全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(9): 1607−1616 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08009-001, 2011ZX08004-005)和国家重点基础研究发展计划(973计划)项目
(2010CB125906)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 陈新建, E-mail: xinjian@371.net; 傅永福, E-mail: fufu19cn@163.com, Tel: 010-82105864
第一作者联系方式: E-mail: 39619827@qq.com, Tel: 010-82105867
Received(收稿日期): 2012-02-27; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-07-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120703.0858.201209.0_009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01607
大豆 GmNF-YC2基因的克隆与功能分析
曹 岩 1 张晓玫 2 陈新建 1,* 傅永福 2,*
1 河南农业大学生命科学学院, 河南郑州 450002; 2 农业部北京大豆生物学重点实验室 / 农作物基因资源与遗传改良国家重大科学
工程 / 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: NF-Y (nuclear factor-y)是真核生物中普遍存在的一种转录因子复合物, 由 3个不同的亚基(NF-YA、NF-YB和
NF-YC)组成, 并通过作用于其他调控因子的启动子来调节目的基因的表达。本文从大豆垦农 18 中克隆大豆 NF-YC
基因GmNF-YC2, 并且利用实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)分析其表达模式, 发现GmNF-YC2的表达受光调控, 并在开
花期第 3复叶中表达量最高。结果表明, GmNF-YC2在大豆光周期开花调节中起重要作用。拟南芥原生质体瞬时表达
实验证实, GmNF-YC2蛋白定位在细胞核中。这为大豆 NF-YC家族基因的功能研究提供重要依据。
关键词: NF-Y转录因子; 开花; CONSTANS; 光周期; 大豆
Cloning and Functional Analysis of GmNF-YC2 Gene in Soybean (Glycine max)
CAO Yan1, ZHANG Xiao-Mei2, CHEN Xin-Jian1,*, and FU Yong-Fu2,*
1 College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Key Laboratory of Soybean Biology / National Key Facility
of Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: The eukaryotic nuclear factor Y (NF-Y) is a ubiquitous transcription factor complex composed of three distinct subunits
(NF-YA, NF-YB, and NF-YC). NF-Y transcription factors typically act on the promoters of other regulatory factors to modulate
gene expressions. Here, a NF-YC homologue, GmNF-YC2, was cloned from soybean variety KN18. The expression profiles
checked by quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) showed that GmNF-YC2 was regulated by light but not by circadian clock,
