全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(7): 1212−1220 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术发展研究计划(863计划)项目(2011AA10A104), 国家自然科学基金项目(30871553, 31000725)和武汉市学科带头人
项目(210151730564)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 胡琼, E-mail: huqiong@oilcrops.cn, Tel: 027-86711556
第一作者联系方式: E-mail: 41771325@163.com
Received(收稿日期): 2011-11-15; Accepted(接受日期): 2012-02-22; Published online(网络出版日期): 2012-04-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120423.1121.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01212
油菜 Nsa CMS候选恢复基因的来源及表达
张 洪 付 丽 李云昌 刘 佳 梅德圣 彭鹏飞 陈玉峰 胡 琼*
中国农业科学院油料作物研究所 / 国家油料作物改良中心 / 农业部油料作物生物学与遗传育种重点开放实验室, 湖北武汉 430062
摘 要: 根据同源序列法克隆的 Nsa CMS候选恢复基因 PPR618的序列, 采用 PCR方法在 Nsa CMS不育系、恢复
系、原始体细胞杂交亲本以及其他甘蓝型油菜品种中共克隆出 22个同源序列。序列分析表明, 野芥亲本野油 18、甘
蓝型油菜亲本中双 4号各含有 2个同源序列, 而 Nsa CMS 4个恢复系则分别含有 3、1、1、1个同源序列。恢复系中
候选恢复基因的序列与野芥亲本野油 18的同源序列的一致性在 93%以上, 其中恢 1、恢 3和恢 4中至少有一个同源
序列与野油 18的第 1个同源序列完全相同, 恢 2中的同源序列与野油 18的第 2个同源序列完全相同; 但与甘蓝型油
菜的同源序列一致性均低于 80%, 说明候选恢复基因来源于新疆野芥, 而不是甘蓝型油菜。除了原来的 PPR618 外,
获得了 3 个来源于恢复系的新候选恢复基因。候选恢复基因在序列上与萝卜和矮牵牛的恢复基因一致性较高。半定
量 RT-PCR分析表明, 候选恢复基因在恢复系多个组织中都有表达, 但在根、茎中表达量特别少。其表达量随着营养
器官到生殖器官的发育逐渐升高, 最高的是在 1.5~2.5 mm的花蕾中, 即雄性败育关键时期。但不育系中的同源基因
在茎中的表达量则相对高于其他组织。
关键词: Nsa CMS; 恢复基因; 同源序列; 表达
Origin and Expression of Nsa CMS Candidate Restorer Gene
ZHANG Hong, FU Li, LI Yun-Chang, LIU Jia, MEI De-Sheng, PENG Peng-Fei, CHEN Yu-Feng, and HU
Qiong*
Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Oil Crops Improvement / Key Laboratory for Biologi-
cal Sciences and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China
Abstract: Nsa cytoplasmic male sterility (CMS) is a novel CMS system developed by somatic hybridization between Brassica
napus and Sinapis arvensis. Cloning of the restorer genes for Nsa CMS is important for both the development of better restorers
and the mechanism understanding of fertility restoration. A candidate restorer gene named PPR618 of Nsa CMS was cloned based
on homologue sequencing strategy previously. In this study, based on the sequence information of PPR618, 22 homologous se-
quences were identified in Nsa CMS male sterile line, Nsa CMS restorer lines, the original fusion parents which gave rise to Nsa
CMS and several other B. napus lines as well as one B. oleracea and one B. rapa accessions. Sequence analysis showed that there
were two PPR618 homologues in each of the fusion parental lines, S. arvensis var. Yeyou 18 and B. napus var. Zhongshuang 4,
whereas there were three, one, one, and one PPR618 homologues in the four restorers, Hui 1, Hui 2, Hui 3, and Hui 4, respectively.
The identity of the homologous genes in restorers was above 93% to those in Yeyou 18, but less than 80% to those in Zhong-
shuang 4, implicating the candidate restorer genes of Nsa CMS originated from S. arvensis. Both homologues in S. arvensis were
found in the restorers, one in Hui1, Hui 3, and Hui 4, the other in Hui 2. Besides PPR618, three new candidate restoring genes
were identified. The homologous genes from restorers were also found to have relations with the restoring genes for CMS system
of radish and petunia. Semi-quantitative RT-PCR results showed that the candidate restoring gene expressed in all tested organs.
