全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(3): 397−402 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家科技攻关计划重大基础研究前期研究专项(2003CCA01000); 新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题(XLDX0201-200403)
作者简介: 王艳(1978−), 女, 博士研究生, 主要从事昆虫抗冻蛋白功能的研究。
* 通讯作者(Corresponding author): 马纪, 博士, 教授, 研究方向：昆虫分子生物学。Tel: 0991-8583259; E-mail: majiuci@xju.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-05-30; Accepted(接受日期): 2007-07-30.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00397
昆虫抗冻蛋白基因转化烟草的抗寒性
王 艳 邱立明 谢文娟 黄 薇 叶 锋 张富春 马 纪*
(新疆生物资源基因工程重点实验室/新疆大学生命科学与技术学院, 新疆乌鲁木齐 830046)
摘 要 : 将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因 MPAFP149 亚克隆至 pCAMBIA1302 中 , 构建成单价植物表达载体
pCAMBIA1302-MPAFP149, 转化至农杆菌 EHA105中, 利用叶圆盘法转化烟草。通过 PCR、PCR-Southern及 RT-PCR
检测表明, 抗冻蛋白基因已整合至烟草基因组中, 并发生了转录。对 T0代转基因烟草以−1℃处理 48 h, 转基因烟草
的相对电导率和表型明显优于野生型烟草。室温恢复试验验证, 转基因烟草可存活并恢复生长, 而野生型烟草受到了
不可逆的低温冻害。研究证明, 转化后携带昆虫抗冻蛋白基因的烟草比野生型烟草具有明显的抗寒能力, 该结果为减
轻冷敏感经济作物在春季遭受霜害提供了理论依据和应用基础。
关键词: 昆虫抗冻蛋白; 植物表达载体; 烟草; 抗寒性
Cold Tolerance of Transgenic Tobacco Carrying Gene Encoding Insect
Antifreeze Protein
WANG Yan, QIU Li-Ming, XIE Wen-Juan, HUANG Wei, YE Feng, ZHANG Fu-Chun, and MA Ji*
(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi
830046, Xinjiang, China)
Abstract: Most of crops are susceptible to cold and frost. When temperature decreases to -1 , ice makes plant cells desiccate℃ d
and cellular membrane shrunk. Expression of insect antifreeze protein genes with very high thermal hysteresis activity in plants is
a possible way for increasing the cold tolerance of cold-sensitive plants. The MPAFP149 gene from Xinjiang desert insect Mi-
crodera punctipennis dzhunarica was constructed to the plant expression vector pCAMBIA1302 by sub-cloning, and then the
recombined vector pCAMBIA1302-MPAFP149 was transformed into Agrobacterium tumefacines EHA105. Transgenic tobacco
was obtained via leaf-disc method by Agrobacterium-mediated transformation. PCR and PCR-Southern analysis showed that the
MPAFP149 gene was successfully integrated into the tobacco genome. The result of RT-PCR also verified that MPAFP149 gene
was transcripted at mRNA level. The relative conductivity of T0 generation of transgenic tobacco at −1 ℃ for 48 h was 28.83%,
significantly lower than that of wild tobacco which was 82.91%. Meanwhile, the phenotype of transgenic tobacco was superior to
that of wild tobacco, suggesting that transgenic tobacco had better cold tolerance than wild tobacco. Recovering experiment at the
room temperature indicated that transgenic tobacco was able to recover from cold stress and regenerate. The results proved that
transgenic tobacco carrying MPAFP149 gene was more cold tolerant than wild tobacco, which provided a theoretical and applied
foundation for relieving cold damage to cold-sensitive crops in spring.
Keywords: Antifreeze proteins; Plant expression vector; Tobacco; Cold tolerance
低温伤害是农业生产中的一种严重自然灾害 ,
也是某些农作物区域性和季节性的生长限制因素。
种植在北部寒冷地带的农作物, 不可避免地遭受低
温胁迫, 因而抗冻性成为选育寒冷地区作物品种的
一个重要指标[1]。霜冻是低温伤害中的一种严重自
然灾害, 能够在短短的几小时内毁坏大片农作物。
我国是遭受霜冻危害最严重的国家之一, 平均每年
霜冻面积 3 400 km2, 霜冻最重年达 7 700 km2, 造成
农业经济损失约 10 亿美元。即使温和地提高作物
1~2℃的耐寒性 , 对农作物的产量都有着强烈的影
398 作 物 学 报 第 34卷

