全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1405−1409 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871495), 教育部新世纪优秀人才计划项目, 重庆市杰出青年基金项目(2008BA1033)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn
Received(收稿日期): 2008-11-22; Accepted(接受日期): 2009-02-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01405
水稻黄绿叶基因 YGL4的遗传分析和分子定位
刘梦梦 桑贤春 凌英华 杜 鹏 赵芳明 杨正林 何光华*
西南大学水稻研究所 / 农业部西南作物遗传改良与育种重点开放实验室, 重庆 400716
摘 要: 通过 EMS诱变恢复系缙恢 10号, 获得了一个稳定遗传的全生育期黄绿化叶色突变体。其叶绿素总含量稳
定在 2.01~2.28 mg g−1之间, 仅有对照的 38.2%~50.5%。与对照相比, 黄绿叶突变体的有效穗和株高显著下降, 而主
穗长、一次枝梗数、主穗实粒数、结实率、千粒重则无明显差异。遗传分析表明该性状受 1对隐性核基因控制, 命
名为 YGL4。利用微卫星标记将 YGL4 定位于第 10 染色体微卫星标记 RM3123 和 RM590 之间, 分别距其 7.6 cM 和
7.8 cM。在两标记间进一步设计 SSR引物, 将该黄绿叶基因定位于 RM1162和 RM7093之间, 分别距其 1.8 cM和 4.0
cM。为该 YGL4基因的分子标记辅助选择育种和图位克隆奠定了基础。
关键词: 水稻(Oryza sativa L.); 黄绿叶; 遗传分析; 分子定位
Genetic Analysis and Molecular Mapping of a Yellow Green Leaf Gene (YGL4)
in Rice (Oryza sativa L.)
LIU Meng-Meng, SANG Xian-Chun, LING Ying-Hua, DU Peng, ZHAO Fang-Ming, YANG Zheng-Lin, and
HE Guang-Hua∗
Rice Research Institute of Southwest University / Key Laboratory of Southwest Crop Genetic Improvement and Breeding, Ministry of Agriculture,
Chongqing 400716, China
Abstract: A leaf color mutant was obtained by EMS treating seeds of restorer line Jinhui 10, this mutation showed complete yel-
low green leaves during the life, and could be regenerated and inherited stably according to the observation of 5 generations. The
content of its total chlorophyll ranged from 2.01 to 2.28 mg g−1, which was only 38.2% to 50.5% of the original parent. Compared
with the original parent, the mutation had no significant difference in the traits of main panicle length, first branch number, filled
grain number of main panicle, seed setting rate and 1000-grain weight, except the effective panicle and plant height which were
decreased significantly. Genetic analysis of F2 populations confirmed that the mutational character was controlled by a single
recessive nuclear gene, temporarily designated as YGL4. The gene was mapped between two microsatellite markers RM3123 and
RM590, with genetic distances of 7.6 and 7.8 cM to the two markers respectively. New microsatellite markers were designed be-
tween RM3123 and RM590, and the YGL4 gene was final mapped between RM1162 and RM7093, with genetic distances of 1.8
and 4.0 cM to each of them respectively. This result provided a foundation of molecular marker-assisted breeding and map-based
cloning of YGL4 gene.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Yellow green leaf; Genetic analysis; Molecular mapping
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作
物之一, 是全球超过 50%人口的主要食物和热量来
源。叶片是植物进行光合作用的主要器官, 水稻产
量的 95%来自于叶片的光合作用, 叶绿体除了光合
作用外, 还参与了氨基酸、脂肪酸、植物生长物质、
核苷酸、维生素以及次生代谢产物的合成[1]。因此,
叶片器官的突变对水稻的光合作用乃至生长发育都
会产生重要的影响。近年来, 叶色突变体的利用价
值越来越受到关注, 现已成为研究植物光合作用机
制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控
1406 作 物 学 报 第 35卷