The gene expression gradually increased along with the developmental process from vegetative to reproductive stages, peaked in
the bud of 1.5–2.5 mm in diameter, and slumped in roots and stems. In contrast, the highest expression of homologous gene in
male sterile line was detected in stems.
Keywords: Nsa CMS; Restorer gene; Homologous sequence; Expression
第 7期 张 洪等: 油菜 Nsa CMS候选恢复基因的来源及表达 1213


细胞质雄性不育 (cytoplasmic male sterility,
CMS)是作物杂交育种和杂种优势利用的重要工具,
在主要农作物产量改良中具有重要作用。野芥细胞
质雄性不育系(Nsa CMS)是以甘蓝型油菜(Brassica
napus)品种中双 4号和新疆野芥(Sinapis arvensis)种
质资源野油 18为亲本进行体细胞杂交, 从杂种中选
取雄性不育株做母本, 以中双 4 号为轮回亲本回交
多代创建的异源细胞质雄性不育系 [1]。研究表明 ,
Nsa CMS与油菜中原有的 Pol CMS、Ogu CMS、nap
CMS 等细胞质雄性不育系不同, 是一种新型油菜细
胞质雄性不育系统[2]。在甘蓝型油菜品种中没有找
到 Nsa CMS的恢复系, 但利用同一体细胞杂交组合
的可育杂种自交后代株系与不育系测交, 鉴定出了
稳定的恢复系。该恢复系为附加了 2 条新疆野生油
菜染色体的甘蓝型油菜二体附加系, 并具有抗菌核
病、抗裂角等优良性状[3]。
细胞质雄性不育的育性恢复是由细胞核中的恢
复基因控制的。近年来, 恢复基因的克隆已经成为
细胞质雄性不育的研究热点。Cui 等[4]早在 1996 年
运用转座子标签法克隆了玉米的恢复基因 Rf2, Rf2
编码线粒体乙醛脱氢酶 (aldehyde dehydrogenaes,
ALDH), 该酶可以克服因代谢紊乱而造成的雄性不
育, 从而使育性恢复。Bentolila 和 Hanson[5]用图位
克隆法克隆了矮牵牛的恢复基因 Rf, 其编码产物为
一个含 14个 PPR基序的线粒体定位蛋白, 在其与线
粒体 CMS 基因 pcf 的互作中, 通过降低 pcf 转录本
的丰度抑或降低 PCF 蛋白的积累而调节 pcf 基因的
表达。Brown 等[6]从萝卜中克隆了一个细胞质雄性
不育恢复基因 Rfk1(Rfo), 该基因编码产物为含有 16
个 PPR 基序的线粒体定位蛋白 ORF687, 转基因试
验证明它能够减少 CMS 相关蛋白 ORF125 和
ORF138的丰度, 以影响育性。Uyttewaal等[7]鉴定出
萝卜 CMS的恢复基因 PPR-B, 它通过调控细胞质雄
性不育基因 orf138的 mRNA的翻译, 来控制雄性不
育。水稻BT型CMS恢复基因座 Rf-1的克隆由Komori
等[8]和 Akagi[9]等完成 , 该基因座上有 2个恢复基因
Rf1a 和 Rflb, 都编码 PPR 蛋白, 分别通过核苷酸内切
酶裂解双顺反子 B-atp6/orf79的mRNA来阻止ORF79
蛋白的产生使育性恢复。Jordan 等[10]报道了高粱的恢
复基因座Rf2, 该基因座上的PPR蛋白和水稻Rf1上的
PPR蛋白在序列上具有高度一致性。
PPR 基因家族是一个新基因家族, 其结构特点
是以 35 个简并氨基酸为基序连续排列组成蛋白质,
具有 RNA 结合活性, 在 RNA 代谢的整个过程如
RNA转录、翻译、剪接、编辑等过程中发挥重要作
用[11]。基于已克隆的 CMS 恢复基因大都编码 PPR
蛋白的特点 , 郝建轶等 [12]利用同源序列法从 Nsa
CMS的恢复系中克隆了一个编码 618个氨基酸、含
有 15 个 PPR 基序的 PPR 基因(PPR618), 利用该基
因的全长 cDNA序列(包含 185 bp的 5′-UTR, 182 bp
的 3′-UTR)设计的 PCR引物只在野油 18、Nsa CMS
的恢复系及育性恢复后的可育株中扩增出大小一致
的片段, 因此认为与 Nsa CMS的育性恢复有关, 被
确定为 Nsa CMS育性恢复候选基因。但在通过转基
因方法进行该基因的功能验证时 , 发现利用去掉