响 [2], 因此防御或控制霜冻危害是急待研究解决的
问题。
抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)是 20世纪 60
年代从极区海鱼的血清中发现的一种能吸附到体液
的冰表面, 抑制冰晶生长并降低冰点[3-4], 以维持体
液非冰冻状态的高效抗冻活性物质, 可通过非共价
吸附抑制机制保护多种有机体免受结冰引起的伤
害 [5]。通常抗冻蛋白又被称为热滞蛋白 (thermal
hysteresis protein, THP),具有热滞效应和重结晶抑制
效应, 其抗冻活性通常定义为热滞性, 大小用热滞
系数表示。
目前已经在鱼类、昆虫、植物体、细菌和真菌
体内发现多种抗冻蛋白[6-7]。在自然选择和平行进化
作用下[5], 这些蛋白质结构呈现多样性[8]。
昆虫抗冻蛋白比大多数已发现的其他来源的抗
冻蛋白活性都强[9], 其热滞值最高, 为 3~6℃, 鱼的
热滞值为 0.7~1.5℃, 植物的热滞值最低, 为 0.2~0.5
℃。在微摩尔级浓度时, 一种富含苏氨酸和半胱氨
酸的 84个氨基酸残基的黄粉甲抗冻蛋白, 其热滞活
性为鱼类抗冻蛋白的 10~100倍[10]。
自 20 世纪 80 年代, 鱼类的 AFP 结构被研究清
楚以后, 人们先后将 AFP转入烟草[11]、油菜[12]、玉
米 [13]和番茄 [12,14]等作物 ,试图提高这些作物的抗寒
性, 但离人们的期望还相差较远。1997年 Wallis 等
[15]将一段融合有植物血球凝集素(PHA)信号肽的合
成抗冻蛋白在马铃薯中表达, 降低了转基因植物叶
片的电解率, 第一次证明植物的抗寒表型与抗冻蛋
白表达的相关性。2002年 Huang等[16]将赤翅甲抗冻
蛋白(DAFPs)基因成功导入拟南芥中并在转基膀因株
系细胞提取物中检测到具有热滞活性的抗冻蛋白的
表达, 对于昆虫抗冻蛋白的研究可能更有应用价值。
本实验室曾克隆了生存在新疆极端荒漠中的准
噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因 MPAFP149, 并在原核
表达系统中获得了表达, 通过大肠杆菌的体外低温
保护实验, 证实了此蛋白具有抗冻保护效果[17]。基
于上述研究背景, 我们构建了准噶尔小胸鳖甲抗冻
蛋白基因 MPAFP149 的植物表达载体, 进而转化模
式植物烟草, 旨在探讨昆虫抗冻蛋白在植物体中表
达情况, 以期为新疆大田作物的抗寒转基因提供新
的思路和理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
DH5α 为 大 肠 杆 菌 受 体 菌 , 根 癌 农 杆 菌
(Agrobacterium tumefaciens)EHA105 为转化受体菌,
植物表达载体 pBI121含卡那霉素筛选抗性基因, 植
物表达载体 pCAMBIA1302 含潮霉素筛选抗性, 目
的基因 MPAFP149由本实验室克隆。
烟草(Nicotiana tabacum L.)W38 品种由北京林
业大学赠送, 以 55~60 d 左右的烟草无菌苗叶片为
转化受体材料。
1.2 植物表达载体的构建
根据本实验室克隆的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白
基因 MPAFP149序列(GenBank登录号：AY821792),
设计特异性引物, 将其构建至植物表达载体 pBI121
上, 使其上游连有花椰菜花叶病毒 35S 启动子, 下
游连有 NOS终止子, 用 HindⅢ和 EcoRⅠ从 pBI121-
MPAFP149 植物表达载体上切下 MPAFP149 的表达
框 CMV35S-MPAFP149-NOS, 再用相同的酶酶切植
物表达载体 pCAMBIA1302, 将表达框亚克隆至植
物表达载体 pCAMBIA1302 中, 构建成单价植物表
达载体 pCAMBIA1302-MPAFP149, 转化至农杆菌
EHA105 中。农杆菌感受态细胞的制备、转化及鉴
定方法参照参考文献[18]。
1.3 烟草的遗传转化及再生植株的检测
1.3.1 PCR 利用叶圆盘法转化烟草[19], 获得转
基因植株, 并对转化的烟草进行分子生物学检测。
取对照野生型烟草及转基因潮霉素抗性烟草叶片 ,
采用 Michaels[20]方法提取植物基因组 DNA, 以 P1:
5′-TGGCTTTGACAACAAAATGG-3′和 P2: 5′-TTA
ACCTTTATTTGGACATCC-3′为引物 , 烟草基因组
DNA 为模板, 采用 95℃ 预变性 4 min, 95℃ 变性
30 s, 55℃ 退火 30 s, 72℃延伸 40 s, 35个循环后,
于 72℃延伸 7 min, 扩增约 363 bp 的 MPAFP 目的
片段。
1.3.2 PCR-Southern 取 PCR 扩增阳性产物在
0.7%的琼脂糖凝胶上电泳, 经变性、中和后按照分
子克隆 [21]介绍的高盐转移法将胶上的样品转到
Hybond N带正电荷的尼龙膜上, 以 DIG-High prime
标记目的基因, MPAFP149为探针, 采用 Roche公司
DIG High prime DNA Labeling and Detection Stater
KitⅠ试剂盒进行杂交。
1.3.3 RT-PCR 取对照野生型烟草及转基因潮
霉素抗性烟草叶片, 用 Trizol 法抽提总 RNA(参照
Trizol kit说明书的方法)。以 RNA为模板, AMV反
转录酶扩增出第一条 cDNA 链, 再用 MPAFP149 的
特异性引物进行扩增。同时以 28S 作为内参标记
第 3期 王 艳等: 昆虫抗冻蛋白基因转化烟草的抗寒性 399