制机理的特殊材料[2-5], 同时叶色突变体在高光效育
种和标记性状的利用上也具有重要的应用价值[6-8]。
据不完全统计, 目前报道的水稻叶色突变的相
关基因已经超过 80个, 这些突变体大致可分为白化
型、黄化型、条纹型、转绿型、斑马叶等 5 大类。
其中黄化叶色突变体出现最多, 且大多数受隐性核
基因控制 [9-10], 已对部分基因进行了染色体定
位[11-13], 除了第 12染色体外, 其余 11条染色体上均
有分布。在被定位的基因中至少 6 个叶色基因已被
克隆[14-16]。
我们在 EMS 诱变籼稻恢复系缙恢 10 号后代中
发现一个稳定遗传的黄绿叶突变体 ygl4 (yellow
green leaf 4), 对其形态、叶绿素动态含量、主要农
艺性状、遗传特性等进行了分析, 并利用微卫星标
记对该基因进行了定位, 以期为突变基因的克隆及
叶绿素缺失机理研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
缙恢10号是西南大学水稻研究所选育的优良三
系杂交水稻恢复系, 已培育出多个品种通过国家或省
审定。利用 EMS 诱变缙恢 10 号种子, 获得了一个黄
绿叶突变体, 经过连续自交 5代, 遗传性状稳定。
1.2 叶绿素含量的测定
在苗期、抽穗期和成熟期测定突变体和对照缙
恢 10号的叶绿素含量。突变体和对照各取 5株独立
测定 , 测定部位为倒二叶 , 时间为上午 8:30~9:00,
测定方法参照 Lichtenthaler[17]。
1.3 农艺性状的考查与分析
成熟期从小区中随机选取 5 株, 考查株高、有
效穗、穗长、一次枝梗数、主穗实粒数、千粒重、
结实率等农艺性状, 利用 Microsoft Excel 软件进行
统计分析。
1.4 遗传分析
2007 年夏在西南大学水稻研究所配制西农
1A×ygl4 杂交组合, 2007 年秋于海南播种 F1, 获得
F2 代种子。2008年夏在西南大学水稻研究所播种
F2代, 对每株进行叶色表型调查。
1.5 DNA提取
于苗期选取幼嫩的叶片按 CTAB 法提取亲本和
基因池 DNA[18]。群体 DNA按碱煮法提取[19]。
1.6 SSR分析
参照 http://www.gramene.org/microsat/, 由上海
生工生物工程有限公司合成 SSR引物。PCR反应总
体系为 25 μL, 含 2.5 μL 10×PCR buffer、1.3 μL 25
mmol L−1 MgC12、1.0 μL 2.5 mmol L−1 dNTPs、16.0
μL的 ddH2O、2.0 μL 10 μmol L−1引物、2.0 μL模板
DNA、0.2 μL 5 U μL−1 Taq DNA聚合酶。PCR反应
程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 55℃退火
30 s, 72℃复性 1 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min。
PCR 产物经 10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 快
速银染后观察[20]。
1.7 遗传图谱的构建
选取西农 1A × ygl4群体的 F2为作图群体。将
具有 ygl4带型的单株记为B, 具有西农 1A带型的单
株记为 A, 具有 F1带型的单株记为 H, 用Mapmaker
3.0进行数据分析和作图。用 Kosambi函数将重组率
转化为遗传距离。
2 结果与分析
2.1 ygl4的表型和主要农艺性状
ygl4全生育期所有叶片均表现为黄绿色(图 1),
该性状能稳定遗传。突变体的有效穗和株高与对照
相比分别下降 30.0%和 8.9%, 其他农艺性状与对照
相比均没有显著变化(表 1)。


图 1 黄绿叶突变体分蘖期的表型
Fig. 1 Phenotype of yellow green leaf mutant and original
parent (WT) at tillering stage

2.2 ygl4的叶绿素含量
ygl4 的叶绿素含量比对照下降 38.2%~50.5%,
其中叶绿素 a 和叶绿素 b 的含量均有较大幅度的下
第 8期 刘梦梦等: 水稻黄绿叶基因 YGL4的遗传分析和分子定位

1407


表 1 黄绿叶突变体的农艺性状
Table 1 Agronomic characters of yellow green leaf mutant and its original parent (WT)
材料
Material
有效穗
Effective
panicle
株高
Plant height
(cm)
主穗长
Main panicle
length (cm)
主穗实粒数
Filled grain number of
main panicle
一次枝梗数
First branch number
千粒重
1000-grain
weight (g)
结实率
Seed setting rate
(%)
ygl4 13.9 B 91.7 B 20.8 A 168 A 10.9 A 22.2 A 71.9 A
WT 19.3 A 100.7 A 20.5 A 171 A 10.1 A 21.9 A 69.5 A
同一列中标以相同字母的数字在 P=0.01水平上差异不显著。
Values followed by the same capital letter for a character are not significantly different at P=0.01.