and GmNF-YC2 was expressed at the highest level in third trifoliolates at flowering. The results suggested that GmNF-YC2 was
one of the important genes in the regulation of flowering in soybean. The transient expression in Arabidopsis protoplasts displayed
that GmNF-YC2 protein was localized in nuclear section. The results from this study pave a way to study the function of NF-Y
family in soybean and its application in soybean molecular breeding.
Keywords: NF-Y transcription factor; Flowering; CONSTANS; Photoperiod; Glycine max
转录因子对植物的生长发育起重要作用。复合
转录因子有多个亚基组成, 而各个亚基在空间和时
间上的部署(如表达水平、翻译后修饰和亚细胞定位)
对它们功能发挥具有深远影响 [1]。复合转录因子
NF-Y是由 NF-YA、NF-YB和 NF-YC三个亚基组成,
在所有真核生物中都发现它能够在多种基因表达调
控中起作用 [1-2]。在哺乳动物中 , 先在细胞质中由
NF-YB和NF-YC亚基形成异源二聚体, 后者转运到
细胞核中, 与第 3 个亚基 NF-YA 结合, 产生完整
NF-Y转录因子。完整的 NF-Y转录因子能够结合靶
基因启动子中的核心五聚体核苷酸基序 (motif)
CCAAT, 从而调控靶基因的表达。生物信息学分析
发现 25%~30%的哺乳动物的启动子具有 NF-Y结合
位点。而染色质免疫沉淀数据证明, 另一些分布广
泛的 NF-Y复合物可以结合到非启动子的位置[3-4]。
目前, 在植物中没有发现一个完整的 NF-Y 转
录因子复合物的功能, 但是越来越多证据表明, 个
别单独亚基在多种生物进程中发挥重要的功能 [5],
例如, 胚胎发育[6-7]、蓝光信号转导[8-9]、干旱胁迫[10]、
光周期开花[11-15]、内质网应激反应[16]、ABA (abscisic
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acid)的传输[8,17]、固氮根瘤的发育[18-20]、光合作用和
根的延伸 [21-22]。LEC1 是最早在植物中被发现的
NF-Y 亚基基因(NF-YB9)。LEC1 在胚胎发育中强烈
表达, 并控制胚胎成熟过程。LEC1同源基因 LEC1-
LIKE 也参与胚胎的发育(L1L 或 NF-YB6)[6-7]。尽管
LEC1功能已知, 但是它与 NF-YA和 NF-YC之间的
关系尚不明确[6]。
植物 NF-Y 家族的功能在抗旱性上也有所表现,
过表达 AtNF-YB1 和 ZmNF-YB2 能够增强植物抗旱
性[9]。过表达 AtNF-YA5能够减少植物对干旱的敏感
度, 提高花青素产量和影响气孔大小; 而 AtNF-YA5
突变体表型与过表达表型完全相反。AtNF-YA5功能
缺陷型表现出与 35S::miR169 植株相似的表型, 对
干旱更加敏感[10]。NF-YA 和 NF-YB 二者都与抗旱
机制调控有关, 但 NF-Y 另一成员 NF-YC亚基在抗
旱上的功能目前还是未知。
在拟南芥中, 开花的光周期途径又称长日途径
(long-day pathway), 主要由光受体(photoreceptor)、
生物节律钟(circadian clock)及下游调节基因组成。
光受体感受不同波长和不同强度的光信号并将光信
号传递给内源的生物节律钟, 生物节律钟整合这些
信号并在中央振荡器转换成新信号, 传递至生物钟
输出基因 G1 (GIGANTEA), 激活其下游基因 CO
(CONSTANS)的表达, CO 进一步激活下游的开花基
因, 促进花分生组织基因和花器官决定基因的表达,
从而实现光信号对成花转变的调控[23-25]。在长日照
调控下, CO蛋白在傍晚和夜间的积累会诱导成花素
基因 FT (FLOWERING LOCUS T)的表达[26], 而在
CO突变体内, FT的积累受到抑制, 从而导致晚花表