UTR区域的编码区序列设计引物可以在不育系及其
他甘蓝型油菜品种中扩增出长度相近的片段, 说明
甘蓝型油菜品种中存在该基因的同源基因。为了探
明该候选恢复基因的来源及其同源基因的进化情况,
本研究利用常规 PCR技术, 在由体细胞杂种衍生而
来的 Nsa CMS的 4个恢复系、原始体细胞杂交亲本
野芥资源野油 18和甘蓝型油菜品种中双 4号以及甘
蓝、白菜和其他甘蓝型油菜品种中扩增同源序列并
进行分析, 同时采用 RT-PCR 技术分析该候选恢复
基因在恢复系各个组织中的表达及其同源基因在不
育系各个组织中的表达, 为进一步验证该候选恢复
基因的功能和研究恢复基因育性机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
体细胞杂交原始亲本甘蓝型油菜 (Brassica
napus L.)品种中双 4号、新疆野生油菜(Sinapis ar-
vensis)资源野油 18; 利用中双 4 号保持的 Nsa 细胞
质雄性不育系(Nsa CMS); Nsa CMS的恢复系(恢 1、
恢 2、恢 3、恢 4); 甘蓝(B. oleracea); 白菜(B. rapa
pekinensis); 甘蓝型油菜品种中双 7号、中双 11。所
有试验品种都来自中国农业科学院油料作物研究所
油菜遗传育种研究室。
1.2 基因组 DNA和 RNA提取
油菜种子在培养皿中发芽, 一周后参照 Saghai-
Maroof 等[13]的 CTAB 法用幼苗提取基因组 DNA。
油菜花期田间取恢 2及不育系的各个组织(根、茎、
叶、1.5 mm以下小花蕾、1.5~2.5 mm花蕾、2.5 mm
以上大花蕾、花)立即投入液氮中, 放–70℃冰箱中保
存, 用天根生化公司的 RNA 提取试剂盒“RNAprep
pure Plant Kit (DP432)”提取各组织 RNA。
1214 作 物 学 报 第 38卷

1.3 候选恢复基因 PPR618同源序列克隆
根据候选恢复基因 PPR618 序列, 应用 Primer
Premier 5.0 设计 2 对引物, 618R1: 5′-TACGCGG
GGAGAGAAGCTTGTCTC-3′和 618F1: 5′-AGACAA
AGTCCTGGTTAGTGTGTTATGATG-3′; 618R2: 5-G
ACATCTAGAATGTTGTGTCGGGGAATGGT-3 和
618 F2: 5-GACGAGCTCCTAAGAAAGCATATCCA
G-3, 引物由武汉博越公司合成。其中 618R1 和
618F1是以含 UTR区的 PPR618全长 cDNA序列设
计的, 扩增片段含有 UTR 区域, 只能在野芥和恢复
系中扩增出片段, 只用于扩增野芥及恢复系。618R2
和 618F2则是以PPR618编码区序列设计的, 可以在
其他材料中扩增出同源片段 , 用于其他材料的扩
增。采用 TaKaRa的高保真酶“PrimeSTAR HS DNA
Polymerase”, 反应总体积为 50 μL, 包含: 5×Prime
STAR buffer (Mg2+ plus) 10 μL、2.5 mmol L–1dNTPs
混合物各 4 μL、10 mmol L–1 Primer1和 Primer2各 1
μL、200 ng μL–1模板 DNA 2 μL、2.5 U μL–1 Prime
STAR HS DNA聚合酶 0.5 μL、灭菌蒸馏水 31.5 μL。
PCR程序为 95℃预变性 5 min; 94℃变性 10 s, 64℃
退火 15 s, 72℃延伸 4 min, 35个循环; 72℃延伸 10
min; 最后 12℃保存。用北京百泰克生物公司的胶回
收试剂盒回收 PCR产物, 并加 A尾处理, 反应体系
含 DNA 36 μL、Fermentas buffer 5 μL、MgCl2 5.5 μL、
200 mmol L–1 dNTPs 1 μL、1 U μL–1 Fermentas DNA
Taq聚合酶 2.5 μL, 置 72℃反应 15 min (PCR仪控
温)。加 A尾后将产物连接至载体 PEASY-T1载体(全
式金 , 北京 ), 并转化大肠杆菌 (Escherichia coli)
DH5α感受态细胞, 每份材料挑取至少 5个阳性克隆
送华大基因测序。
1.4 同源序列的生物信息学分析
采用 DNAMAN 软件进行核苷酸序列比对以及
氨基酸序列预测, NCBI ORF Finder在线预测开放阅
读框 , ScanProsite (http://prosite.expasy.org/scan
