全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(1): 7478 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国际合作项目基金(2008DFA32030)和中央级公益性科研院所基本科研业务费(ITBBZX0843)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 王文泉, E-mail: wquanw@hainan.net, Tel: 0898-66894533
第一作者联系方式: E-mail: wenmingfu308@163.com, Tel: 0898-66894533
Received(收稿日期): 2010-05-04; Accepted(接受日期): 2010-08-01.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00074
木薯基因组 SSR和 EST-SSR在麻疯树和橡胶树中的通用性分析
文明富 陈 新 王海燕 卢 诚 王文泉*
中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101
摘 要: 利用木薯的 419对 EST-SSR引物和 182对基因组 SSR引物在 5个麻疯树品系和 2个橡胶树品系中进行通用
性分析。结果显示, 木薯 EST-SSR 在麻疯树和橡胶树中的通用性比例分别为 55.85%和 38.90%, 而木薯基因组 SSR
在麻疯树和橡胶树中的通用性比例分别为 37.36%和 26.37%。由此推测, EST-SSR的通用性高于基因组 SSR。此外, 木
薯 EST-SSR 和基因组 SSR 的通用性在麻疯树中高于在橡胶树中。本研究发掘的通用性 SSR 引物可以用于木薯、麻
疯树和橡胶树间的比较作图、基因发掘和 QTL定位研究。
关键词: 麻疯树; 橡胶树; 通用性; EST-SSR; 基因组 SSR
Transferability Analysis of Cassava EST-SSR and Genomic-SSR Markers in
Jatropha and Rubber Tree
WEN Ming-Fu, CHEN Xin, WANG Hai-Yan, LU Cheng, and WANG Wen-Quan*
Institute of Tropical Bioscience & Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China
Abstract: Euphorbiaceae family includes abundant economic species, such as rubber tree, cassava, castor bean, and Jatropha.
Cassava (Manihot esculenta Crantz) ranks in the sixth food crop in the world. In China, cassava is also an important tropical eco-
nomic crop. The genomic-SSRs derived from cassava genome, and EST-SSRs derived from expressed sequence tags (ESTs). In
this study, the transferability of 419 pairs of EST-SSR primer and 182 pairs of genomic-SSR primer from cassava was tested in
five Jatropha lines and two rubber tree lines. The results showed that the transferability rate of cassava EST-SSR in Jatropha and
rubber tree was 55.85% and 38.90%, and the transferability rate of cassava genomic-SSR in Jatropha and rubber tree was 37.36%
and 26.37%, respectively. The transferability EST-SSR was higher for cssava than that of genomic-SSR. Besides, the transferability
of cassava EST-SSR and genomic-SSR was higher in Jatropha than in rubber tree. These results suggested that the cassava SSR
can be used for comparative mapping, gene tagging and QTL mapping among cassava, Jatropha, and rubber tree.
Keywords: Jatropha; Rubber tree; Transferability; EST-SSR; Genomic-SSR
大戟科 (Euphorbiaceae)属双子叶植物 , 该科共
约 300属 5 000多种, 遍布世界各地, 但主要分布于
