全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 533538 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30670183)和河南省教育厅基金项目(2007180004)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 郝福顺, E-mail: haofsh@henu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: wshengwu@126.com
Received(收稿日期): 2009-07-17; Accepted(接受日期): 2009-12-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00533
胞质碱化介导了外源一氧化氮诱导的蚕豆气孔关闭
赵世领 孙立荣 张 换 马丽娅 陆宝石 郝福顺*
河南省植物逆境生物学重点实验室 / 河南大学生命科学学院, 河南开封 475004
摘 要: 以蚕豆(Vicia faba L.)为材料, 利用 pH荧光探针 SNARF-1-AM和激光共聚焦显微镜研究外源一氧化氮(nitric
oxide, NO)对表皮条保卫细胞胞质 pH变化以及 pH对 NO诱导气孔关闭的影响。结果表明, 与对照相比, 100 µmol L–1
NO供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)可显著增加保卫细胞胞质 pH (从 6.91升高到 7.19, 增加约 0.28个单位), 并
诱导气孔关闭。NO清除剂 c-PTIO和弱酸丁酸均能显著抑制 SNP诱导的保卫细胞胞质碱化和气孔关闭, 而弱碱苄胺
则促进 NO诱导的胞质碱化和气孔关闭, 另外, 不产生 NO的 SNP结构类似物 Fe(II)CN和 Fe(III)CN不能诱导保卫细
胞胞质碱化和气孔关闭, 说明保卫细胞胞质碱化介导了外源 NO 诱导的气孔关闭。未发现 NO 诱导保卫细胞胞质碱
化过程中液泡和细胞壁的 pH发生显著变化, 说明该过程中, 胞质的质子可能主要不是进入液泡或细胞壁。
关键词: 一氧化氮; pH; 蚕豆; 气孔关闭
Cytoplasmic Alkalization Mediates Exogenous Nitric Oxide-Induced Stomatal
Closure in Vicia faba
ZHAO Shi-Ling, SUN Li-Rong, ZHANG Huan, MA Li-Ya, LU Bao-Shi, and HAO Fu-Shun*
Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology, College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, China
Abstract: The effects of exogenous NO on changes in cytosolic pH of guard cells from epidermal fragments and of the pH on
NO-induced stomatal closure in Vicia faba were investigated by using a pH specific fluorescence probe SNARF-1-AM and a
confocal laser scanning microscopy. The results showed that treatments with 100 μmol L–1 sodium nitroprusside (SNP), a widely
used NO donor, led to a significant increase in cytosolic pH (from 6.91 to 7.19, i.e. 0.28 pH unit) and stomatal closure in com-
parison with the control. Furthermore, SNP-induced cytosolic alkalization and stomatal closure were significantly inhibited by NO
scavenger c-PTIO or weak acid butyrate, and promoted by the weak base benzylamine. Whereas two structural analogs of SNP
such as Fe(II)CN and Fe(III)CN, which can not release NO, failed to induce guard cell cytoplasmic alkalization and stomatal clo-
sure. These findings suggest that cytoplasmic alkalization of guard cells mediates NO-induced stomatal closure. In addition, pH in
guard cell vacuoles and cell walls was measured during the cytosolic alkalization. However, no significant changes of pH in the
two regions were found, implying that the cytoplasmic protons of guard cells may not go into vacuoles or cell walls during the
NO-promoted alkalization in Vicia faba.
