全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(11): 1938−1945　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2001AA241211)
作者简介: 刘建新(1980−), 男, 博士研究生, 研究方向为作物遗传育种与基因工程。
*
通讯作者(Corresponding author): 熊和平(1955−), 男, 教授, 博士生导师, 研究方向为作物遗传育种。E-mail: ramiexhp@2118.cn
Received(收稿日期): 2008-02-01; Accepted(接受日期): 2008-05-10.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01938
苎麻果胶合成重要酶 UGlcAE基因的克隆及组织表达
刘建新 喻春明 唐守伟 朱爱国 王延周 朱四元 马雄风 熊和平*
(中国农业科学院麻类研究所, 湖南长沙 420105)
摘 要: 以苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud]中苎 1号为材料, 采用简并 RT-PCR法、RACE技术以及全长 cDNA文库
筛选, 克隆苎麻果胶主要多糖组分的合成关键酶 UGlcAE cDNA序列, 序列长度为 1 257 bp, 编码区长 723 bp, 可编
码 241个氨基酸序列。实时定量 PCR证实, UGlcAE表达量为根部＞叶片＞韧皮部＞木质部, 在根部的表达量占优势。
该结果对今后采用分子生物学方法来调控果胶的合成量具有实际意义。
关键词: 苎麻; 果胶; UGlcAE; 克隆; 实时定量 PCR
Cloning and Tissue Expression of Important Enzyme Gene UGlcAE in
Ramie Pectin Biosynthesis
LIU Jian-Xin, YU Chun-Ming, TANG Shou-Wei, ZHU Ai-Guo, WANG Yan-Zhou, ZHU Si-Yuan,
MA Xiong-Feng, and XIONG He-Ping*
(Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 420105, Hunan, China)
Abstract: Ramie [Boehmeria nivea (L.) Gaud] is one of the important fibre crops, but its deguming leads to severe environmental
pollution, large energy consumption, and deteriorated fibre for spinning and so on. Pectin is one of the primary colloid matter in
ramie bast, and UGlcAE gene is a key enzyme gene in biosynthesis of most polysaccharide component of pectin. To inhibit pectin
biosynthesis by antisense RNA or RNAi technology, some important genes such as UGlcAE related to pectin biosynthesis must be
researched firstly. In this study, the full-length sequence of UGlcAE gene was cloned successfully from ramie cultivar—Zhongzhu
1 using degenerate primer RT-PCR, RACE, and screening of full-length cDNA library. The cDNA sequence was 1 257 bp, with a
723 bp encoding region and encode 241 amino acids. The Real-time quantitative PCR analysis showed that UGlcAE mRNA ac-
cumulated abundantly most in root and UGlcAE expression in ramie tissues was root>leaf>bast>xylem. These results are helpful
for regulating and controlling synthetic quantity of pectin by molecular biology method in our further research.
Keywords: Ramie; Pectin; UGlcAE; Clone; Real-time quantitative PCR
果胶是苎麻韧皮部主要的胶质成分之一, 仅次
于半纤维素, 占总胶质成分的 13%到 18%[1], 果胶使
各种胶质组分粘在一起, 难以脱除[2]。脱胶是苎麻加
工中基础而又关键的工序 [3], 其目的是去除胶质 ,
而关键是去除果胶和半纤维素[4-6]。脱胶的效果直接
影响精干麻品质、产量、制成率和深加工。目前国
内外工业生产常用的化学脱胶法工艺落后 ,弊端甚
多, 如降低麻纤维强度、精干麻制成率较低、纤维
可纺性能劣化、工艺流程长、脱胶成本高、煮炼废
液含碱较多严重污染环境和能源消耗大等, 严重制
约了麻纺工业的发展[7]。UGlcAE(尿苷二磷酸-葡糖
糖醛酸-4-表异构酶)在合成果胶各多糖组分中起关
键的作用, 将UDP-葡萄糖醛酸通过差向异构作用形
成 UDP-GalA (UDP-半乳糖醛酸)[8-10], 而 UDP-GalA
是植物细胞初生壁果胶多糖的主要组分[半乳糖醛
酸聚糖 homogalacturonan(HGA)]及其他果胶多糖组
分(如鼠李半乳糖醛酸聚糖-I和鼠李半乳糖醛酸聚糖
-II)合成的直接底物[11-12]。国内外对果胶的研究多集
第 11期 刘建新等: 苎麻果胶合成重要酶 UGlcAE基因的克隆及组织表达 1939