型[27-30]。但是, CO 如何与靶基因的启动子 DNA 结
合来触发 FT表达的详细机制尚不清楚。之前研究表
明 , NF-Y 家族参与了光周期调控开花 [6]。过表达
AtNF-YB2 能明显导致快速开花; AtNF-YB2、AtNF-
YB3 双突变体和 CO 突变体开花时间类似 [31-32];
AtNF-YC3、AtNF-YC4 和 AtNF-YC9 能与 CO 蛋白
互作, 并且它们协同参与拟南芥开花时间的调节。
AtNF-YC3和 AtNF-YC9的双突变体以及 AtNF-YC3、
AtNF-YC4和 AtNF-YC9的三突变体可以导致植株的
开花时间显著推迟, 并且 35S::CO 不能改变三突变
体的晚花表型 , 说明 FT 表达的激活需要 CO 与
AtNF-YC3、AtNF-YC4和 AtNF-YC9复合物的参与。
此外, CO和 NF-Y转录因子的蛋白相互作用区域在
许多 CO-LIKE 基因里也高度保守[14-15], 说明 CO 能
与 NF-Y 转录因子互作调节植物的开花。本文克隆
大豆中可能的开花调节因子 NF-YC2, 并初步研究
其功能。表明 NF-YC2 可能参与大豆开花光调节过
程。
1 材料与方法
1.1 试验处理与取样
1.1.1 生物节律表达分析 取大田土壤与有机花
卉土壤以 2∶1比例混匀 , 将大豆垦农 18分别播种
在长日(LD, 16 h光照/8 h黑暗)和短日(SD, 8 h光照
/16 h 黑暗)及 28℃条件下生长。在单叶完全展开时
每隔 2 h取一次样, 各取 24个样(共 48 h), 随后将幼
苗分别转移至连续光照(LL)和连续黑暗(DD)条件下
培养, 仍每隔 2 h一次, 各取 24个样(共 48 h)。所有
样品取后立即以液氮冷冻存于−80℃冰箱。
1.1.2 组织器官及发育表达分析 取大田土壤与
有机花卉土壤以 2∶1 比例混匀, 将大豆垦农 18 播
种于光照培养室, 短日(SD, 8 h 光照/16 h 黑暗)及
28℃条件下生长。叶片完全展开后分别取样。在单
叶展开之前(播种后 8 d)取地上部分的幼苗; 在单叶
期(播种后 14 d)取根、下胚轴、上胚轴、子叶、单
叶和茎尖(包括顶端分生组织和幼叶); 分别于单叶
期、第 1 复叶期、第 2 复叶期、第 3 复叶期、开花
期(即第 4 复叶期)取地上部分样品; 在开花期(播种
后 45 d)取根、茎、单叶、第 1复叶、第 2复叶、第
3复叶、侧生叶和花等器官; 分别于开花后第 7、第
14和第 21天取荚和种子样品。均在光照开始后 0.5
h取样, 取后立即用液氮处理并贮于–80℃。
1.2 基因克隆
根据拟南芥 NF-YC9 蛋白序列, 在大豆基因组
的蛋白质数据库(phytozome)中进行 Blast 筛选候选
基因, 用 ClustalX 1.83 进行比对去除冗余序列, 将
得到的序列在拟南芥蛋白质数据库(TAIR8)中进行
Blast以初步确定其功能。对以上得到的基因结构不
完整的基因用 FGENESH程序(softberry)重新预测。
根据预测基因的 CDS序列, 用 Primer Premier 5.0设
计引物(表 1)。提取叶片总 RNA, 按照 Invitrogen反
转录试剂盒说明获得单链 cDNA, 以 RT-PCR 来克
隆基因的 CDS 序列。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北
京天根生化科技有限公司)回收 PCR 产物。将回收
产物与 pGWC载体[36]连接、转化(参照 TaKaRa试剂
盒方法), 挑取正向克隆送中国农业科学院作物科学
研究所进行测序。
第 9期 曹 岩等: 大豆 GmNF-YC2基因的克隆与功能分析 1609


1.3 系统进化树构建
以拟南芥 NF-YC 蛋白序列为 query, 在 Phyto-
zome 数据库及 NCBI 中作 BLAST 分析, 在各物种
中寻找 AtNF-YC 的同源序列。通过 MEGA 4.0 软
件构建系统进化树, 采用 Neighbor-joining (NJ)算
法的 Complete deletion 模式建树, Bootstrap 值取
1 000。
1.4 基因功能结构域预测
将预测到的基因 CDS 序列以 FASTA 的格式保
存, 用在线 motif分析软件(MEME)分析、绘制。motif
的保守氨基酸最大设置为 50, 最小设置为 6, Motif
的数量设置为 3。
1.5 实时定量 PCR (qPCR)
实时荧光定量 PCR 中所用 GmNF-YC2 和