Keywords: Nitric oxide; pH; Vicia faba; Stomatal closure
信号分子一氧化氮(nitric oxide, NO)不仅在调节植物
生长发育、细胞程序性死亡以及应答逆境胁迫反应中发挥
重要作用 [1-4], 而且参与调节脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯
(MeJA)、水杨酸、重碳酸盐、一氧化碳、病原菌等诱导的
气孔关闭以及光诱导的气孔开放过程 [4-12]。植物细胞中
NO 主要来源于硝酸还原酶 (NR)和一氧化氮合酶
(NOS)[13-14]。
在 ABA 诱导的气孔关闭中, 保卫细胞 NO 的合成依
赖于质膜 NADPH氧化酶 AtrbohD和 AtrbohF产生的活性
氧(ROS)[15-16], 即 NO位于 ROS的下游。在蚕豆(Vicia faba
L.)中证明, NO 能够激活保卫细胞胞质钙库释放 Ca+, 使
胞质 Ca2+浓度增加, 进而抑制质膜内向 K+通道并激活 Cl-
通道, 促进气孔关闭[17]。另外, 较高浓度的 NO能够抑制
保卫细胞 Ca2+不敏感的质膜外向K+通道, 调节气孔运动[18]。
pH 作为信号或信使参与植物许多生理过程的调节,
这些过程包括植物适应光强的变化、顶端生长以及植物应
答逆境胁迫反应等[19-20]。在 ABA和 MeJA诱导气孔关闭
中, 保卫细胞胞质碱化是关键步骤, 它主要通过激活质膜
534 作 物 学 报 第 36卷

外向 K+通道导致气孔关闭, 而且胞质碱化位于 ROS 和
NO信号的上游[21-26]。
研究发现 , 在植物气孔运动过程中 , 保卫细胞中信
号的作用关系非常复杂 , 不少信号可以相互调节 [27], 例
如, 在 ABA 诱导的气孔关闭中, 保卫细胞胞质碱化先于
ROS 的产生[25], ROS 也能诱导保卫细胞胞质碱化[28]。另
外, 产生 ROS 的质膜 NADPH 氧化酶的活性受 Ca2+调控,
ROS 则可超极化激活保卫细胞质膜 Ca2+通道, 导致胞质
Ca2+浓度增加[29-30]。研究表明, NO能够促进气孔关闭[14],
但保卫细胞胞质 pH是否参与 NO诱导的气孔关闭还不清
楚。我们利用 pH 荧光探针研究发现, 外源 NO 能够通过
增加保卫细胞胞质 pH导致气孔关闭。
1 材料与方法
1.1 药品和试剂
荧光染料 5-(and-6)-carboxy seminaphthorhodafluor-1-
acetoxymethylester (SNARF-1-AM)、Orgeon Green(OG)488
dextran (分子量 10 000)和 Texas Red(TR) dextran (分子量
10 000)购自 Invitrogen公司, 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-
tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (c-PTIO)、苄胺、丁
酸、尼日利亚菌素和硝普纳(SNP)购自 Sigma 公司, 其他
试剂购自 Amresco公司。
1.2 试验材料
将蚕豆种子用 75%乙醇表面消毒 5 min, 在生化培养
箱中催芽 3~4 d后播种于培养土中。蚕豆生长的光暗周期
为 12 h/12 h, 光照强度为 0.2~0.3 mmol m–2 s–1, 温度为
18~22℃, 相对湿度 70%左右。取 3~4 周龄蚕豆苗顶端第
1和第 2对完全展开的叶片进行实验。
1.3 气孔开度测定
按 Zhang 等[28]的方法略加改动, 测定蚕豆叶片的气
孔开度。从蚕豆叶片背轴面剥离表皮条, 刷掉叶肉细胞,
将表皮条放在无 CO2的 Mes-KCl 缓冲液中(10 mmol L–1
Mes, 50 mmol L–1 KCl, 100 µmol L–1 CaCl2, pH 6.15), 光
下(0.2 mmol m–2 s–1, 22℃)放置 2.5 h诱导气孔开放, 然后
将表皮条转到含有 NO 供体 SNP(加或不加 c-PTIO)、100
µmol L–1 Fe(II)CN或 Fe(III)CN的上述 Mes-KCl缓冲液中
一段时间后, 测定气孔开度。使用 c-PTIO时, 表皮条先与
c-PTIO温育 30 min, 然后再用 SNP处理。实验至少重复
3次, 每次测定约 50个气孔。