表 2 不同生育时期 ygl4与野生型倒二叶的叶绿素含量
Table 2 Chlorophyll content of the upper second leaf of ygl4 and original parent (WT) at different developmental stages (mg g−1)
苗期 Seedling stage 分蘖期 Tillering stage 抽穗期 Heading stage 光合色素
Photosynthetic pigments ygl4 WT ygl4 WT ygl4 WT
总叶绿素 Total chlorophyll 2.27 B 3.67 A 2.01 B 4.06 A 2.28 B 4.28 A
叶绿素 a Chlorophyll a 2.06 B 2.50 A 1.79 B 2.81 A 2.16 B 2.93 A
叶绿素 b Chlorophyll b 0.21 B 1.17 A 0.23 B 1.25 A 0.16 B 1.35 A
叶绿素 a/b Chlorophyll a/b 9.76 A 2.14 B 7.91 A 2.25 B 13.82 A 2.17 B
同一列中标以相同字母的数字在 P=0.01水平上差异不显著。
Values followed by the same capital letter for a character are not significantly different at P=0.01.

降, 说明 ygl4 黄绿叶性状是由总叶绿素含量的大幅
度下降引起的。同时, 叶绿素 a 与叶绿素 b 的比值
由野生型的 2.14~2.25 变化为突变体的 7.91~13.82,
表明叶绿素 b 的下降幅度大于叶绿素 a。从突变表
型和叶绿素含量之间的关系来看, 叶绿素含量越低,
叶色越浅, 二者存在明显的相关性, 这与目前报道
的大多数叶色突变性状类似[21]。
2.3 YGL4的遗传分析
杂交组合西农 1A × ygl4的 F1代植株叶片均表
现为绿叶, 表明该突变体受隐性基因控制, F2 代单
株间叶色出现分离, 表现叶色正常绿色和黄绿叶两
种情况, 在 4 305株总群体中, 正常株 3 245株、黄
绿叶 1 060 株, 经χ2测验, 绿苗与黄绿苗符合 3∶1
的分离比例(χ2=0.31<χ20.05=3.84), 表明该基因受 1
对隐性核基因控制。
2.4 YGL4的分子图谱定位
选用西农 1A × ygl4的 F2作为定位群体, 共获得
了 1 060 个突变单株, 用于基因定位。在 F2代中分
别选取 10 株正常株和 10 株黄绿叶突变株构建正常
基因池和突变基因池。选用 400对均匀分布于 12条
染色体上的微卫星标记对亲本西农 1A 和 ygl4 进行
多态性分析, 具有多态性的标记 100 对, 多态性频
率 25%, 进一步利用在两亲本间表现出多态性的引
物扩增正常基因池和突变基因池, 并用在基因池间
检测到的多态性引物进行 F2单株验证, 结果发现位
于水稻第 10染色体的标记 RM3123和 RM590与黄
绿叶突变基因表现连锁(图 2), 其中 RM3123 有 161
个单交换株, RM590 有 165 个单交换株。在两标记
间进一步设计 15 对引物 , 结果发现 RM1162 和
RM7093 存在多态性 , 继续对隐性群体进行分析 ,
发现 RM1162有 38个单交换株, RM7093有 85个单
交换株 , 最终将该黄绿叶基因定位于 RM1162 和
RM7093之间, 分别相距 1.8 cM和 4.0 cM (图 3)。

图 2 SSR标记 RM590与突变位点连锁验证
Fig. 2 Linkage analysis between SSR marker RM590 and
mutant locus
1: 西农 1A; 2: ygl4; 3: 正常池; 4: 突变池; 5~12: F2群体中正常
植株; 13~21: F2群体中突变植株; 17: 单交换株。
1: Xinong 1A; 2: ylg4; 3: normal gene pool; 4: mutant gene pool;
5–12: single normal plants in F2 population; 13–21: single mutant
plants in F2 population; 17: single crossing-over plant.