GmActin11 基因 (内参基因 )[37]引物由 Beacon De-
signer 7.0软件设计(表1), 并通过扩增曲线和融解曲
线 , 确定引物特异性。采用两步法 PCR 反应 , 以
SYBR Green I 染料法, 在 ABI StepOne 实时定量
PCR 仪上进行实验。通过 StepOne 生物软件和
Microsoft Excel分析处理实验结果, 以GmActin11基
因作为内参, 用 2–ΔΔCT 算法计算各基因表达量。实
时定量 PCR体系总体积 15 μL, 含 SYBR Primix Ex
Taq (2×) 7.5 μL、10 μmol L–1上下游引物各 0.3 μL、
cDNA 模板 3~4 μL、ddH2O 2.9~3.9 μL。两步法 PCR
扩增标准程序为预变性 95 10 s; 5 5 s, 60 31 s, ℃ ℃ ℃
40个循环。溶解曲线的标准程序为 95 15 s; 60 1 ℃ ℃
min; 95 15 s; 0.5 /℃ ℃ 循环。
1.6 拟南芥原生质体转化
1.6.1 原生质体的制备 取 4 周左右的拟南芥叶
片切成细条, 放入 10 mL 新鲜的酶解液中, 避光,
23℃酶解 4 h。将酶解好的细胞液经金属筛(200目)
平均过滤至 2个 10 mL离心管中, 4 , 100℃ ×g离心 2
min。弃上清液, 沿管壁缓慢加入 2 mL 预冷的 W5
溶液, 轻柔混匀, 4 , 100℃ ×g离心 2 min。重复一次。
弃上清液, 加入 2 mL预冷的 W5溶液, 轻微震荡重
悬, 冰上放置 30 min。4 , 100℃ ×g离心 2 min, 弃上
清液, 加入 2 mL预冷的 MMg溶液, 轻柔重悬。4 , ℃
100×g离心 2 min, 弃上清液, 每管加入约 1 mL预冷
的 MMg溶液, 充分悬浮原生质体。
1.6.2 原生质体的转化 取 10 μL融合表达的重
组质粒加入 2 mL离心管中, 用剪掉头的枪头取 100
μL原生质体, 轻柔混匀, 再加入 110 μL PEG/Ca2+溶
液, 混匀后 23℃避光放置 1 h [38]。向离心管中加入
500 μL W5溶液, 23 , 100℃ ×g离心 2 min。弃上清, 加
500 μL W5溶液, 轻柔混匀, 23 , 100℃ ×g离心 2 min。
重复一次。弃上清液, 加 1 mL W5溶液重悬沉淀, 将
悬浮液倒入六孔板, 23℃避光培养 12~16 h。将原生
质体转入 2 mL离心管, 静置沉淀 20~30 min, 小心
吸弃上清液, 取适量原生质体于载玻片上, 置激光
共焦显微镜(Leica TCS SP2)下观察。
酶解液含纤维素酶 0.15 g、离析酶 0.04 g、D-
甘露醇 0.728 g、KCl溶液 1 mL、MES溶液 1 mL、
CaCl2溶液 100 μL, 定容为 10 mL, 混匀后抽滤灭菌,
现用现配, 4℃避光暂存; W5溶液含 NaCl溶液 3.85
mL、CaCl2溶液 6.25 mL、KCl溶液 1.25 mL、MES
溶液 0.5 mL, 定容至 50 mL, 现用现配。MMg溶液
含 D-甘露醇 0.729 g、MgCl2溶液 1 mL、MES溶液
200 μL, 定容至 10 mL, 现用现配。PEG/Ca2+溶液含
D-甘露醇 0.364 g、CaCl2溶液 1 mL、PEG-4000 4 g,
定容至 10 mL, 65℃水浴溶解, 现用现配。
2 结果与分析
2.1 GmNF-YC2基因的克隆与序列分析
根据拟南芥NF-YC家族成员NF-YC9蛋白序列,
在大豆基因组(Phytozome)中进行 Blast 筛选候选基
因, 获得 15个大豆NF-YC家族基因, 命名为GmNF-
YC1~GmNF-YC15 (表 1)。因为 NF-YC参与开花时间
的调节[14], 因此选取与拟南芥 NF-YC9 [14]同源性最
高的基因 Glyma20g37620进行克隆, 命名为 GmNF-
YC2。根据 Phytozome预测的基因 CDS序列序列, 分
别设计基因上下游引物 (表 2)。以大豆垦农 18的
cDNA 为模板 , 将克隆得到的目的片段连接到
pGWC 质粒[36], 测序结果显示, 克隆的基因与网上
基因 Glyma20g37620的序列(Phytozome)一致。
2.2 GmNF-YC2的进化分析
将 GmNF-YC2与其他物种中已经有明确功能的
NF-YC 家族进行蛋白序列比对发现, 它也包含一个
DNA结合域以及NF-YA和NF-YB的相互作用区域,