prosite/)在线预测结构域, NCBI BlastP 搜索数据库
中的同源序列, ClustalW 软件对预测的氨基酸序列
进行多序列比对, MEGA5.0 软件构建系统发育树,
Neighbor-Joining (NJ)法的 Complete Deletion模式建
树, 用 Bootstrap进行检验, 并重复 1 000次。
1.5 RT-PCR检测基因的表达模式
提取总 RNA后, 用琼脂糖电泳检测 RNA质量,
用 Nanodrop 测 RNA 浓度和纯度, 将符合条件的
RNA 采用 Invitrogen 公司 M-MLV 第一链合成系统
合成 cDNA 的第一链, 按说明书操作, 注意每个样
品 RNA 取量的一致。反转录过程中所需的 RNase
inhibitor也购自 Invitrogen公司。在合成的 cDNA中
进行扩增, 检测不同组织中 PPR618 同源基因的表
达情况, 以 Actin 基因作为对照。同样用能扩增出
UTR 区域的引物 618R1 和 618F1 检测恢复系, 用
PPR618编码区引物 618R2和 618F2检测不育系。DNA
聚合酶采用 TaKaRa的 LA Taq Mix, 反应总体积为 50
μL, 包括 LA Mix 10 μL、10 mmol L–1 Primer1 和
Primer2各 2 μL、模板 cDNA 2 μL、灭菌蒸馏水 19 μL。
PCR程序为 95℃预变性 5 min; 94℃变性 10 s, 64℃退
火 15 s, 72℃延伸 4 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min;
最后 12℃保存。取 25 μL PCR产物在 1.5%琼脂糖凝
胶上电泳, EB染色, 凝胶成像系统照相。
2 结果与分析
2.1 PPR618同源基因基本信息
根据候选恢复基因 PPR618 的序列设计的引物
在各参试品种中共扩增得到 22个同源序列, 序列长
度在 1 631~2 134 bp之间 , 不同材料中克隆到的同
源片段的大小和数目不一(图 1和表 1)。利用克隆的
同源序列预测开放阅读框, 预测的编码区氨基酸残
基个数为 314~632。其中恢 1的 PPRR1-2和 PPRR1-3
核苷酸序列一致性为 99.67%, 预测的氨基酸残基个
数虽然都为 618 个氨基酸残基, 但是有 7 个氨基酸
残基的差别。中双 7号的 PPRZ7-1和 PPRZ7-2这 2
个同源基因的序列只在第 1 837位有一个碱基的差
别, 但是预测的编码区氨基酸序列完全相同。在这
些克隆的同源基因中, 预测的编码区最短的是不育
系的 PPRSt3, 编码 314个氨基酸, 最长的是野油 18
的 PPRSA2和 3个恢复系中的 PPRR1-1、PPRR3和
PPRR4, 编码 632个氨基酸。
结构域在线预测发现, 克隆的所有同源基因都
有 PPR 基序, 个数为 8~17 个不等(表 1)。前人研究
表明, PPR基因通过调节 RNA编辑和加工来调控细
胞器表达, 几乎参与线粒体和质体基因表达的所有
阶段[14], 与高等植物的胚胎发生、细胞质雄性不育
的育性恢复有重要的联系。
2.2 候选恢复基因来源分析
序列分析结果发现, 野油 18有 2个 PPR618同
源基因, 而在 4个恢复系中, 除了恢 1发现 3个同源
基因外, 其他 3个恢复系中均各只有一个同源基因
(表 1)。恢复系中的这些同源基因都可能是 Nsa CMS
的恢复基因。
第 7期 张 洪等: 油菜 Nsa CMS候选恢复基因的来源及表达 1215



图 1 不同品种(系)PPR618特异引物的扩增结果
Fig. 1 PCR results of different varieties (lines) by PPR618 specific primers
M: marker; Sina: 野油 18; R1: 恢 1; R2: 恢 2; R3: 恢 3; R4: 恢 4; S: Nsa 不育系; Z4: 中双 4号; Z7: 中双 7号; Z11: 中双 11; O: 甘蓝;
R: 白菜。
M: marker; Sina: Yeyou 18; R1: restorer 1; R2: restorer 2; R3: restorer 3; R4: restorer 4; S: Nsa CMS; Z4: Zhongshuang 4; Z7: Zhongshuang
7; Z11: Zhongshuang 11; O: B. oleracea; R: B. rapa pekinensis.

