全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(9): 1569−1573 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 湖南省教育厅重点项目(06FJ2003)
作者简介: 戴小军(1976–), 男, 土家族, 湖南张家界人, 在读博士研究生, 主要从事植物分子生物学研究。E-mail: hello_dxj@163.com
*
通讯作者(Corresponding author): 陈良碧(1956–), E-mail: chenliangbi@126.com
Received(收稿日期): 2007-12-03; Accepted(接受日期): 2008-01-30.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01569
栽培稻种内 rDNA基因 IGS序列分析及系统学意义
戴小军 欧立军 李文嘉 梁满中 陈良碧*
(湖南师范大学生命科学学院, 湖南长沙 410081)
摘 要: 以普通野生稻为对照, 将 rDNA 基因间区(IGS)序列用于栽培稻种内不同亚种以及亚种内不同品种的亲缘关
系分析。结果表明, 栽培稻种内 IGS序列长度为 2 130~2 145 bp, G+C含量为 74.59%~75.29%, 变异位点 229个, 占
10.70%, 信息位点 76个, 占 3.51%。IGS序列中籼亚种和粳亚种之间有 38个亚种标志性碱基差异, 主要分布在 IGS 5′
端近 400 bp的序列中。用 IGS序列构建的系统树能将栽培稻的籼亚种和粳亚种分为两大类, 亚种内不同亲缘关系的
品种也能区分开。本研究结果支持爪哇稻为栽培稻中一个独立亚种的观点。
关键词: 栽培稻; 核糖体; 基因间区(IGS); 系统树
Analysis of rDNA Intergenic Spacer (IGS) Sequences in Oryza sativa L.
and Their Phylogenetic Implications
DAI Xiao-Jun, OU Li-Jun, LI Wen-Jia, LIANG Man-Zhong, and CHEN Liang-Bi*
(College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan, China)
Abstract: In plant unclear genome, the intergenic spacer region (IGS) is located on the region of 18S–28S and is often used in
phylogenetic analysis among species, detecting intra-specific polymorphisms. Rice (Oryza sativa L.) is differentiated into not only
some subspecies but also many ecotypes of these subspecies. Can the IGS region be a useful tool to study the phylogenetic rela-
tionships among these cultivars of Oryza sativa? In the study, a comparative analysis of the rDNA intergenic spacer entire se-
quences of thirteen cultivars in Oryza sativa L. was carried out with O. rufipogon as outgroup. In the cultivars used, there were six
for typical O. sativa ssp. japonica, five for typical O. sativa ssp. indica, two for O. sativa ssp. javanica. The result indicated that
the length range of IGS sequences was from 2 130 to 2 145 bp, the content of G+C varied from 74.59% to 75.29%, there were 229
variational loci which were 10.70% of entire bases and 76 informative loci which were 3.51% of entire bases in Oryza sativa.
Thirty-eight indica and japonica specific loci were found in the IGS sequences of Oryza sativa, most of them were covered a
about 400 bp segment located in the upstream of IGS sequence. The indica and japonica subspecies of Oryza sativa, as well as
some closely related cultivars, can be discriminated clearly based on the phylogenetic tree constructed by IGS sequences. The
study supported the opinion that the O.sativa ssp.javanica is a subspecies of Oryza sativa.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Ribosomal DNA (rDNA); Intergenic spacer (IGS); Phylogenetic tree
真核生物核糖体 DNA 是高度重复的串联序列,
每个重复序列包括高度保守的编码区 18S、5.8S、26S,
中等保守的内转录间隔区(internal transcribed spacer,
ITS)以及较低保守的基因间区 (intergenic spacer,
IGS)。由于基因间区变异相对较快, 且各重复单位间
具有同步进化的特点, 因此被广泛应用于种间、种
内、近缘类群、杂交类群等关系的研究[1-8]。
有关水稻 IGS 序列的研究不多, Sano 发现在水
稻AA基因组中有 18种 IGS序列长度变异, 按 rDNA
间隔序列长度多态性把籼粳稻分为两类[9], Liu 等在
481个稻属材料中检测到 42种 IGS长度变异类型[10]。
而 IGS 的全序列还只有两个粳稻材料被测定 [11]
(EMBL accession number: X54194 and X58275)。尚
未见以 IGS 全序列碱基差异分析栽培稻种内的遗
1570 作 物 学 报 第 34卷