1.4 保卫细胞胞质 pH测定
参照 Zhang 等[28]的方法测定保卫细胞 pH 荧光。将
气孔完全张开的蚕豆表皮条置于导入缓冲液(10 mmol L–1
Mes, 50 mmol L–1 KCl, pH 6.15)中, 加入 SNARF-1-AM
(终浓度 20 µmol L–1)和多聚醇 F-127 (终浓度 0.05%),
25~27℃下避光孵育 30 min, 然后用新鲜导入缓冲液漂洗
两次, 将表皮条贴附于聚丙烯酸酯塑料培养皿底部, 置激
光扫描共聚焦显微镜载物台上 , 迅速在视野里找到保卫
细胞, 仔细加入 SNP、c-PTIO、Fe(II)CN、Fe(III)CN、丁
酸或苄胺等溶液并扫描。在研究 c-PTIO 对保卫细胞 pH
影响时 , 向固定在显微镜载物台上的表皮条加入该试剂
15 min后, 再加入 100 µmol L–1 SNP, 然后记录 pH荧光强
度值。激光共聚焦显微镜为双通道检测模式, 激发光 Ex
为 488 nm, 通道 1 (channel 1)发射光 Em为 500~560 nm,
通道 2 (channel 1)发射光 Em为 580~640 nm。一般 20 s扫
描一次, 每次分别记录通道 1和通道 2的荧光强度值。实
验重复 3次, 每次至少测定 10个气孔。
1.5 pH标准曲线的制作
将气孔完全张开并已用 SNARF-1-AM 孵育的蚕豆表
皮条置含 10 µmol L–1尼日利亚菌素的不同 pH (5.5、6.0、
6.5、7.0、7.5和 8.0) Mes导入缓冲液(10 mmol L–1 Mes, 50
mmol L–1 KCl)中, 黑暗孵育 20 min, 然后通过激光共聚焦
显微镜记录不同 pH 值下保卫细胞胞质荧光强度, 计算荧
光比率(channel 1∶channel 2), 以荧光比率与相应 pH值作
图, 即得到 pH标准曲线。根据 pH标准曲线可将不同处理
条件下得到的荧光比率值转化为 pH 值。为确保不同实验
之间具有可比性, 所有荧光图像都在相同设置下获得。尼
日利亚菌素是 K+/H+交换离子载体, 可使保卫细胞胞质内
外 pH达到平衡。研究发现, 在 pH 5.5~8.0范围内, 从蚕豆
保卫细胞得到的荧光比率与 pH值呈线性关系(图 1)。



图 1 保卫细胞 pH荧光标准曲线图
Fig. 1 Calibration curve of pH-dependent fluorescence in guard
cells
荧光强度比值是至少 5个值的平均值, 每个值代表保卫细胞胞质区
域平均荧光强度的比值。
Ratios of fluorescence intensity are averaged from at least 5 values,
each representing the mean intensity ratio of the area over the whole
guard cell tested.

1.6 保卫细胞细胞壁 pH测定
参照 Rober-Kleber等[31]的方法测定细胞壁 pH, 方法
略有改动。将气孔完全张开的蚕豆表皮条放在导入缓冲液
(10 mmol L–1 Mes, 50 mmol L–1 KCl, pH 6.15)中, 加入 OG
488和 TR使其终浓度分别为 30 µmol L–1和 50 µmol L–1,
在 25~27℃下避光孵育 20 min, 然后用新鲜导入缓冲液漂
洗表皮条两次 , 将表皮条贴附于聚丙烯酸酯塑料培养皿
底部, 在激光共聚焦显微镜下观察保卫细胞细胞壁 pH 荧
光。用 100 µmol L–1 SNP处理表皮条, 观察 0 min和 15 min
第 3期 赵世领等: 胞质碱化介导了外源一氧化氮诱导的蚕豆气孔关闭 535


细胞壁 pH的荧光变化。激光共聚焦显微镜为双通道检测
模式, OG 488激发光 Ex为 488 nm, 发射光 Em为 500~560
nm (channel 1); TR 的 Ex 为 543 nm, Em 大于 590 nm
(channel 2)。同时从两通道(channel 1和 channel 2)中检测
得到的扫描信号可自动转换为荧光比率 (channel 1∶
channel 2)信号, 输出计算机(红色荧光)。荧光比率越大、
荧光强度越强, 胞壁 pH 越小。为确保不同实验之间具有
可比性, 所有荧光图像都在相同设置下获得。实验重复 3