表 1 不同品种(系)的 PPR618同源基因及其序列信息
Table 1 PPR618 homologous genes in different varieties (lines) and their sequence information
品种(系)
Variety (line)
基因名称
Name
拷贝数
Copy number
核苷酸长度
Nucleotide length
(bp)
氨基酸预测
Amino acid
prediction
PPR基序
PPR motif prediction
PPRSA1 2 2092 454 12 野油 18 Yeyou 18 (S. arvensis)
PPRSA2 2134 632 15
PPRZ4-1 2 1878 621 13 中双 4号 Zhongshuang 4 (B. napus)
PPRZ4-2 1902 629 13
恢 2 Restorer 2 PPRR2 1 2092 454 12
恢 3 Restorer 3 PPRR3 1 2134 632 15
恢 4 Restorer 4 PPRR4 1 2134 632 15
PPRR1-1 3 2134 632 15
PPRR1-2 2096 618 15
恢 1 Restorer 1
PPRR1-3 2096 618 15
PPRSt1 1878 621 15
PPRSt2 3 1867 384 10
Nsa不育系 Nsa CMS
PPRSt3 1888 314 8
PPRZ7-1 1878 621 15
PPRZ7-2 3 1878 621 15
中双 7号 Zhongshuang 7 (B. napus)
PPRZ7-3 1900 629 16
PPRZ11-1 1878 629 16
PPRZ11-2 3 1900 621 15
中双 11 Zhongshuang 11 (B. napus)
PPRZ11-3 1897 628 15
PPRO1 1876 453 12
PPRO2 3 1902 629 17
甘蓝 B. oleracea
PPRO3 1902 629 17
PPRRA1 2 1899 628 15 白菜 B. rapa pekinensis
PPRRA2 1631 379 9

通过氨基酸序列一致性分析发现, 4个恢复系中
的 PPR618同源基因序列分别与野油 18中的序列相
对应。恢 2的同源基因 PPRR2与野油 18的 PPRSA1
序列一致性为 100%, 恢 1 的 PPRR1-1、恢 3 的
PPRR3、恢 4 的 PPRR4 与野油 18 的 PPRSA2 序列
一致性为 100% (图 2)。而各恢复系的 PPR618同源
基因与中双 4号的 2个同源基因序列一致性仅在
76.35%~79.06%之间。由此可以推断, Nsa CMS恢复
系中候选恢复基因来自新疆野芥野油 18, 而不是甘
蓝型油菜中双 4号。
1216 作 物 学 报 第 38卷


图 2 恢复系及原始杂交亲本 PPR618同源基因氨基酸序列比对
Fig. 2 Alignment of amino acid sequence of PPR618 homologous gene from restorers and parental lines
PPRSA1和 PPRSA2: 来自野油 18; PPRZ4-1和 PPRZ4-2: 来自中双 4号; PPRR1-1、PPRR1-2和 PPRR1-3: 来自恢 1; PPRR2: 来自恢
2; PPRR3: 来自恢 3; PPRR4: 来自恢 4。
PPRSA1 and PPRSA2: from Yeyou 18 (S. arvensis); PPRZ4-1 and PPRZ4-2: from Zhongshuang 4 (B. napus L.); PPRR1-1, PPRR1-2, and
PPRR1-3: from restorer 1; PPRR2: from restorer 2; PPRR3: from restorer 3; PPRR4: from restorer 4.