中在果胶的结构功能分析、合成过程以及细胞定位
等方面 [8,13-18], 而从分子水平上对果胶合成过程中
相关酶基因的研究相对较少, 除已鉴定的编码拟南
芥内 AtUGlcAE的小基因家族外[14], 在水稻、玉米等
植物中也发现了 UGlcAE 基因。本研究拟通过克隆
苎麻韧皮部UGlcAE基因, 研究其表达情况, 为后期
采用反义 RNA技术或 RNAi技术抑制果胶合成, 降
低苎麻植株果胶含量, 缓解苎麻脱胶的诸多问题打
下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
苎麻品种中苎 1号, 来自中国农业科学院麻类所
国家种质长沙苎麻圃。
1.2 苎麻果胶合成关键酶 UGlcAE基因的克隆、
分析
1.2.1 引物设计与合成 根据已报道的其他植物
的 U G l c A E 基因核酸序列的高保守区 , 通过
GenBank 联机检索、Clustalw 多序列比对以及
Primer Premier 5 软件设计简并引物, UGlcAE-F 为
5′-TCRTHGAHGGNGAYHTMAACGA-3′; UGlcAE-
R为 5′-GCCATRTCNGGBCKNCCCCA-3′。根据用简
并引物扩增得到的片段序列设计特异引物扩增全长,
5′GSP为 5′-CGAGGTGGAGGATGTGGGTGAAGG-
3′; 3′GSP为 5′-AGCCTCTACGCCGCCACGAAGAA-3′。
1.2.2 UGlcAE 基因片段的克隆 取生长旺盛的
韧皮组织提取总 RNA并反转录, 进行 RT-PCR扩增,
由于使用简并引物需要优化 PCR 条件, 实验设置了
12 种不同的退火温度进行梯度 PCR (Biometra
T-Gradient PCR仪), 以获得适宜的 PCR参数。PCR
程序为 95℃预变性 3 min, 95℃变性 1 min, Tm (Tm以
引物中间 Tm值为基准,在上下各 6℃范围内设 12 个
梯度)退火 50 s, 72℃延伸 90 s, 共 35个循环, 最后
72℃补平 15 min。获得与预期大小一致的片段经切
胶回收、连接、转化及筛选, 获得的阳性克隆, 送往
上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.3 UGlcAE 全长基因的克隆 基于本实验室
已获得的苎麻中苎 1号韧皮部全长 cDNA文库(噬菌
体类型), 以全长 cDNA 文库为模板, 以 5′GSP 和
pTripIEx2载体(SMART全长 cDNA文库试剂盒所用
载体)上的测序引物(5′-TCCGAGATCTGGACGAGC-
3′)扩增 5′末端; 采用 Invitrogen GeneRacer Kit 的
RACE方法, 以 3′GSP为特异引物扩增 3′末端, 然后
根据特异引物序列将 3 个片段拼接起来组成全长序
列。
1.3 苎麻果胶合成关键酶 UGlcAE 基因的表达研
究
1.3.1 引物设计 根据 ACTIN和 UGlcAE基因的
保守区域设计特异引物, ACTIN-F为 5′-GTTGAACC
CTAAGGCTAACAGAG-3′, ACTIN-R为 5′-GGAATC
CAGCACGATACCAG-3; UGlcAE-F为 5-TCCTACA
TCCGCTCCAACAT, 3-UGlcAE-R 为 5-TCCTTGT
TGAGGCCGTAGAC-3。
1.3.2 总 RNA 提取及反转录 方法同上, 材料
取自生长旺盛的中苎 1号植株根部、叶片、木质部、
韧皮部等。
1.3.3 ACTIN 基因作内参的可行性试验 用吸光
值法测定各组织部位的 RNA 量(UNICAM: Unicam
Helios Alpha & Beta), 取等量 RNA进行反转录, 并
测定产物 cDNA 量, 再取等量 cDNA 作模板进行
PCR 反应, 琼脂糖电泳检测亮度, 同时测定吸光值
精确检测产物差异情况。
1.3.4 制备标准曲线样品 分别以 UGlcAE 及管
家基因 ACTIN 为样品, 以 cDNA 为模板进行普通
PCR 扩增, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后
将 PCR产物进行 10倍梯度稀释, 取 103~107做标准
品用于制备标准曲线, 做 5个点。普通 PCR程序, 对
ACTIN为 94℃预变性 3 min, 94℃变性 30 s, 55℃退
火 30 s, 72℃延伸 30 s, 共 35个循环, 最后 72℃补平
5 min; 对 UGlcAE为 94℃预变性 3 min, 94℃变性 30
s, 53℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 共 35个循环, 最后
72℃补平 5 min(用 PE 9600 Thermal Cycler)。
1.3.5 定量 PCR 检测 为了保证反应条件的一
致性, 配制 UGlcAE 和 ACTIN 的主混液(除模板外)
再均分。用 SYBR Green I荧光染料方法来监控 PCR
过程。定量 PCR程序为 95℃预变性 15 min, 95℃变
性 15 s, 60℃退火 1 min, 共 40个循环(用 ABI 7300
Real-Time PCR System); 完成上述步骤后, 把加好
样品的 96孔板放在 ABI 7300型荧光定量 PCR仪中
进行反应, 检测标准曲线和样品的质量及浓度范围,
标准曲线的相关系数应接近 1。
2 结果与分析
2.1 UGlcAE基因的扩增与克隆
采用简并引物法扩增到 400 bp的 UGlcAE基因
片段, 全长 cDNA文库筛选得到 5′端的 700 bp片段,
1940 作 物 学 报 第 34卷