3 讨论
叶绿体作为光合作用的场所, 其发育调控机理
的研究一直是植物生理和分子生物学研究的热点。
近年来, 随着单子叶模式植物水稻的基因组测序完
成, 水稻功能基因研究愈来愈引起人们的关注。目
前世界上至少有 12个研究机构分别建立了自己的
1408 作 物 学 报 第 35卷


图 3 YGL4基因在第 10染色体上的分子定位
Fig. 3 Molecular mapping of YGL4 on chromosome 10

突变体库[22]。在突变体库中叶绿素合成缺陷的突变
占的比例很高, 这与叶色突变的分子机制复杂, 突
变基因可直接或间接干扰叶绿素的合成及稳定, 经
由多种途径引起叶色变化有关[23]。
水稻叶色变异性状的遗传, 多数是核基因隐性
突变引起, 对细胞质突变引起的叶色突变体报道很
少[16,24-25]。本文报道的黄绿叶基因亦是由 1 对隐性
核基因控制。在第 10染色体上定位的黄绿叶基因有
fgl[26]和 pgl[27], fgl位于第 10染色体短臂, 本文定位
的 YGL4位于第 10染色体长臂上, 虽然 pgl与 YGL4
都位于第 10 染色体长臂上, 但 pgl 基因是利用初级
三体定位, 而 YGL4是利用分子标记定位所得, 因此
难以证明 YGL4与 pgl基因是否等位。
尽管很多叶色突变基因都得到定位, 但仅有少
数的基因被克隆。且主要集中在编码叶绿素合成与
降解途径中酶的基因。Jung 等[14]利用 T-DNA 插入
突变体克隆了编码镁离子螯合酶大亚基的 OsCHLH
基因, Zhang等[28]通过图位克隆方法克隆了两个镁离
子螯合酶亚基基因 OsCHLD和 OsCHLI, Wu等[16]图
位克隆了一个控制水稻黄绿叶突变性状的基因
YGL1, 该基因在 592 位由 C→T 的错义突变导致其
所编码酶的活性区在 198位由 Pro突变为 Ser, 从而
降低突变体苗期叶绿素的生物合成, 并延缓了叶绿
体的发育。Lee 等[15]则在水稻中发现了两个与叶绿
素 a氧化酶高度同源的基因OsCAO1和OsCAO2, 尽
管它们序列相似 , 但有着完全不同的表达模式。
Morita等[29]利用 γ射线诱变获得了 5个 OsCAO突变
体并对它们进行了分析。本研究将 YGL4 基因定位
在水稻 10 号染色体 SSR 标记 RM1162 和 RM7093
之间, 分别距其 1.8 cM和 4.0 cM, 根据日本晴序列
可知物理距离为 402 kb, 利用 gramene 网站(http://
www.gramene.org/)对该区域序列进行分析, 其间存
在 3 个与叶绿素缺失相关的基因, 其中 2 个编码叶
绿素酸酯氧化酶(CAO), 是催化叶绿素 b 生物合成
的关键酶, 这个酶的缺失或活性降低将影响叶绿素
b 的合成。另外 1 个基因是 CHL-CPN10, 是一个存
在于叶绿体中的伴侣蛋白, 与叶绿体发育有关[30]。
但要最终确定哪个基因是 YGL4, 该基因是否是
OsCAO1 和 OsCAO2 的等位突变, 或者是其他的尚
未发现的基因, 还有待进一步定位及对相关候选基
因的互补验证, 相关研究正在进行之中。
4 结论
ygl4总叶绿素含量稳定在 2.01~2.28 mg g−1之间,
仅有对照的 38.2%~50.5%; 黄绿叶性状受 1 对隐性
核基因控制 ; 将该黄绿叶基因定位于 RM1162 和
RM7093之间, 分别距其 1.8 cM和 4.0 cM。
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