基因。
1.4 转基因烟草的抗寒性检测
以株高、第三轮叶片的长及宽作为选择转基因
烟草和野生型烟草植株表型的标准, 低温处理前分
别测定其相应的相对电导率, 然后将它们置于−1℃
低温培养箱, 分别处理 24 h和 48 h后再次测量相对
电导率。按赵世杰等的方法[22] 测定相对电导率。室
温恢复两周, 观察其生长状况。
相对电导率 A=低温处理前或后烟草叶片电导
率 S1/煮沸后植物总电导率 S2×100%。
2 结果与分析
2.1 植物表达载体 pCAMBIA1302-MPAFP149 的
构建
按材料与方法先将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白的全
长基因 MPAFP149(含信号肽)构建至植物表达载体
pBI121上(图 1), 再将 1 400 bp大小的MPAFP149表达
框亚克隆至植物表达载体 pCAMBIA1302 中, 构建成
单价植物表达载体 pCAMBIA1302-MPAFP149(图 2),
经测序 MPAFP149读码框正确。



图1 植物表达载体pBI121-MPAFP149的构建
Fig. 1 Construction of plant expression vector
pBI121-MPAFP149
1: DL15000+2000 bp marker; 2: pBI121-MPAFP149 BamHⅠ
和SacⅠ的酶切鉴定。
1: DL15000+2000 bp marker; 2: Identification of the
pBI121-MPAFP149 digested by BamHⅠ and SacⅠ.

2.2 转基因烟草的 PCR及 PCR-Southern检测
以总 DNA为模板, 用可扩增 MPAFP149 cDNA
的特异性引物进行 PCR反应检测外源基因是否整合
到基因组中。选取潮霉素抗性植株 66株, 经 PCR扩
2 1


图 2 植物表达载体 pCAMBIA1302-MPAFP149 的构建
Fig. 2 Construction of plant expression vector pCAM-
BIA1302-MPAFP149
1:DL15000+2000 bp marker; 2:pCAMBIA1302-MPAFP149
HindⅢ和 EcoRⅠ酶切鉴定。
1: DL15000+2000 bp marker; 2: Identification of the pCAM-
BIA1302-MPAFP149 digested by BglⅠ and BstpⅠ.