采用 3RACE技术扩增到 400 bp片段。电泳结果如
图 1所示。

图 1 UGlcAE基因片段电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of UGlcAE segment
M: marker III; A: 3′端片段; B: 5′端片段; C: 中间片段。
M: marker III; A: 3′end segment; B: 5′end segment; C: middle
segment.

将上述获得的片段测序并拼接得 1 257 bp的全长
序列, 开放读码框介于 443 bp和 1 165 bp之间, 编码
241个氨基酸序列, GenBank登录号为 EU131378。
2.2 UGlcAE基因片段的生物信息学分析
将获得的 mRNA 编码区序列进行同源性比对
(Blastn), 发现与玉米、水稻、拟南芥等物种的
UGlcAE 基因有高度同源性, 其中与玉米的同源性
最高, 为 84%。将推定的氨基酸序列进行同源性比
对(Blastp)分析, 发现与 56条序列有高度同源性。将
推定的氨基酸序列与已报道的其他物种 UGlcAE 基
因氨基酸序列进行在线 ClustalW2生成系统树(图 2),
结果显示, 苎麻、拟南芥、水稻与玉米等植物明显与
细菌区别开来而被聚成一大类, 其中苎麻的 UGlcAE
推定的氨基酸序列与拟南芥UGlcAE家族基因GAE6
(gi 15229524, ref NP_189024.1)的同源性高于与其他
植物以及拟南芥的其他 UGlcAE 家族基因。利用
ProtParam预测蛋白质的等电点 pI为 9.86, 相对分子质
量为 26 kD, InterPro分析发现存在 NAD(P)结合位点、
NAD-dependent epimerase/dehydratase和 UDP-galact-
ose-4-epimerase结构域, 用NCBI进行在线保守区分
析 , 表明含有高保守区 UDP-galactose-4-epimerase,
此结果与前面同源性预测基本一致。

图 2 苎麻与其他高等植物同源的 UGlcAE酶蛋白氨基酸序列通过 ClustalW软件构建系统树
Fig. 2 Phylogenetic tree generated by multiple UGlcAE amino acid sequence of Boehmeria nivea and other higher plants through
ClustalW

