a 基因的亚克隆比率为
4.44%, 而经过包含有 R3a 基因家族保守探针的磁
珠系统富集后 , 含 R3a 基因的亚克隆比率达到
82.76%, 富集效率提高 18.64倍。
3 讨论
3.1 磁珠分离系统与栽培马铃薯基因的同源克
隆
对于栽培马铃薯来说 , 由于四体遗传的限制 ,
传统的基因克隆手段如图位克隆应用难度较大。图
位克隆(map-based cloning)又称为定位克隆(posi-
tional cloning), 是近些年来随着各种植物的分子标
记图谱相继建立而发展起来的一种基因克隆技
术[10]。染色体步移是图位克隆的关键步骤, 而染色
体步移的主要局限在于当克隆的一端是重复序列时,
步移的方向会步入歧途。对于栽培马铃薯来说, 具
第 5期 徐建飞等: 利用磁珠富集马铃薯 BAC文库中 NBS-LRR类晚疫病抗性基因 769



图 8 磁珠富集的 SH23G23 亚克隆 R3a 菌落 PCR 检测
Fig. 8 Detection of R3a colony PCR for sub-clones of SH23G23 enriched by magnetic separation
M: marker II; CK+: 阳性对照; CK–: 阴性对照; 1~30: 分别为磁珠富集的 BAC SH23G23亚克隆。
M: marker II; CK+: positive CK; CK–: negative CK; 1–30: sub-clones of BAC SH23G23 by magnetic separation, respectively.


图 9 磁珠富集的 SH23G23 亚克隆 EcoR I-Xba I 酶切检测
Fig. 9 Detection of sub-clones of BAC SH23G23 enriched by magnetic separation through digestion by EcoR I-Xba I enzyme
M: marker DL15000; CK+: 阳性对照; CK–: 阴性对照; 1~30: 从 135个亚克隆中随机挑选出来的亚克隆。
M: marker DL15000; CK+: positive CK; CK–: negative CK; 1–30: sub-clones random selected from 135 sub-clones.

有 4 条同源染色体, 对其构建基因组的 DNA 文库,
文库中必将存在大量的末端重复序列, 这就极大阻
碍了染色体步移沿着预期方向进行, 也直接限制了
图位克隆技术在四倍体马铃薯中的应用。
随着现代分子生物学的发展, 越来越多的抗病
基因得以定位和克隆。通过对这些抗病基因序列或
其编码的蛋白序列的比对和分析, 发现它们具有共
同的保守结构域, 如 NBS-LRR类型和 RLK类型[2,11]。
研究者根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具
有保守氨基酸序列的特点, 发展了一条快捷克隆基
因家族成员的新途径: 基于同源序列的侯选基因法
即同源克隆策略 (homology-based candidate gene
method)[12]。到目前为止, 已克隆的马铃薯晚疫病抗
性基因都属于 CC-NBS-LRR 类。本研究结果表明,
通过设计抗病基因相对保守引物, 结合磁珠分离系
统对抗病基因及其类似物进行富集是可行的, 富集
效率达到 82.76%。对于同源克隆来说, 首要构建同
源基因文库是其重要组成部分, 而本研究中建立的
同源基因磁珠分离系统构为建抗病基因同源文库提
供了实验基础。
3.2 磁珠分离系统的完善
磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体,
可分散于基液中形成磁性液体材料, 它兼有液体的
流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点, 纳米磁珠
很小, 但表面积大, 偶联容量高, 悬浮稳定性很好。
因其具有顺磁性, 在外磁场作用下使固液相的分离
十分简单, 可省去离心、过滤等繁杂的操作步骤, 并
可在外磁场的作用下定位[13]。对于利用磁珠分离系
统富集抗病基因及其同源序列, 有几个实验细节需
要作讨论。
770 作 物 学 报 第 37卷