传多样性及系统演化关系的报道, 本文以普通野生
稻为外类群, 对栽培稻亚种间以及品种间 IGS序列
进行了比较研究, 旨在为研究栽培稻的系统演化规
律以及品种间亲缘关系提供一些新的分子生物学
支持。
1 材料和方法
1.1 材料
以海南普通野生稻作为外类群, 供试栽培稻品
种中有 5个籼稻, 6个粳稻和 2个爪哇稻。供试材料
名称、所属类型及 IGS 序列相关信息见表 1。另外
从基因库中下载了两个粳稻材料(Mangetsumochi 和
Mongetsumochi)的 IGS序列一同用于比较分析。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取 取幼叶用传统的 SDS 法提取
DNA。
1.2.2 PCR扩增 用双引物扩增 IGS序列。根据
GenBank 中的水稻 26S 和 18S 序列, 用 Primerer 软
件设计引物。双引物的序列分别为 5′-GCA TTG TAA
GTG GCA GAG TGG-3′和 5′-CGG GGT TTG TTG
CAC GTA T-3′。反应体系为 10×buffer 25 μL, 2.5
mmol L−1 dNTP 8 μL, 50 mmol L−1引物各 1 μL, DNA
40 ng, Taq DNA polymerase 0.5 μL, 总体积 50 μL。
扩增程序为 95℃预变性 8 min, 接着以 95℃ 1 min、
56 50 ℃ s、72 3 min℃ 循环 32次, 最后 72℃保温 10
min。

表 1 供试材料和其他信息
Table 1 Plant materials and details of IGS sequences in the study
IGS 序号
Code
材料
Material
类型
Species and type
来源
Origin 基因库编号
GenBank accession No.
长度
Length (bp)
G+C含量
G+C content (%)
1 海南普通野生稻Hannan wild rice 野生O. ruffipogon 中国 China DQ355286 2 125 71.91
2 日本晴 Nipponbare 粳 Japonica 日本 Japan DQ355283 2 145 71.98
3 秋光 Akihikali 粳 Japonica 日本 Japan DQ355284 2 133 71.82
4 矮子糯 Aizinuo 粳 Japonica 中国 China DQ355284 2 133 71.82
5 沈农 265 Shennong 265 粳 Japonica 中国 China EF661830 2 135 71.52
6 Mangetsumochia 粳 Japonica 日本 Japan X54194 2 138 71.56
7 Mongetsumochia 粳 Japonica 日本 Japan X58275 2 141 71.88
8 Lemont 爪哇 Javanica 美国 USA EF661832 2 135 71.10
9 P002 爪哇 Javanica 美国 USA EF661833 2 127 71.51
10 广陆矮 4号 Guanglu’ai 4 籼 Indica 中国 China DQ355280 2 131 72.03
11 余赤 231-8 Yuchi 231-8 籼 Indica 中国 China DQ355279 2 131 72.07
12 明恢 63 Minghui 63 籼 Indica 中国 China DQ355278 2 130 72.25
13 R288 籼 Indica 中国 China DQ355281 2 132 72.09
14 9311 籼 Indica 中国 China EF661831 2 133 71.59
a: 从 GenBank中下载的 IGS序列信息。
a: submitted IGS sequence data downloaded from GenBank.

1.2.3 克隆测序 用上海生物工程有限公司胶回
收试剂盒回收 PCR 产物, 连接到宝生物工程有限公
司的 pMD 18-T Vector 载体中, 再转化到大肠杆菌
DH5α, 将菌液送到上海博亚生物技术有限公司测序,
以两个完全相同的序列作为某水稻品种的分析序列,
将其提交到 NCBI中并获得基因库编号。
1.2.4 数据分析及系统树构建 对所得序列采用
DNAMAN 软件进行排序和 G+C 含量分析, 然后用
PAUP4.0、Clustralw软件进行系统发育分析, 并以自
展法(bootstrap)进行检测, 共循环 1 000 次, 构建邻
接树(neighbor-joining tree)。
2 结果与分析
2.1 栽培稻种内 IGS 序列长度和 G+C 含量比较
分析
供试外类群海南普通野生稻 IGS 序列的长度为
2 125 bp, G+C含量 71.94%。栽培稻种内 IGS序列长
度变化范围为 2 125~2 145 bp, G+C 含量变化在
71.10%~72.25%之间, 总的变异位点数 229个, 占总
碱基数的 10.70%, 信息位点 76个, 占 3.51%。
第 9期 戴小军等: 栽培稻种内 rDNA基因 IGS序列分析及系统学意义 1571