2.3 ACTIN作为内参的可行性分析
ACTIN 基因是肌动蛋白基因, 它是真核细胞内最
保守、含量最丰富的蛋白质之一, 作为细胞骨架和结
构的主要成分, 具有极其重要的细胞生理功能[20-21]。
其基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能
是必不可少的, 常被看作看家基因, 在各种类型的
细胞中都能进行恒定表达, 然而也有一些研究表明,
看家基因的恒定表达都只是在一定类型的细胞或实
验因素作用下“有范围”的恒定。在其他类型的细胞
中或实验因素作用下则是变化的[22-23], 因而有必要
对用作内参照的看家基因 ACTIN在苎麻中的表达量
情况作一个大致研究和了解。
为了排除反转录过程中, RNA数量不同对反转
录效率的影响。采用分光光度计法精确定量总 RNA,
各取等量总 RNA 参与 RT 反应。为进一步消除加
样量差别带来的影响, 对RT反应的产物 cDNA, 用
第 11期 刘建新等: 苎麻果胶合成重要酶 UGlcAE基因的克隆及组织表达 1941


同样的方法进行精确定量 , 并取等量 cDNA 进行
PCR, 电泳结果(图 3)显示 PCR 产物亮度差别很小;
同时以测定吸光值来精确确定产物的量, 变动幅度
很小(表 1), 可知, ACTIN基因的拷贝数经过呈指数
级别增长的 PCR后(除模板外的其他 PCR反应物全
部预混, 再均分, 并在同一条件下反应), 获得的产
物含量差别依然很小。大致证实了作为管家基因的
ACTIN在苎麻的根、木质部、韧皮部和叶片表达量
是恒定的, 完全可以作为定量 PCR 反应的内参照
物使用。

图 3 不同组织的 ACTIN基因 PCR产物电泳图
Fig. 3 PCR product of ACTIN gene in different tissues
A: 根; B: 叶; C: 韧皮部; D: 木质部。
A: root; B: leaf; C: bast; D: xylem.

表 1 不同组织的 ACTIN基因 PCR产物的量
Table 1 PCR product of ACTIN gene in different tissues
组织
Tissue
稀释倍数
Dilution fold
OD260
平均值
Average value
浓度
Concentration(μg μL−1)
根 Root 50 0.085 0.085 0.085 0.085 0.213
叶 Leaf 50 0.091 0.092 0.091 0.091 0.228
韧皮部 Bast 50 0.074 0.074 0.074 0.074 0.185
木质部 Xylem 50 0.083 0.084 0.084 0.084 0.209

2.4 UGlcAE基因的荧光实时定量 PCR
2.4.1 内参照 ACTIN 的实时扩增 将 PCR 产物
经回收后作为标准品 , 进行 10 倍系列稀释 , 选取
103~107 5个稀释度进行荧光定量 PCR, 得到 S形的
扩增曲线, 再根据扩增曲线 5个点的 Ct值得标准曲
线线性方程 Y= –3.4815X+42.9497, 其中 R2=0.997,
数值非常接近 1, 说明 Ct 值和其模板起始拷贝数的
对数值之间的相关性好。标准曲线斜率为–3.4815,
扩增效率为 0.94, 符合试验要求。
将ACTIN与UGlcAE基因在同一条件下进行 PCR
扩增反应, 实时检测, 每个部位重复 3次, 以确保试验
条件一致, 消除试验误差。分别获得扩增曲线(图 4)和
溶解曲线(图 5), 从溶解曲线中可以看出, 峰的形状较
为锐利, 特异性较好, 将产物进行琼脂糖凝胶电泳显
示所得的产物为目的条带。从扩增曲线图中得到 Ct
值, 并根据标准曲线获得不同部位 ACTIN基因的相对
拷贝数, 取平均值, 其值在根部为 312 300; 叶片为
1 050 000; 韧皮部为 7 060 000; 木质部为 1 020 000。


图 4 ACTIN基因扩增曲线图(4个样品 3次重复)
Fig. 4 Extending curve of ACTIN gene (4 samples were repeated 3 times)

1942 作 物 学 报 第 34卷


图 5 ACTIN基因熔解曲线及产物电泳图(4个样品 3次重复)
Fig. 5 Dissolving curve and electrophoresis result of ACTIN gene (4 samples were repeated 3 times)