热带和亚热带地区。中国约有 72属 450多种, 具有
经济价值的属包括橡胶树属(Hevea Aubl.)、麻疯树属
(Jatropha Linn.)、木薯属(Manihot P. Mill.)等, 主要
分布在中国南方地区。大戟科以盛产橡胶、油料、
淀粉、木材和药材等重要经济植物著称[1]。
在植物研究中, 比较基因组学正逐步成为活跃
领域, 包括基因组比较作图、基于基因组全序列的
比较基因组学研究和基于 DNA 芯片技术的比较基
因组学研究。通过物种间比较作图, 既可为物种间
比较研究提供必要的遗传信息, 又有利于加速遗传
背景较薄弱物种的研究。在比较作图研究中, 引物
的通用性和多态性将是作图成功与否的关键因素。
当前, 应用于图谱构建的分子标记很多, 如 RFLP[2]、
AFLP[3]、RAPD[4]和 SSR[5]等, SSR标记被认为是图
谱构建更有效的分子标记之一, 根据 SSR 标记开发
的方法性质不同, 可将其分为基因组 SSR(G-SSR)和
EST-SSR。G-SSR 和 EST-SSR 在不同植物中的通用
性研究已有许多报道。Varshney 等 [6]利用大麦的
EST-SSR和 G-SSR标记在近缘物种小麦、黑麦和水
稻中进行通用性比较研究, 发现 EST-SSR 标记的通
用性比例高于 G-SSR 标记, 不同物种中的转移率不
同, 小麦(78.2%)转移率最高, 水稻(42.4%)最低。同
第 1期 文明富等: 木薯基因组 SSR和 EST-SSR在麻疯树和橡胶树中的通用性分析 75
时, 利用这些新开发的 EST-SSR 对大麦和黑麦进行
比较作图研究, 将 9个大麦的 EST-SSRs定位到黑麦
的遗传连锁图谱上, 并且所有这些标记在大麦遗传
连锁图谱上的位置与黑麦遗传连锁图谱相比, 都被
定位在大麦和黑麦的同源区。
关于G-SSR和 EST-SSR标记在大戟科中的通用
性研究目前未见报道。本研究试图通过木薯基因组
序列和 EST序列开发的 SSR引物, 在麻疯树和橡胶
树中进行通用性研究, 将现有的引物转移到麻疯树
和橡胶树上, 既可以节约 SSR 开发的成本, 又可以
为今后这些物种的比较作图、基因发掘、重要农艺
性状定位和指纹图谱构建等研究提供依据。同时 ,
也为大戟科其他物种间开发共有标记提供有效途径
借鉴。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用 5个麻疯树品系, 2个橡胶树品系和 1个木
薯品系进行通用性分析。麻疯树品系分别来自印度
尼西亚(JI)、南美洲(JA)、格林纳达(JG)、中国云南
(JY)和中国海南(JH) 5个地区; 橡胶树品系为海垦 2
号(Hai 2)和云研 722(722); 木薯品系为华南 5号(SC5)
(表 1)。所有材料保存于中国热带农业科学院热带生
物技术研究所文昌基地种质资源圃。
表 1 麻疯树、橡胶树和木薯及其来源
Table 1 Jatropha, rubber tree, and cassava accessions and
their origins used in this study
物种
Species
编号
Code
来源
Origin
JA 南美洲 South America
JG 格林纳达 Grenada
JY 中国云南 Yunnan, China
JI 印度尼西亚 Indonesia
麻疯树 Jatropha
JH 中国海南 Hainan, China
Hai 2 中国海南 Hainan, China 橡胶树 Rubber tree
722 中国云南 Yunnan, China
木薯 Cassava SC5 中国海南 Hainan, China
1.2 SSR标记来源
采用的 SSR 标记分两类, 182 对木薯 G-SSR 引
物由国际热带农业研究中心(CIAT)提供[7], 419 对木
薯 EST-SSR引物由本实验室设计和开发。
1.3 基因组 DNA提取
选取幼嫩新鲜的叶片, 采用改良 CTAB 法[8]进
行总 DNA 的提取。基因组 DNA 经 1%的琼脂糖胶
电泳, 紫外凝胶成像系统(Tanon 4200)拍照检测, 同
时利用紫外分光光度计(UV2550)检测基因组 DNA
在 λ260和 λ280及 λ260/λ280的值, 将符合条件的 DNA
稀释为 50 ng µL–1保存于–20℃备用。
1.4 PCR及产物检测
20 μL的反应体系含 DNA模板 50 ng, 1×PCR反
应缓冲液(20 mmol L–1 Tris, pH 9.0, 100 mmol L–1
KCl, 3.0 mmol L–1 MgCl2), dNTPs 400 µmol L–1, 左
引物和右引物各 0.4 µmol L–1和 1 U Taq DNA聚合
酶。PCR扩增程序为 94℃预变性 1 min, 94℃变性 1
min, 50~57℃退火 1 min, 72℃延伸 1 min (35个循环),
72℃延伸 10 min。PCR 产物经 2%琼脂糖胶电泳及
SYBR Green (http://www.genecopoeia.com/)染色, 在
紫外凝胶成像系统下拍照, 记录相关信息。
1.5 数据分析
根据电泳结果, 读取各位点扩增产物的值。统
计分析G-SSR和 EST-SSR标记在麻疯树和橡胶中的
通用性比率。
2 结果与分析
2.1 木薯 EST-SSR与G-SSR在麻疯树中的通用性
采用 419 对 EST-SSR 引物扩增 5 个品系, 其中
234 对引物有扩增产物, 占检测引物的 55.85%, 有