增, 有 55株烟草扩增出相应的 363 bp片段(图 3), 阳
性率达 83.3%。将其中 7 株 PCR 阳性进行 PCR-
Southern 杂交, 与阳性对照同样出现特异的杂交信
号(图 4), 初步表明目的基因 MPAFP149已整合到烟
草的基因组中。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


图 3 MPAFP149 基因的 PCR 扩增
Fig. 3 PCR profile of MPAFP149
1: DL1 5000+2000 bp marker; 2: 野生型烟草(阴性对照); 3:
pMD18-T-MPAFP149质粒(阳性对照); 4~11: 潮霉素抗性植株。
1: DL1 5000+2000 bp marker; 2: wild tobacco(negative control); 3:
pMD18-T-MPAFP149 plasmid (positive control);
4–11: plants with hygromycin resistance.

1 2 3 4 5 6 7 8


图 4 转基因烟草 PCR-Southern 检测
Fig. 4 PCR-Southern of transgenic tobacco
1: pMD18-T-MPAFP149(质粒阳性对照); 2~8:转基因烟草。
1: pMD18-T-MPAFP149 plasmid (positive control); 2–8:
transgenic tobacco.
400 作 物 学 报 第 34卷

2.3 转基因烟草的 RT-PCR检测
随机选取 7 株转基因烟草进行 RT-PCR(图 5),
在 363 bp 处扩增出特异的目的条带 , 表明
MPAFP149在mRNA水平已发生了转录。同时以 28S
作为内参标记基因。其中转基因株系 5 号(泳道 3)
和 39号(泳道 7)转录本条带最亮。为了避免 RNA提
取过程中 DNA 的污染, 以总 RNA 为模板, 进行
MPAFP149 的扩增, 没有目的条带出现(图略), 说明
RT-PCR扩增结果的真实性。



图5 转基因烟草的RT-PCR检测
Fig. 5 RT-PCR analysis of different transgenic tobaccos
1~7: 转基因烟草。
1–7: Different transgenic tobacco lines.

2.4 转基因植物的抗寒性检测
实验培养箱的上层温度与所设置的低温值−1℃
基本保持一致, 而下层的温度则略高, 约为 0℃左右
(上层有风扇), 因此下层放置的野生型与转基因烟
草的相对电导率都较低, 但处理后无论是野生型还
是转基因烟草其相对电导率都呈上升趋势(图 6)。相
对电导率的测定如表 1, 低温处理 24 h时, 放在培养
箱下层的转基因烟草 56 号和野生型烟草 53 号, 相
对电导率分别为 26.00%和 25.20%, 当处理时间延长
至 48 h时, 56号的相对电导率增加至 28.83%, 而 53
号已达 82.91%, 转基因烟草远远低于野生型烟草。
其中转基因株系 49 号处理前后的相对电导率变化
幅度达 33.74%, 但远远低于相对应的 54号野生型变
化值 69.25%, 其表型及室温恢复情况与相对电导率
变化一致(图 7)。转基因株系 56 号处理前后的相对
电导率变化幅度为 10.93%, 而对照组达 59.31%; 转
基因株系 56号抗寒表型和室温恢复情况也最好。转
基因株系 62 号处理前后的相对电导率变化幅度介
于 56号和 49号之间, 但伤害程度也较深, 室温恢复
过程中, 老叶几乎全部脱水萎蔫, 然而 1 周左右顶
部却有新芽长出。


0 24 48
Treatment time (h)

图 6 低温(−1℃)对烟草叶片电导率的影响
Fig. 6 Effect of low temprature (−1℃) on relative conductivity of tobacco leaves

表1 低温(−1℃)对烟草叶片电导率的影响
Table 1 Effect of low temperature (−1℃) on relative conductivity of tobacco leaves
叶片Leaf (cm) 处理不同时间的相对电导率
Relative conductivity at various time(%) 株系编号
No. of line
位置
Position 长
Length
宽
Width
株高
Height
(cm) 0 h 24 h 48 h
相对变化率
Change of rela-
tive conductiv-
ity(%)
62(T) 上层Upper 10.7 6.5 8.1 22.37 48.01 − 25.64
58(N) 上层Upper 10.5 5.9 7.9 17.69 70.62 − 52.93
49(T) 上层Upper 8.9 5.1 9.6 19.90 44.21 53.64 33.74
54(N) 上层Upper 9.2 5.1 10.2 23.02 80.90 92.27 69.25
56(T) 下层Lower 8.1 4.2 10.3 17.90 26.00 28.83 10.93
53(N) 下层Lower 8.0 4.1 9.8 23.60 25.20 82.91 59.31
T: transgenic; N: non-transgenic.
Transgenic
tobacco No. 62