还具有一个高度保守的 CCAAT结合域(图 1)。虽然
在植物、酵母和哺乳动物中的 NF-Y 的氨基酸有很
高同源性, 但是没有报道表明植物 NF-Y 复合物能
够结合到 CCAAT 位点, 而这一位点是完整的 NF-Y
转录因子的结合区 , 并且这一位点的突变将导致
NF-Y转录因子结合能力的缺失[13-14]。不过, 拟南芥
1610 作 物 学 报 第 38卷

表 1 预测的大豆 GmNF-YC基因
Table 1 Predicted NF-YC genes
基因名称
Gene
Phytozome编号
Phytozome code
基因编码序列
Coding
sequence (bp)
转录本序列
cDNA
(bp)
基因组基因
Genomic DNA
(bp)
蛋白序列
Protein
(AA)
GmNF-YC1 Glyma10g29690.1 714 714 795 237
GmNF-YC2 Glyma04g37290.1 678 906 3404 225
GmNF-YC3 Glyma20g37620.1 792 792 792 263
GmNF-YC4 Glyma03g39910.1 912 1203 2654 303
GmNF-YC5 Glyma06g17780.1 690 1070 4561 229
GmNF-YC6 Glyma06g46850.1 879 1043 4096 292
GmNF-YC7 Glyma08g15700.1 618 618 618 205
GmNF-YC8 Glyma08g17630.1 816 1473 3238 271
GmNF-YC9 Glyma13g25860.1 864 1498 8930 287
GmNF-YC10 Glyma13g27770.1 732 732 732 243
GmNF-YC11 Glyma13g27780.1 628 628 628 210
GmNF-YC12 Glyma13g27790.1 579 579 579 192
GmNF-YC13 Glyma13g35980.1 372 372 372 123
GmNF-YC14 Glyma15g36170.1 900 1388 7829 299
GmNF-YC15 Glyma19g42460.1 885 1206 2955 294
数据来源: http://www.phytozome.net。Data come from http://www.phytozome.net.

表 2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物名称
Name of primer
序列
Sequence (5′–3)
用途
Application
GmNF-YC2-F ATGGATAATCAAGGGCATGGAC
GmNF-YC2-R CTACTGATCTGGAGATGACTGT
基因克隆
Gene cloning
Q-GmNF-YC2-F GCCTGTGATGGACCCGTATGC
Q-GmNF-YC2-R TCTGGTGGTGGTGGTGGTAGTAG
qRT-PCR表达分析
Expression analysis of qRT-PCR
Q-ACTIN11-F ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC
Q-ACTIN11-R GCTGGTCCTGGCTGTCTCC
qRT-PCR内参基因
Reference gene for qRT-PCR

NF-Y亚基家族部分成员能够与酵母 CCAAT位点结
合。因此, 至少拟南芥 NF-Y复合物的亚基可能同样
具有与植物 CCAAT位点的结合能力[13,33]。
为了揭示 GmNF-YC2 的进化地位 , 利用
MEGA4 软件构建了不同物种 NF-YC 家族的进化树
(图 2)。由图 2可知GmNF-YC2和GmNF-YC3 (89.4%)
高度同源, 并且它与GmNF-YC4 (60%)、GmNF-YC15
(70%)和拟南芥 ATNF-YC3 (55%)、ATNF-YC9 (46%)
处于同一个进化枝上。因此推测, 大豆 GmNF-YC家
族与双子叶植物拟南芥 ATNF-YC 家族的亲缘关系
较近, 这表明它们可能具有相似的功能。
将 GmNF-YC2与其他物种不同亚基的已知功能
的同源基因比对发现, 它与已知的具有光周期调控
开花作用的基因处于同一个进化枝上并且亲缘关系
最近, 而与具有抗旱功能的 AtNF-YA5 亲缘关系较
远。说明从进化的角度来看 GmNF-YC2可能具有光
周期调控开花作用(图 3)。