2.3 同源基因进化分析
利用 NCBI Blastp进行 PPR618基因同源性搜索,
发现与 PPR618 基因序列一致性较高的主要是拟南芥
(Arabidopsis thaliana)的部分 PPR 基因及萝卜
(Raphanus sativus)的 CMS育性恢复基因。从公共数据
库中提取部分同源基因以及已经克隆的 CMS 恢复基
因的蛋白序列构建系统发育树。所用到的基因有白菜
(B. rapa)的 ABQ50546.1, 拟南芥 (A. thaliana)的
第 7期 张 洪等: 油菜 Nsa CMS候选恢复基因的来源及表达 1217


NP172694.1、NP188886.1和 NP563911.1, 甘蓝型油菜
(B. napus)的 ACJ70132.1, 萝卜(Raphanus sativus)的
ABO70667.1, 矮牵牛(Petunia hybrida)的 AY102719.1,
水稻(Oryza sativa)的 DQ311053.1 和 DQ311054.1, 玉
米(Zea mays)的 NM001112421.1。结果显示, 甘蓝型油
菜品种中双 4号、中双 7号、中双 11与 Nsa CMS不
育系的 PPR618 同源基因亲缘关系最近, 而恢复系中
的 PPR618同源基因除了与野油 18的亲缘关系很近外,
与植物 CMS 恢复基因相关的序列如萝卜和矮牵牛
CMS 恢复基因以及拟南芥的 PPR 基因也有一定的亲
缘关系, 与恢复系中的 PPR618 同源基因亲缘关系相
对较远的是水稻和玉米的恢复基因(图 3)。

图 3 PPR618同源基因系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of PPR618 homologues genes
PPRSA1和 PPRSA2来自野油 18; PPRZ4-1和 PPRZ4-2来自中双 4号; PPRR1-1、PPRR1-2和 PPRR1-3来自恢 1; PPRR2来自恢 2; PPRR3
来自恢 3; PPRR4来自恢 4; PPRSt1、PPRSt2和 PPRSt3来自 Nsa不育系; PPRZ7-1、PPRZ7-2和 PPRZ7-3来自中双 7号; PPRZ11-1、
PPRZ11-2Z和 PPRZ11-3: 来自中双 11; PPRO1、PPRO2和 PPRO3: 来自甘蓝; PPRRA1和 PPRRA2: 来自白菜。
PPRSA1 and PPRSA2: from Yeyou 18 (S. arvensis); PPRZ4-1 and PPRZ4-2: from Zhongshuang 4 (B. napus L.); PPRR1-1, PPRR1-2, and
PPRR1-3: from restorer 1; PPRR2: from restorer 2; PPRR3: from restorer 3; PPRR4: from restorer 4; PPRSt1, PPRSt2, and PPRSt3: from Nsa
CMS; PPRZ7-1, PPRZ7-2, and PPRZ7-3: from Zhongshuang 7 (B. napus L.); PPRZ11-1, PPRZ11-2Z, and PPRZ11-3: from Zhongshuang 11
(B. napus L.); PPRO1, PPRO2, and PPRO3: from B. oleracea; PPRRA1 and PPRRA2: from B. rapa pekinensis.