Untransgenic
tobacco No. 58

Transgenic
tobacco No. 49

Untransgenic
tobacco No. 54

Transgenic
tobacco No. 56

Untransgenic
tobacco No. 53
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
R
el
at
iv
e
co
nd
uc
tiv
ity
(%
)
第 3期 王 艳等: 昆虫抗冻蛋白基因转化烟草的抗寒性 401


A B C


图 7 低温(−1℃)对转基因烟草 49 号和野生型烟草 54 号表型的影响
Fig. 7 Effect of low temperature(−1℃) on the appearance of transgenic tobacco No. 49 and non-transgenic tobacco No. 54
A: 处理前; B: −1℃处理48 h; C: 室温恢复两周。
A: before treatment; B: treatment of tobaccos for 48 h at −1℃; C: recover for 2 weeks at room temperature.

3 讨论
赤翅甲抗冻蛋白(DAFPs)不仅可以抑制冰冻的
发生而且可通过抑制虫体体液和肠道的冰核剂以降
低过冷却点[23-25]。新疆准噶尔小胸鳖甲属于避冻昆
虫, 推测它们可能也是通过表达一系列抗冻蛋白基
因家族成员阻止外源冰晶通过体表而引发的初始结
冰, 同时以过冷却的方式度过北方寒冷的冬季。
所有的植物都易受冷冻和霜冻的危害。当温度
降低时, 由于冰核细菌的存在而引发植物表皮表面
冰晶的形成[26]。在体外实验中, 抗冻蛋白通过降低
异源冰核位点的效率而稳定液体的过冷却状态, 降
低结冰温度[27]。同时抗冻蛋白也能抑制冰晶的生长
和重结晶。最终仅需要比依数性复合物较低浓度的
抗冻蛋白就可有效阻止霜冻的伤害[28-29]和保护细胞
免受超过结冰温度时的伤害 [30]。昆虫和植物属于不
同的物种 , 在密码子的使用偏好上存在很大的差
异。因而 2002年 Fan等[31]克隆了胡萝卜全长 1 099
bp的抗冻蛋白基因, 并将其转入烟草,但转基因烟草
仅在 4.5~5.5℃时才显示一定的抗寒表型。本试验获
得了 55 株转基因烟草, 尽管只是当代植株, 但几乎
所有的转基因烟草在抗寒实验中均比野生型烟草表
现不同程度的抗寒能力。说明此基因无需进行密码
子优化就可有效地进行正确表达 , 表达的异源抗
冻蛋白能够赋予植物显著的抗寒能力。该结果暗示
着此基因可能是昆虫抗冻蛋白基因家族中的一个抗
寒主效基因, 可作为抗寒基因工程的有效候选基因。
热滞活性的高低可直接反应生物体耐寒能力的
强弱 , 因而提高热滞值是发挥抗冻蛋白功能的关
键。Duman等[32]研究表明利用增强剂甘油和柠檬酸
可提高昆虫抗冻蛋白对冰核剂的抑制功能。赤翅甲
的抗冻蛋白(DAFPs)需要一些增强剂例如某种蛋白
质或甘油、柠檬酸等小分子量可溶物以产生最适水
平的热值活性[33-34]。因而本研究还将烟草的柠檬酸
合成酶基因与小胸鳖甲抗冻蛋白基因构建在同一个
载体上形成双价植物表达载体, 通过叶盘法转化烟
草 , 获 得 当 代 转 基 因 植 株 。 但 我 们 忽 略 了
pCAMBIA1302 载体中 BglⅡ酶切位点前 NcoⅠ
(CCATGG)中含有一个 ATG 起始密码子, 因而造成
烟草柠檬酸合成酶读码框的移位, 未能阐明抗冻蛋
白 MPAFP149 与烟草柠檬酸在植物体内是否也存在
类似的协同和促进作用, 有待重新构建正确的双价
植物表达载体进一步验证。
4 结论
构建了含有新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因
MPAFP149 的植物表达载体, 通过叶圆盘法转化模
式植物烟草, 共获得 55株当代转基因植株。在−1℃
处理 24 h和 48 h的抗寒实验中, 转基因烟草的抗寒
能力明显优于野生型烟草。
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