2.2 栽培稻籼粳亚种间 IGS序列比较分析
供试材料间 IGS 序列都存在碱基差异, 其中靠
5端上游序列碱基变异比较丰富, 而靠 3端下游碱
基序列相对比较保守。比较供试籼亚种和粳亚种的
序列差异, 发现有 38 个碱基具有亚种特征性, 其中
34个是位于靠 IGS 5端 400个左右碱基的片段中(图
1), 该片段信息位点占整个 IGS 序列信息位点的
44.7%。而亚种内不同品种间碱基变异在此片段中没
有亚种间丰富。
爪哇稻 IGS序列与典型籼粳稻对比, 在 38个籼
粳标志性碱基中, P002 完全与粳稻相同, Lemont 有
36个与粳稻一致。在全序列对比中, 爪哇稻与籼稻、
粳稻都有较大差异。
爪哇稻 IGS序列与典型籼粳稻对比, 在 38个籼
粳标志性碱基中, P002 完全与粳稻相同, Lemont 有
36个与粳稻一致。在全序列对比中, 爪哇稻与籼稻、
粳稻都有较大差异。
2.3 粳亚种内 IGS序列比较分析
6个粳亚种材料中共有 131个碱基差异, 其中日
本晴与 GenBank中 Mongetsumochi的 IGS序列差异
最小, 只有 4 个碱基差异; 日本晴和秋光碱基差异
比较小, 有 14 个碱基差异; 沈农 265 与秋光、沈农
265与日本晴、矮子糯与秋光之间都有 38个碱基的
不同。
2.4 籼亚种内 IGS序列比较分析
籼亚种 5个材料中有 67个碱基差异, 其中R288
是从明恢 63群体中经系统选育出的品种, 两者亲缘
关系较近, 其 IGS序列差异小, 仅 16个碱基的不同;

图 1 栽培稻种内 IGS近 5′端上游序列差异碱基比较
Fig. 1 Gene diversity of the upstream segment of IGS sequence in Oryza sativa
1~14所示各材料的名称同表 1, “−”表示相同碱基, “.”表示缺失碱基。
The number 1–14 corresponds with the codes for the material in Table 1. “−” means the same site, “.” means the missing data.
1572 作 物 学 报 第 34卷

而亲缘关系较远的品种碱基差异较大, 如广陆矮 4 号
与余赤 231-8 有 30 个碱基的差异, 余赤 231-8 与
9311有 33个碱基的差异, 广陆矮 4号与 9311有 35
个碱基的差异。
2.5 栽培稻种内 IGS序列系统树构建
通过序列对比, 将 IGS 序列作为一个共同的数
据距阵进行运算, 以海南普通野生稻为外类群, 采
用邻接法 (N-J)对栽培稻品种构建系统树 , 分别用
PAUP4.0 和 MEGA 软件分析, 得到的结果相同(图
2)。系统树分支上的数字为 Bootstrap重复 1 000次
抽样检验得出的分支支持率。6 个粳型材料和 5 个
籼型材料都各自归为同一亚群, 籼亚群中亲缘关系
较近的 R288 和明恢 63 位于一分支, 粳类群中除从
网上下载的 Mangetsumochi 隔的较远外, 其他几个
粳型材料表现出较近的亲缘关系, 爪哇稻 Lemont和
P002与粳稻位于同一分支。