1218 作 物 学 报 第 38卷

2.4 PPR618 同源基因在恢复系及不育系的组织
表达模式
用 RT-PCR 检测 PPR618 同源基因在各个组织
表达量的差异, 结果表明 PPR618 同源基因在恢复
系及不育系各个组织中都有表达。在恢2中, 候选恢
复基因 PPPR2 的 mRNA 长度约为 2 100 bp, 与含
UTR的 DNA序列长度(2 092 bp)相近。PPRR2在根
和茎中表达量较低, 在花蕾中的表达量较高, 以在
直径为 1.5~2.5 mm的花蕾中表达量最高, 在 2.5 mm
以上的花蕾以及盛开的花瓣中表达量又有所下降。
而在不育系中, PPR618 同源基因 PPRSt1 在茎中的
表达量最高, 在根、叶中表达量相对较少(图 4)。

图 4 PPR618同源基因在不同组织中的表达
Fig. 4 Expression of PPR618 homologues genes in different organs
Rsl: 恢复系; Stl: 不育系; R: 根; St: 茎; L: 叶; B1: <1.5 mm花蕾; B2: 1.5~2.5 mm花蕾; B3: >2.5 mm花蕾; P: 花瓣。
Rsl: restorer; Stl: sterile line; R: root; St: stem; L: leaf; B1: bud with diameter smaller than 1.5 mm; B2: bud with diameter of 1.5–2.5 mm;
B3: bud with the diameter more than 2.5 mm; P: petal.

3 讨论
鉴定和克隆细胞质雄性不育的恢复基因有助于
建立恢复基因的分子育种技术及了解核质基因的互
作机制。目前在植物中已克隆了玉米[4]、矮牵牛[5]、
萝卜[7]、水稻[8]的 CMS恢复基因, 棉花[15]、高粱[10]、
小麦[16]等的 CMS恢复基因定位及克隆也在进行中。
为了克隆油菜 Nsa CMS的育性恢复基因, 本实验室
采用同源克隆的策略, 从 Nsa CMS恢复系中克隆了
一条候选恢复基因 PPR618。由于该恢复系由甘蓝型
油菜中双 4号 (AACC, 2n=38)和新疆野芥野油 18
(2n=18)的体细胞杂种系统选育而来[3], 应具有 2个
亲本种的遗传物质。因此, 候选恢复基因有可能来
自野芥, 但也不排除来自甘蓝型油菜的可能, 抑或
是野芥遗传物质渗入甘蓝型油菜的基因组而产生的
新基因。本研究通过比对不同材料中 PPR618 基因
的同源序列, 在 4 个恢复系中鉴定出 4 个候选恢复
基因。其中 2个候选恢复基因来源于野芥 , 分别与
野芥中的 2 个同源基因序列完全相同。另外 2 个虽
然在野芥亲本中没有找到完全相同的序列, 但序列
同源性也在 93%以上。由于细胞质雄性不育受线粒
体基因组控制, 利用线粒体基因进行 RFLP 分析时
曾发现Nsa CMS线粒体基因组杂交带型与新疆野芥
相似, 说明 Nsa CMS中具有野芥的线粒体基因组或
片段[17]。极有可能的是, Nsa CMS存在于线粒体中
的不育基因与存在于细胞核中的恢复基因均来自于
新疆野芥, 是长期共同进化的结果, 通过体细胞杂
交被分别转入甘蓝型油菜Nsa CMS的不育系和恢复
系中。另外 2 个与野芥的同源基因序列不完全相同
但同源性很高的候选恢复基因, 可能是在体细胞杂
交和恢复系的选育过程中发生的基因突变和重组而
生成的新序列。
恢复基因位点附近往往伴生序列极其相近的同
源基因, 在这些相似的基因中, 可能只有 1个或者 2
个起恢复基因的作用, 如水稻的 Rf1基因座上约 350
kb内存在 10个 PPR同源基因, 其中有 2个成员 Rf1a
和 Rf1b (具有 70%的相似性)对水稻 CMS-BT都有恢
复功能[18]。矮牵牛 CMS 恢复基因座上的 2 个基因,
Rf-PPR591 和 Rf-PPR592, 相似性达到 93﹪ , 仅
Rf-PPR592 能够恢复育性[18]。萝卜细胞质雄性不育