2.4.2 UGlcAE基因(UDP-glucuronic acid 4-epimerase)
的实时扩增反应 同内参基因 Actin一样用 10倍
系列稀释回收的 PCR 产物进行荧光定量 PCR, 得
到 S 形的扩增曲线, 根据扩增曲线获得标准曲线线
性方程 Y= −3.4280X+43.3346。其 R2=0.9988, 证明
Ct 值和其模板起始拷贝数的对数值之间的相关性
好。Slop= –3.3707, 扩增效率为 0.98。可见实时定量
PCR在 103~107的稀释度范围内有很好线性关系, 符
合试验要求。
将UGlcAE与ACTIN基因在同一条件下进行 PCR
扩增, 实时检测, 每个部位重复 3次, 以确保试验条件
一致, 消除试验误差。分别获得扩增曲线(图 6)和溶解
曲线(图 7), 从溶解曲线中可以看出, 峰的形状较为锐
利, 特异性较好, 将产物进行琼脂糖凝胶电泳显示所
得的产物为目的条带。从扩增曲线图中得到 Ct值, 并
根据标准曲线获得不同部位 UGlcAE 基因的相对拷贝
数, 取平均值, 根部为 7 848 400; 叶片为 1 348 275;
韧皮部为 3 756 158; 木质部为 179 632。
2.4.3 试验结果的校正 虽然 PCR实验时, 每种
样品的的总上样量都是一样的, 但因 RNA 抽提效
率、反转录效率不同以及取样等误差, 每个样品所
含的 cDNA 量并不一定相同, 为了校正此误差, 利
用管家基因 ACTIN 作为内参, 重复实时定量扩增试
验 3 次, 通过标准曲线方程获得 4 个不同组织部位
的UGlcAE的拷贝数, 取平均值, 并除以该样品内参
基因的拷贝数平均值, 得到 UGlcAE 基因的相对含
量, 进行不同部位表达量的比较。UGlcAE与 ACTIN
的比值结果如表 2所示, UGlcAE基因在中苎 1号植
株中的各组织都有表达, 且根部＞叶片＞韧皮部＞
木质部, 根部的表达量占优势。


图 6 UGlcAE基因扩增曲线图(4个样品 3次重复)
Fig. 6 Extending curve of UGlcAE gene (4 samples were repeated 3 times)
第 11期 刘建新等: 苎麻果胶合成重要酶 UGlcAE基因的克隆及组织表达 1943



图 7 UGlcAE基因熔解曲线图(4个样品 3次重复)
Fig. 7 Dissolving curve and electrophoresis result of UGlcAE gene (4 samples were repeated 3 times)

表 2 UGlcAE基因拷贝数的校正
Table 2 UGlcAE gene copy number after proofreading
组织
Tissue
内参(ACTIN)
Copies mean
目的基因(UGlcAE)
Copies mean
目的基因以内参基因校正后的值
UGlcAE/ACTIN
相对百分含量
Relative percentage
content(%)
根 Root 312 300 7 848 400 25.1280 92.65
叶 Leaf 1 050 000 1 348 275 1.2841 4.73
韧皮部 Bast 7 060 000 3 756 158 0.5320 1.96
木质部 Xylem 1 020 000 179 632 0.1761 0.65