次, 每次至少测定 10个气孔。
1.7 统计分析
所有实验至少重复 3 次。数据为平均值±标准误, 用
Student’s t 检验分析处理与对照的差异显著性, P 值小于
0.05被认为是差异显著。
2 结果与分析
2.1 外源 NO诱导保卫细胞胞质 pH升高
为确定 pH 在 NO 诱导气孔关闭中的作用 , 利用
SNARF-1-AM研究外源 NO对蚕豆保卫细胞胞质 pH的影
响, 如图 2所示, 100 µmol L–1 SNP明显增加蚕豆保卫细
胞胞质 pH, 在 SNP处理表皮条约 1 min后, 胞质 pH开始
升高, 1~5 min pH升高的速度较快, 5~10 min pH升高速度
减慢, 在处理后 10~15 min, pH增加不明显, 在 SNP处理
超过 5 min 后, 处理与对照差异显著, 在处理开始后 10
min内, 胞质 pH以时间依赖的方式增加, pH从 6.91升高
到 7.19, 增加约 0.28个单位。
c-PTIO是 NO的清除剂, 当先用 c-PTIO孵育表皮条
再用 SNP 处理时, 保卫细胞胞质 pH 没有显著升高(图 2),
说明 c-PTIO抑制了 SNP诱导的保卫细胞胞质碱化。SNP
除产生 NO外, 也产生氰化物[32], 因此利用不产生 NO的
SNP结构类似物 Fe(II)CN和 Fe(III)CN作为负对照进行研
究, 结果证明, 100 µmol L–1 Fe(II)CN和 Fe(III)CN不能诱
导保卫细胞胞质碱化, 说明是 NO而非氰化物增加了保卫
细胞胞质 pH。
2.2 丁酸和苄胺对NO诱导保卫细胞胞质 pH变化的影响
为进一步确定外源 NO 对保卫细胞胞质 pH 的作用,
研究了可透过膜的弱酸丁酸和可透过膜的弱碱苄胺对
SNP诱导蚕豆保卫细胞胞质 pH变化的影响。结果表明, 10
mmol L–1丁酸可显著抑制 SNP诱导的保卫细胞胞质 pH升
高, 10 mmol L–1苄胺则明显促进 SNP诱导的胞质 pH升高
(图 3)。说明外源 NO导致保卫细胞胞质发生碱化。
2.3 保卫细胞胞质碱化介导了外源 NO诱导的气孔关闭
如图 4所示, 100 µmol L–1 SNP能显著诱导蚕豆气孔



图 2 SNP、c-PTIO、Fe(II)CN及 Fe(III)CN对保卫细胞胞质 pH的影响
Fig. 2 Effects of SNP, c-PTIO, Fe(II)CN, or Fe(III)CN on guard cell cytosolic pH
A：不同处理时间 pH变化荧光图; B：pH随时间变化曲线图; C：处理 15 min时 pH荧光图; D：处理 15 min的胞质 pH。Control：对照; SNP：
100 µmol L–1 SNP 处理; S+P：100 µmol L–1 SNP 与 200 µmol L–1 c-PTIO处理; P：200 µmol L–1 c-PTIO处理; FeII：100 µmol L–1 Fe(II)CN处理;
FeIII：100 µmol L–1 Fe(III)CN处理。图 D中星号表示处理与其相应对照的 pH在 0.05水平差异显著。
A: fluorescence intensity images of pH over time; B: changes of pH with treatment time; C: images of fluorescence intensity of pH in treatments with
SNP for 15 min; D: pH of treatments with SNP for 15 min. S, S+P, P, FeII and FeIII respectively represent treatments with 100 µmol L–1 SNP, 100
µmol L–1 SNP and 200 µmol L–1 c-PTIO, 200 µmol L–1 c-PTIO, 100 µmol L–1 Fe(II)CN or 100 µmol L–1 Fe(III)CN. In Figure D, asterisk represents
that the difference between treatments and control in cytosolic pH is significant at the 0.05 probability level.