的 Rfo 基因座上有 3 个串联排列的基因 PPR-A、
PPR-B 和 PPR-C, 它们编码的蛋白高度相似, 其中
PPR-A和 PPR-B编码的蛋白相似性达 87%, 但是只
有 PPR-B具有育性恢复功能[7]。本研究在 Nsa CMS
4个恢复系中共克隆了 4种同源基因序列, 它们之间
的一致性在 93.74%~99.67%之间, 都可能是恢复基
因, 特别是在恢 1、恢 3和恢 4中都存在的 PPRR1-1。
恢 1、恢 3 和恢 4 中 PPRR1-1 的蛋白质长度为 632
氨基酸, 恢 1 中的另外 2 个候选恢复基因 PPRR1-2
和 PPRR1-3 的蛋白长度为 618 氨基酸, 均含 15 个
PPR基序; 而恢 2中的候选恢复基因 PPRR2的长度
较其他候选恢复基因短, 蛋白质长度仅为 454 氨基
酸, 含 12个 PPR基序。虽然长度有差异, 但序列同
源性很高, 如果都是恢复基因的话, 很可能在野芥
中 2 个恢复基因同时存在, 使具有不育胞质的野芥
育性得以恢复。但育性的恢复并不需要 2 个恢复基
因同时存在, 因此在不同的恢复系中, 只要有一个
恢复基因存在, 该不育系的育性就可以得到恢复。
第 7期 张 洪等: 油菜 Nsa CMS候选恢复基因的来源及表达 1219


尽管所有恢复系都是同一体细胞杂交组合的可育杂
种自交后代的衍生株系, 但由于恢 2 与恢 1 和恢 3
来自不同的体细胞杂种(恢 4 由恢 1 的杂交后代选
育), 在体细胞杂交及杂种自交过程中都丢失了另一
个恢复基因。从形态上可以明显看出, 恢 2与恢 1、
恢 3 有明显的区别。恢 2 自身的育性稳定性及其与
不育系杂交的 F2、F3代可育株比率明显高于恢 1和
恢 3, 我们曾怀疑恢 2不是附加系而是整倍体, 但后
来细胞学研究还是发现恢 2具有 40条染色体, 仍然
与恢 1和恢 3一样是二体附加系。恢复基因的不同,
可能是恢 2 育性稳定性与恢 1 和恢 3 不同的原因。
这一问题还有待候选恢复基因的功能得到验证后深
入研究。
基因时空表达模式跟基因功能密切相关, 探索
候选恢复基因 PPR618 的表达部位及表达量的变化
有助于预测其与育性调控的关系。细胞质雄性不育
是由于胞质内不育基因的控制使植物花粉败育, 位
于细胞核中的恢复基因通过降低不育基因的表达来
恢复育性[19], 恢复基因的表达往往都在生殖器官特
别是雄性生殖器官中。水稻的 2个恢复基因 Rf-1A
和 Rf-1B 在叶片和处于孕穗期的稻穗中均有表达[9];
矮牵牛恢复系中能够恢复育性的 Rf-PPR592 只在花
蕾中表达 , 在其非恢复系中克隆的同源基因
Rf-PPR591 只在根中表达[20]; 萝卜的恢复基因在子
叶、叶、花中表达, 但是在根中不表达[6]。本研究通
过 RT-PCR 方法探索了恢复系及不育系中同源基因
的表达差异, 同源基因在所有组织中都表达, 但是
恢复系中候选恢复基因随着营养器官到生殖器官的
发育, 表达量有逐渐升高的趋势, 在根、茎中的表达
量最低, 在 1.5~2.5 mm的花蕾中的表达量最高。在
武汉秋播条件下, 甘蓝型油菜 1.5~2.5 mm的花蕾是
减数分裂期, 正是 Nsa CMS不育系雄性发生败育的
关键时期[21]。PPR618 及其同源候选恢复基因可能
随着植物体的发育不断提高表达量, 在花药发育早
期通过增强表达来抑制不育基因的功能发挥。具体
的育性恢复机制, 还需要在恢复基因的功能得以验
证后深入研究。
4 结论
通过 PCR 方法在 Nsa CMS 及其恢复系、原始
体细胞杂交双亲等材料中扩增出了一系列同源基因,
恢复系中的候选恢复基因来源于亲本新疆野芥野油
18, 而不是亲本甘蓝型油菜中双 4 号。利用同源序
列法鉴定出 3 个新的候选恢复基因, 它们在序列上
与矮牵牛、萝卜的恢复基因同源性较高。候选恢复
基因 PPRR2在减数分裂时期的花蕾中表达量最高。
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