3 讨论
已有研究表明果胶各多糖组分合成所需要的底
物 UDP-GalA 主要是通过尿苷二磷酸-葡糖糖醛酸
-4- 表 异 构 酶 (UDP-glucuronate-4-epimerase) 催 化
(UDP-葡 萄 糖 醛 酸 )的 差 向 异 构 作 用 形 成 的
(EC5.1.3.6)[8-10]。Sterling 等[18]认为植物内果胶主要
多糖组分半乳糖醛酸聚糖生物合成过程如下: (1) 在
Golgi 的 cytosolicside 经 UDPGlcA 的差向异构作用
形成 UDP-GalA; (2) UDP GalA被 UDP-GalA:UMP
反向转移体转运到高尔基体的内腔; (3) GalA 经过
GalAT从 UDPGalA传递到一个正在增长的 HGA链,
而 GalAT 的催化部位面对 Golgi 的内腔。释放经过
定位在 Golgi上的核苷二磷酸酶 NDPase(UDPase)水
解成UMP和无机磷酸盐。UMP然后经过UDP-GalA:
UMP反向转移体交换 UDP-GalA而输出。虽然目前
已有许多研究结果证实果胶的合成是在高尔基体进
行的, UGlcAE也是在高尔基体起作用的[15-16,24-25]。
但对 UGlcAE 在植物组织中的定位仍未见报道, 因
此研究此基因进行在基础理论方面也具有一定的价
值。
虽然目前有多种检测基因在 mRNA水平表达的
方法,例如 Northern blot、RT-PCR等, 但它们均存在
一定的局限性。Northern blot虽然定量相对较准, 但
敏感性较差, 而且要求的组织量较多; RT-PCR虽然
较为敏感和特异, 但定量不准, 只能进行半定量。新
近发展起来的实时定量 PCR(real-time PCR)有效地
避免了前述各种方法的弊端 [26], 具有检测范围宽
(~108)、敏感性高(<5拷贝)、精确度高(CV<2%)、无
PCR 后处理步骤、避免了交叉污染、产出率高、可
以进行多重检测等优点[27]。SYBR Green I作为一种
非探针类定量 PCR方法,其主要优点在于简便易行、
经济实用。但是 SYBR Green I与双链 DNA的结合
是非特异性的, 在 PCR 过程中产生非特异产物或引
物二聚体对定量结果都有影响[28]。因此需要优化反
应条件, 并通过溶解曲线分析和凝胶电泳方法证实
PCR 过程的特异性。本试验中溶解曲线的峰形以及
琼脂糖凝胶电泳的带形都较理想, 可知 PCR 扩增产
物特异性较好, 无明显引物二聚体产生; 此外本试
验中所有标准曲线的相关系数都在 0.997 以上, 回
1944 作 物 学 报 第 34卷

归曲线具有良好的相关性, 证实反应过程中的荧光
值可以反映扩增产物含量的实时变化, 因而定量分
析的结果是准确、可靠的。UGlcAE 即尿苷二磷酸-
葡糖糖醛酸-4-表异构酶在合成果胶各多糖组分中起
关键性的作用。UGlcAE 表达量实验结果表明
UGlcAE 在根部的表达量占明显优势, 因而认为根
部可能是 UGlcAE的主要合成部位。
苎麻脱胶过程中所产生的污染及消耗的能源资
源方面与新经济时代的发展趋势格格不入, 而国内
外对从分子生物学方面对苎麻果胶合成的研究目前
仍未见报道, 这无疑是一大遗憾, 本研究在提高苎
麻品质质量 , 节约能源 , 资源以及环保方面 , 具有
一定的研究及实用价值。
4 结论
克隆了 1 257 bp的UGlcAE基因序列, 开放读码
框介于 443和 1 165 bp之间, 编码 241个的氨基酸
序列, 构建了苎麻荧光实时定量 PCR 检测体系, 并
证实 UGlcAE 基因在各组织中的表达量为根部＞叶
片＞韧皮部＞木质部, 根部的表达量占优势。
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《农业展望》2009年征订及征稿启事

《农业展望》是经国家新闻出版总署批准，由中华人民共和国农业部主管、农业部市场与经济信息司
指导、中国农业科学院农业信息研究所主办的综合性农业科技类刊物，国内外公开发行。
办刊宗旨：立足于对主要农产品生产、供需、价格、进出口的分品种分析与预测，密切关注当前农业
经济发展进程中一些重大的关键性或热点、焦点问题，重点报道对农业经济形势、农业科技与农业、农产
品贸易的分析和展望，既强调对农业经济领域的短期分析，也侧重于对农业政策、产业发展、农业贸易、
农产品供需和粮食安全等的长期展望，并且每期都以一定篇幅刊载国内外主要农产品数据信息。
本刊设有“产品预测”、“农业生产展望”、“农业消费展望”、“农业贸易展望”、“农业经济展望”、“农
业科技展望”和“数据信息”七大栏目。
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