图 2 基于 IGS序列分析构建的栽培稻 N-J系统树
Fig. 2 A neighbor-joining tree based on rDNA IGS sequences
of Oryza sativa
分支上的数字代表该分支的自展支持率 bootstrap值均>50%,
1 000次重复。
The number on each branch denotes bootstrap value>50%, 1 000
replication.
3 讨论
真核生物中, 核糖体基因 ITS序列、IGS序列常
用于种间或种内系统学研究[12-18]。Baldwin[12]分析了
菊科 Calycadenia属的 ITS序列和 IGS序列, 表明在
亲缘关系研究中, 当 ITS序列存在争议时, IGS序列
可以提供更有力的支持, 李志明[14]用 ITS 和 IGS 序
列进一步证实了樟科黄肉楠属为一个复系类群。对
栽培稻种内 ITS 序列研究表明, 利用 ITS 序列能将
典型籼粳亚种分开, 但亲缘关系较近的品种其 ITS
序列完全相同[19]。本研究表明, 栽培稻种内 IGS 序
列有着比 ITS 序列更丰富的变异和信息位点, 籼亚
种和粳亚种之间具 38个亚种标志性差异碱基, 其中
34个碱基差异分布在 IGS 5端近 400 bp的片段中。
亲缘关系较近、ITS序列完全相同的明恢 63和 R288,
其 IGS 序列也有 16 个碱基的差异。基于 IGS 序列
构建的系统树能将两个亚种分为两支, 可见比 ITS
变异更快的 IGS 序列在亚种内也具有同步进化和变
异的特征。由于 IGS序列比 ITS序列的信息位点多,
基于 IGS 序列构建的系统树能将亚种内, 特别是亲
缘关系较近的品种区分开。因此 IGS 序列更适于亚
种内不同品种间遗传关系的分析。
ITS 序列构建的系统树和 IGS 序列构建的系统
树基本类似, 但也存在一些差异, 特别是爪哇稻所
属关系完全相反, 即 ITS 序列构建的系统树爪哇稻
位于籼亚种一支[19], 而 IGS 序列构建的系统树爪哇
稻位于粳亚种一支。对该结果可作两方面的推测解
释, 一是亚种内不同品种间 ITS 序列与 IGS 序列在
同步进化和变异时不同步, 导致 ITS 序列相近的品
种其 IGS 序列差异可能相对较大; 二是 ITS 序列与
IGS 序列在演化方向上可能是相对独立的, 如爪哇
稻的 ITS 序列是按类似于籼亚种方向演化, 而 IGS
序列则按类似于粳亚种方向演化, 从而构成这类水
稻独特的遗传特点。因此, 本文作者认为遗传保守
性较高的 ITS 序列能较好地反映属间、种间的遗传
关系, 但对种内具多个亚种的复杂种群进行遗传分
析时, 同时分析 ITS 序列和 IGS 序列可能更能反映
其真实的遗传关系。
栽培稻中爪哇稻的归属一直存在争议, 王象坤和
孙传清[20]、程侃声等[21]都支持将爪哇稻作为粳亚种
的一个生态类群。Chang[22]、袁隆平等[23]认为籼稻、
粳稻和爪哇稻为普通栽培稻的 3 个亚种。贺浩华[24]
利用 SSR 分子标记聚类分析发现爪哇稻 Lemont 与
籼稻归为一类群, 表现出与籼稻较近的亲缘关系。
我们的研究结果是爪哇稻 Lemont、P002 的 ITS 序列
与籼亚种序列类似, 而 IGS 序列与粳亚种类似。由此
可见爪哇稻既具有粳亚种的遗传特征, 又具有籼亚种
的遗传特征, 因此仅凭部分遗传信息不能简单地将爪
哇稻归为粳亚种或籼亚种。我们认为将爪哇稻作为粳
亚种和籼亚种的中间类型, 独立为一个亚种的观点更
适宜解释爪哇稻独特的遗传特点。
4 结论
基于栽培稻 IGS 序列比较分析, 籼亚种和粳亚
种之间具有比较丰富的碱基差异, 且具有同步进化
的亚种标志性碱基, 亚种内不同品种也存在碱基差
第 8期 戴小军等: 栽培稻种内 rDNA基因 IGS序列分析及系统学意义 1573


异, 系统树不仅能将典型籼粳亚种分开, 且对亚种
内亲缘关系较近的品种也能区分。其研究结果对栽
培稻的系统演化以及品种间遗传差异的认识有一定
促进作用。
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