扩增多态性的引物有 187 对, 占测试 EST-SSR 引物
的 44.63% (图 1)。而在 182对 G-SSR引物中, 有 68
对(37.36%)有扩增产物 , 具有多态性扩增的引物有
54对(29.67%) (表 2)。
2.2 木薯 EST-SSR与G-SSR在橡胶树中的通用性
利用 419对 EST-SSR引物检测 2份供试橡胶树
品系, 结果显示有扩增产物和多态性的引物分别为
163 对(38.90%)和 48 对(11.46%)。而 182 对 G-SSR
引物在橡胶树中有扩增条带数为 48 对(26.37%), 其
中 8对具有多态性, 占 G-SSR引物 4.40% (表 2)。
图 1 引物 CK649172在麻疯树、木薯和橡胶树中 PCR扩增
Fig. 1 PCR results of Jatropha, cassava, and rubber tree with
CK649172 primer
76 作 物 学 报 第 37卷
表 2 木薯 EST-SSR与 G-SSR在麻疯树和橡胶树中的通用性
Table 2 Transferability of cassava EST-SSR and genomic-SSR markers in Jatropha and rubber tree
物种
Species
引物类型
Primer types
引物总数目
Number of total primers
扩增引物数(比例)
No. of amplification primers (rate)
多态性引物数(比例)
No. of polymorphic primers (rate)
EST-SSR 419 234(55.85%) 187(44.63%) 麻疯树
Jatropha Genomic-SSR 182 68(37.36%) 54(29.67%)
EST-SSR 419 163(38.90%) 48(11.46%) 橡胶树
Rubber tree Genomic-SSR 182 48(26.37%) 8(4.40%)
2.3 木薯 EST-SSR与 G-SSR在麻疯树和橡胶树
中通用性比较
EST-SSR 引物的通用性比例高于 G-SSR 引物
(图 2)。具有扩增条带的 EST-SSR引物在麻疯树中的
比例 (55.85%)高于橡胶树 (38.90%); 而麻疯树中多
态性 EST-SSR 引物比例也高于橡胶树; 对于 G-SSR
引物, 麻疯树中具通用性的 G-SSR 引物是 37.36%,
橡胶树中可通用的 G-SSR引物是 26.37%, 这结果与
EST-SSR引物在麻疯树中通用性一致。
2.4 不同核心单元的木薯 EST-SSR 在麻疯树和
橡胶树中的扩增
在选取的 419 对 EST-SSR 引物中, 核心单元碱
基重复类型主要包括双核苷酸、三核苷酸、四核苷
酸和五核苷酸重复 4 种类型。在麻疯树中有扩增条
带的 234 对 EST-SSR 引物, 三核苷酸重复类型所占
比例最多 139 对(59.40%), 其次是双核苷酸重复类型
57对(24.36%), 四核苷酸重复类型 20对(8.55%)和五
核苷酸重复类型 18对(7.69%)最少。在 187对具有多
态性的 EST-SSR 引物中, 三核苷酸重复类型 108 对
(57.75%), 双核苷酸重复类型 49对(26.20%), 四核苷
酸重复类型 16 对(8.56%), 五核苷酸重复类型 14 对
(7.49%)。在橡胶树中 , 具有扩增条带的 163 对
EST-SSR 引物中, 三核苷酸重复类型引物所占比例
为 66.87%, 双核苷酸重复类型引物比例为 20.25%
(表 3); 在具有多态性条带的 48对引物中, 三核苷酸
重复类型和双核苷酸重复类型所占比例最多。
图 2 木薯 EST-SSR标记与 G-SSR标记在麻疯树和橡胶树中的
通用性比较
Fig. 2 Transferability comparison of cassava EST-SSR and
G-SSR markers in Jatropha and rubber tree
表 3 不同核心单元的 EST-SSR在麻疯树和橡胶树中的通用性
Table 3 Transferability of cassava EST-SSR with different repeats in Jatropha and rubber tree
有带引物 EST-SSRs amplified 有多态性引物 Polymorphic EST-SSRs amplified物种
Species
核心单元
SSR motif
引物总数
Designed primer pairs Number Rate (%) Number Rate (%)
二核苷酸 Di- 108 57 24.36 49 26.20
三核苷酸 Tri- 248 139 59.40 108 57.75
四核苷酸 Tetra- 32 20 8.55 16 8.56
五核苷酸 Penta- 31 18 7.69 14 7.49
麻疯树
Jatropha
总数 Total 419 234 100.00 187 100.00
二核苷酸 Di- 108 33 20.25 12 25.00
三核苷酸 Tri- 248 109 66.87 30 62.50
四核苷酸 Tetra- 32 15 9.20 4 8.33
五核苷酸 Penta- 31 6 3.68 2 4.16
橡胶树
Rubber tree
总数 Total 419 163 100.00 48 100.00
第 1期 文明富等: 木薯基因组 SSR和 EST-SSR在麻疯树和橡胶树中的通用性分析 77