536 作 物 学 报 第 36卷



图 3 丁酸和苄胺对外源 NO诱导保卫细胞胞质 pH变化的影响
Fig. 3 Effects of butyric acid and benzylamine on changes in guard cell cytosolic pH induced by exogenous NO
A：处理 15 min后的荧光图; B：处理 15 min后的 pH变化图。Control：对照; S：100 µmol L–1 SNP; S+Bu：100 µmol L–1 SNP+10 mmol L–1丁
酸; Bu：10 mmol L–1丁酸; S+Be：100 µmol L–1 SNP+10 mmol L–1苄胺; Be：10 mmol L–1苄胺。图中星号表示处理与其相应对照的 pH在 0.05
水平差异显著。
A: fluorescence intensity images of pH in treatments with SNP for 15 min; B: pH of treatments with SNP for 15 min; S: 100 µmol L–1 SNP; S+Bu: 100
µmol L–1 SNP+10 mmol L–1 butyric acid; Bu: 10 mmol L–1 butyric acid; S+Be: 100 µmol L–1 SNP+10 mmol L–1 benzylamine; Be: 10 mmol L–1 ben-
zylamine. In Figure B, asterisk represents that the difference between treatments and control in cytosolic pH is significant at the 0.05 probability level.



图 4 SNP、c-PTIO、丁酸和苄胺对外源 NO诱导气孔关闭的影响
Fig. 4 Effects of SNP, c-PTIO, butyric acid, and benzylamine on
stomatal closure induced by exogenous NO
Control：对照; S：100 µmol L–1 SNP; S+P：100 µmol L–1 SNP+200 µmol
L–1 c-PTIO; P：200 µmol L–1 c-PTIO; S+Bu：100 µmol L–1 SNP+10
mmol L–1丁酸; Bu：10 mmol L–1丁酸; S+Be：100 µmol L–1 SNP+10
mmol L–1苄胺; Be：10 mmol L–1苄胺; FeII：100 µmol L–1 Fe(II)CN;
FeIII：100 µmol L–1 Fe(III)CN。双星号和单星号分别表示处理与其
相应对照的气孔开度在 0.01和 0.05水平差异显著。
S: 100 µmol L–1 SNP; S+P: 100 µmol L–1 SNP+200 µmol L–1 c-PTIO; P:
200 µmol L–1 c-PTIO; S+Bu: 100 µmol L–1 SNP+10 mmol L–1 butyric
acid; Bu: 10 mmol L–1 butyric acid; S+Be: 100 µmol L–1 SNP+10 mmol
L–1 benzylamine; Be: 10 mmol L–1 benzylamine; FeII: 100 µmol L–1
Fe(II)CN; FeIII: 100 µmol L–1 Fe(III)CN. Double asterisks and single
asterisk represent that the differences between treatments and their
controls in stomatal aperture are significant at the 0.01 and 0.05 prob-
ability levels, respectively.