3.2.1 吸附探针的长度 对于已克隆的晚疫病抗
性基因序列分析表明, 其完整的基因长度在 4~7 kb
左右。所以本研究 BAC DNA部分酶切的理想长度
设计为 7~11 kb。最初我们利用长度为 23 bp的保守
探针进行吸附 7~11 kb 的部分酶切片段, 可能由于
DNA分子复性动力学的原因, 23 bp的探针难以吸附
7~11 kb 的 DNA 片段, 造成磁珠富集产物与载体连
接后, 无法转化大肠杆菌(数据未列出)。本研究表明,
对于富集 7~11 kb的 DNA片段, 150~300 bp的探针
长度是可行的。
国内有文献报道, 利用 30 bp 的探针进行基因
组 SSR序列的富集[14], 但其富集的目的片段不超过
1 kb, 而且其富集过程中都有对基因组 DNA的 PCR
扩增环节。PCR 扩增很容易引起碱基的突变, 所以
我们构建同源基因文库中应避免 PCR环节, 以减少
对同源基因原始序列的改变而丧失基因的功能。
3.2.2 互补探针的配合使用 磁珠富集系统吸附
的原理是保守探针与其互补序列进行杂交配对, 标
记生物素的探针与包被链霉亲和素的磁珠结合, 在
磁场的作用下, 结合有探针与目的片段杂交链的磁
珠被吸附, 从而达到目的片段的分离。通过对杂交
链的变性并在磁场中洗脱, 从而收集到磁珠系统富
集的、与探针互补的目的 DNA片段。
在探针与部分酶切的 DNA 片段杂交过程中 ,
由于杂交温度是根据探针的序列确定的, 这样就可
能导致探针吸附到的只是DNA双链中的一条, 而使
其互补链留在上清液中(本研究中的 E1 上清液), 这
样就导致磁珠系统富集到的为单链 DNA, 从而导致
其无法与载体连接。为解决此问题, 我们利用第一
次吸附探针(Probe-C 探针)的互补探针(Probe-D 探针)
重新吸附 E1溶液, 从而达到对第一次富集丢失的互
补链的补充。将两次磁珠富集产物混合均匀、变性
并缓慢退火, 从而获得完整的双链目的 DNA 片段,
用于载体连接和转化。
3.2.3 载体的去磷酸化与阳性克隆比率 载体的
去磷酸化能有效地防止载体自连和环化, 但是也有
研究者认为, 去磷酸化同时使带有重组质粒的克隆
减少的情况, 而且还存在 5′端羟基会增加出现重排
或缺失克隆的频率[9]。所以人们建议, 对于带有互补
突出末端的外源 DNA 片段, 采用 α 互补(蓝白斑筛
选)进行筛选, 载体去磷酸化是不必要的。
而在本实验中 , 在载体未去磷酸化的情况下 ,
单皿转化菌落很多, 而且蓝斑比率超过 80%。对比
之下, 对于去磷酸化的载体, 虽然单皿转化菌落较
少, 但白斑比率达到 80%以上, 有助于阳性克隆的
挑取, 而且对白斑单克隆提取质粒酶切鉴定, 其阳
性率接近 100%。所以, 在构建抗病基因同源文库过
程中, 无论外源片段是黏性末端还是平末端、是否
采用 α 互补筛选, 我们建议对载体应该进行去磷酸
化处理。
4 结论
利用吸附有晚疫病抗性基因 R3a 家族保守探针
的磁珠分离系统, 能有效地富集 BAC DNA 部分酶
切片段中与吸附探针互补的目的片段。

致谢: 本实验得到华中农业大学匡汉晖博士的通讯
交流和指导, 谨表谢忱。
References
[1] Meyer R C, Milbourne D, Hackett C A, Bradshaw J E, McNichol
J W, Waugh R. Linkage analysis in tetraploid potato and associa-
tion of markers with quantitative resistance to late blight (Phy-
tophthora infestans). Mol Gen Genet, 1998, 259: 150−160
[2] Dangl J L, Jones J D. Plant pathogens and integrated defence re-
sponses to infection. Nature, 2001, 411: 826−833
[3] Ballvora A, Ercolano M R, Weiss J, Meksem K, Bormann C A,
Oberhagemann P, Salamini F, Gebhardt C. The R1 gene for po-
tato resistance to late blight (Phytophthora infestans) belongs to
the leucine zipper/NBS/LRR class of plant resistance genes.
Plant J, 2002, 30: 361−371
[4] Song J, Bradeen J M, Naess S K, Raasch J A, Wielgus S M,
Haberlach G T, Liu J, Kuang H, Austin-Phillips S, Buell C R,
Helgeson J P, Jiang J. Gene RB cloned from Solanum bulbocas-
tanum confers broad spectrum resistance to potato late blight.
Proc Nat Acad Sci USA, 2003, 100: 9128−9133
[5] van der Vossen E A, Sikkema A, Hekkert B L, Gros J, Stevens P,
Muskens M, Wouters D, Pereira A, Stiekema W, Allefs S. An an-
cient R gene from the wild potato species Solanum bulbocasta-
num confers broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans
in cultivated potato and tomato. Plant J, 2003, 36: 867−882
[6] Huang S, van der Vossen E A, Kuang H H, Vleeshouwers V G A
A, Zhang N W, Borm T J A, van Eck H J, Baker B, Jacobsen E,
Visser R G F. Comparative genomics enabled the isolation of the
R3a late blight resistance gene in potato. Plant J, 2005, 42:
251−261
[7] van der Vossen E A, Gros J, Sikkema A, Muskens M, Wouters D,
Wolters P, Pereira A, Allefs S. The Rpi-blb2 gene from Solanum
bulbocastanum is an Mi-1 gene homolog conferring broad-
第 5期 徐建飞等: 利用磁珠富集马铃薯 BAC文库中 NBS-LRR类晚疫病抗性基因 771


spectrum late blight resistance in potato. Plant J, 2005, 44:
208−222
[8] Huang S. Discovery and characterization of the major late blight
resistance complex in potato: genomic structure, functional di-
versity, and implications. the Netherlands: Wageningen Univer-
sity, 2005
[9] Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning: a Laboratory
Manual, 3rd edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 2001
[10] Coulson A, Sulston J, Brenner S, Karn J. Toward a physical map
of the genome of the nematode Caenorhabditis elegans. Proc
Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 7821−7825
[11] Shiu S, Karlowski W M, Pan R, Tzeng Y, Mayer K F X, Lia W.
Comparative analysis of the receptor-like kinase family in Arabi-
dopsis and rice. Plant Cell, 2004, 16: 1220−1234
[12] Leister D, Ballvora A, Salamini F, Gebhardt C. A PCR based
approach for isolating pathogen resistance genes from potato
with potential for wide application in plants. Nat Genet, 1996, 14:
421−429
[13] Bender K, Schneider P M. Validation and casework testing of the
BioPlex211 for STR typing of telogen hair roots. Forensic Sci Int,
2006, 161: 52−59
[14] Li D( 炟李 ), Ji K-S(季孔庶), Gong J(龚佳). Microsatellite en-
richment by magnetic beads in Pinus massoniana. Mol Plant
Breed (分子植物育种), 2007, 5(1): 141−144 (in Chinese with
English abstract)