2.5 不同核心单元的木薯 G-SSR 在麻疯树和橡
胶树中的通用性
在选取的 182 对 G-SSR 引物中, 核心单元的碱
基重复类型主要包括双核苷酸重复类型和三核苷酸
重复类型两类。在麻疯树上, 筛选得到的 68对 G-SSR
基本上都是二核苷酸重复类型, 所占比例为 63.24%。
在橡胶树中, 具有扩增条带的 48 对 G-SSR 引物中,
二核苷酸重复类型占 68.75% (表 4)。
2.6 不同核心单元的 EST-SSR和 G-SSR在麻疯
树和橡胶树中通用性比较
木薯 EST-SSR和G-SSR在麻疯树和橡胶树的通
用性检测表明, 不同重复类型的 SSR 通用性比例差
别很大(图 3)。对 EST-SSR来说, 三核苷酸重复类型
通用性比例在麻疯树和橡胶树中都是最大, 分别达
到 59.40%和 66.87% (表 3), 其次是二核苷酸的重复
类型, 其他的类型所占的比例相当小。而在 G-SSR
中, 主要是二核苷酸重复类型。
3 讨论
近年来 , 利用植物基因组或 EST 序列开发
G-SSR 引物或 EST-SSR 引物, 并在其近缘物种中进
行通用性分析已经成为一种比较通行的引物开发手
段。在禾本科大麦属[9]、兰科香荚兰属[10]、蔷薇科
李属[11]等物种上已有相关报道。来自 EST 序列的
SSR 通用性比例远高于基因组开发的 G-SSR,
Varshney等[6]报道利用大麦 EST序列开发的 SSR引
物在小麦上的通用性比例为 78.2%, 在黑麦上为
75.2%, 在水稻上是 42.4%。而来自基因组开发的 G-
SSR, 在近缘物种中的通用性比例只有 20%~
30%[12-14]。但是, G-SSR比 EST-SSR具有更高的多态
性比例[13,15]。本研究中, 木薯 EST-SSR 在麻疯树中
的通用性比例为 55.85%, 在橡胶树中为 38.90%; 木
薯 G-SSR 在麻疯树和橡胶中的通用性比例分别为
37.36%和 26.37%。这些结果与小麦的 EST-SSR 和
G-SSR 在其近缘物种中的转移率一致[16]。EST-SSR
通用性比 G-SSR转移率高表明基因组中编码序列比
非编码序列更加保守, 同时也说明编码序列的突变
频率相对较低。
SSR核心单元碱基重复类型对 SSR在物种中的
通用性具有很大的影响。在植物中, 一般核心单元
三核苷酸碱基重复类型的 SSR 通用性比例最高, 其
次是二核苷酸碱基重复类型[9,17-19]。本研究中, 木薯
三核苷酸重复类型的 EST-SSR引物的通用性比例在
麻疯树和橡胶中均最高, 这与前人的研究一致。
在大戟科木薯、麻疯树和橡胶树中存在高比例
的通用性 EST-SSR, 这些通用的 EST-SSR 可帮助我
们在这 3个物种间进行比较作图, 基因发掘和 QTL
定位研究。预期这些研究成果将会加速对大戟科内
不同物种基因组结构和相关功能基因的了解, 促进
相关研究成果在科内不同物种间的相互利用。
4 结论
利用木薯 EST序列开发的 419对 EST-SSR引物
和基因组序列开发的 182 对 G-SSR 引物, 在 5 个麻
疯树品系和 2 个橡胶树品系中进行通用性检测。在
麻疯树和橡胶树中分别有 234 对和 163 对 EST-SSR
引物和 68 对和 48 对 G-SSR 引物具通用性, 而且
G-SSR的多态性水平在两物种中均高于 EST-SSR。
表 4 不同核心单元的 G-SSR在麻疯树和橡胶树中的通用性
Table 4 Transferability of cssava genomic-SSR with different repets in Jatropha and rubber tree
有带引物 Genomic-SSRs amplified 有多态性引物 Polymorphic genomic-SSRs amplified物种
Species
核心单元
SSR motif
引物总数
Designed primer pairs Number Rate (%) Number Rate (%)
二核苷酸 Di- 134 43 63.24 34 62.96
三核苷酸 Tri- 5 4 5.88 2 3.70
四核苷酸 Tetra- 1 — — — —
五核苷酸 Penta- — — — — —
麻疯树
Jatropha
总数 Total 182 68 100 54 100
二核苷酸 Di- 134 33 68.75 6 75.00
三核苷酸 Tri- 5 1 2.08 0 0
四核苷酸 Tetra- 1 — — — —
五核苷酸 Penta- — — — — —
橡胶树
Rubber tree
总数 Total 182 48 100 8 100
78 作 物 学 报 第 37卷
图 3 不同核心单元的 EST-SSR与 G-SSR引物在麻疯树和橡胶
树中的通用性比较
Fig. 3 Transferability comparison of different SSR motif of
cassava EST-SSR and genomic-SSR primers in Jatropha and
rubber tree
A: EST-SSR引物; B: G-SSR引物。
A: EST-SSR primer; B: genomic-SSR primer.
致谢：感谢国际热带农业中心(CIAT)的 M. Fregene
教授提供木薯基因组 SSR引物序列。
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