关闭, c-PTIO显著缓解 SNP诱导的气孔关闭, Fe(II)CN和
Fe(III)CN对气孔关闭的效应不明显, 10 mmol L–1丁酸部
分抑制 SNP 诱导的气孔关闭, 10 mmol L–1 苄胺则促进
SNP 导致的气孔关闭(图 4), 说明保卫细胞胞质碱化参与
外源 NO诱导的蚕豆气孔关闭。
2.4 外源 NO对保卫细胞液泡 pH和细胞壁 pH的影响
液泡在细胞酸碱平衡调节中起重要作用, 因此检测
了 SNP处理蚕豆表皮条 15 min内保卫细胞液泡 pH的变
化, 结果未观察到处理与对照之间存在显著差别(图 5-C)。
细胞壁是植物的一个重要质子库, 用特异显示细胞壁 pH
的荧光探针 OG488和 TR检测细胞壁 pH的变化, 但未发
现蚕豆保卫细胞壁 pH在 100 µmol L–1 SNP处理 15 min
后与对照有显著差别(图 5-E)。
3 讨论
证据表明, 保卫细胞胞质 pH变化与气孔运动密切相
关, 胞质碱化参与 ABA、MeJA 和 H2O2 诱导的气孔关
闭[25,28], 但胞质 pH 是否在 NO 诱导的蚕豆气孔关闭中起
作用还不清楚。本研究表明, 保卫细胞胞质 pH 变化介导
了 NO 诱导的气孔关闭, 该结果与 ABA、MeJA 和 H2O2
导致保卫细胞胞质 pH 升高的结果类似, 说明保卫细胞胞
质碱化可能是气孔关闭前的一个普遍信号。
以前的研究表明, 在 ABA 诱导的气孔关闭中, 胞质
碱化先于NO的积累[26], 胞质碱化导致ROS水平升高, 产
生 NO[15-16]。而我们的研究证明 NO能够诱导保卫细胞胞
质碱化, 因此保卫细胞中也可能存在不依赖 ROS 的 NO
产生途径, NO 可能通过诱导保卫细胞胞质 pH 变化影响
Ca2+和 K+等离子通道活性导致气孔关闭, 这些结果说明
在保卫细胞中, pH信号可能既在 NO信号的上游又在 NO
信号的下游发挥作用。
保卫细胞胞质碱化过程中质子的去向一直是令人感
兴趣的问题。Zhang等[28]发现, H2O2诱导蚕豆保卫细胞胞
质 pH升高的同时, 液泡中的 pH降低, 推测气孔关闭前质
子从胞质进入液泡, 但我们多次观察 SNP作用下液泡 pH
荧光的变化, 未发现液泡 pH明显降低(图 5), 推测可能的
原因有两个, 一是 NO作用下胞质中的质子未进入液泡或
进入液泡的较少, 而液泡溶液的缓冲能力强, 进入液泡的
质子不足以明显降低液泡的 pH。二是用荧光检测液泡 pH
变化的方法灵敏度不够。
保卫细胞质膜上存在许多转运 H+的转运体, 能够将
H+转运到质膜外 , 导致细胞壁酸化 , 因此本研究测定了
NO对保卫细胞细胞壁 pH的影响, 但未发现NO显著改变
第 3期 赵世领等: 胞质碱化介导了外源一氧化氮诱导的蚕豆气孔关闭 537




图 5 外源 NO对保卫细胞液泡 pH和细胞壁 pH的影响
Fig. 5 Effects of exogenous NO on pH in vacuoles and cell walls of guard cells
A：保卫细胞透射光图; B：保卫细胞胞质和液泡 pH荧光图, area 1、area 2和 area 5为胞质区, area 3、area 4和 area 6为液泡区; C：胞质和液
泡 pH随时间变化曲线图; D：保卫细胞壁 pH荧光图; E：保卫细胞壁 pH相对荧光。实验中 SNP的浓度为 100 µmol L–1。
A: transmission light image; B: fluorescence intensity images of cytosolic pH and vacuolar pH in guard cells. Circles point to analyzed areas with
cytoplasm (1, 2, 5) and vacuoles (3, 4, 6); C: changes of pH in cytoplasm and vacuoles with treatment time; D: fluorescence intensity images of guard
cell wall pH; E: relative fluorescence intensity for guard cell wall pH. The concentration of SNP used in the experiments was 100 µmol L–1.

细胞壁 pH (图 5)。
许多代谢反应都能改变细胞中的 pH, 因此推测 NO
诱导保卫细胞胞质 pH 升高过程中, 胞质中可能发生了消
耗质子的代谢反应, 促进胞质 pH 升高, 进而激活质膜外
向 K+通道, 诱导气孔关闭, 其详细的机理有待深入研究。
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