2.3 GmNF-YC2 mRNA 的光周期昼夜节律性表
达分析
在拟南芥中 NF-YC 基因表达是由光周期基因
CO 来调控。为了研究 GmNF-YC2 在光周期中的作
用 , 取不同条件下的大豆垦农 18为样本提取 RNA,
利用 qRT-PCR技术, 选取 ACTIN11为内参基因, 分
析其表达丰度。
GmNF-YC2 表达水平在长日照和短日照下均表
现出明显的节律性, 并且在长日下与短日下有很明
显的差异。在长日照下, 表达峰值出现在早晨(光周
期第 2 h), 随后表达量缓慢降低直到第 2 天恢复光
照。在进入黑暗时期, 表达量降至最低(图 4-A~B)。
而在短日照下, GmNF-YC2 表达峰值出现在下午(光
周期第 8 h), 在进入黑暗时期, 其表达量逐步缓慢
下降(图 4-C 和 D)。表明 GmNF-YC2 表达水平在光
第 9期 曹 岩等: 大豆 GmNF-YC2基因的克隆与功能分析 1611



图 1 NF-YC氨基酸序列比对分析
Fig. 1 Amino acid sequence and domain alignments of NF-YC proteins
黑线分别标出 GmNF-YC的 2个保守功能域和 2个相互作用区域: CCAAT功能域和 DNA功能域; NF-YA和 NF-YB相互作用域。
Schematic alignments of GmNF-YC1, GmNF-YC 2, and GmNF-YC3 with the identified homologous protein AtNFYC9, BdNFYC10, and
TaNFYC11 indicated the conversed motifs CCAAT binding domain, DNA Binding domain, and NF-YA, NF-YB interaction domains.

图 2 GmNF-YC2与其他物种的 NF-YC家族的进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic relationship of GmNF-YC2 with its homologous in various plants
At: 拟南芥; Ta: 小麦; Bd: 短柄草; Os: 水稻; Gm: 大豆。星号为 GmNF-YC2。
At: Arabidopsis thaliana; Ta: Triticum aestivum; Bd: Brachypodium distachyon; Os: Oryza sativa; Gm: Glycine max. The asterisk indicates GmNF-YC2.
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图 3 GmNF-YC2与其他物种已知功能 NF-YC的亲缘关系
Fig. 3 Phylogenetic relationship of GmNF-YC2 with known
function NF-YC in other species
星号为 GmNF-YC2。The asterisk indicates GmNF-YC2.

照下高于黑暗下。而将植物转入连续光照(LD-LL)
和连续黑暗 (LD-DD)后生物钟节律表达变得不明
显。推测该基因在短日和长日下可能主要受光照调
节而与生物节律无关。
2.4 GmNF-YC2组织特异性表达分析
为了研究大豆 GmNF-YC2 基因与大豆生长发
育的关系 , 我们通过实时荧光定量 PCR 检测不同
发育时期的叶片、种子及植株地上部分 GmNF-YC2
mRNA 表达水平。如图 5 所示 , GmNF-YC2 在不同
时期的表达具有相对的器官和发育时期的特异
性。即单叶期在子叶中表达最高 , 而开花期的根和
第 3 复叶具有较高的表达量 , 在豆荚发育的早期
和晚期比中期表达水平低 ; 在花蕾、单叶期根和上
胚轴表达量很低(图 5-A)。在种子中的表达趋势与
荚中的变化恰好相反(图 5-B)。早期发生的叶(单叶
和第 1 复叶)中的基因表达呈现出先上升后下降的
趋势 ; 而后期发生的叶则表现为其他模式 , 如第 2
复叶是随着发育的进程不断上升 , 第 3 复叶却不
断下降(图 5-C)。综合分析地上部各时期表达的总
趋势发现 , 单叶期表达量最高 , 随后下降 , 到开
花期(第 4 复叶期)基因的表达又达到另一峰值(图
5-D)。
2.5 GmNF-YC2蛋白亚细胞定位
为了研究 GmNF-YC 蛋白在植物中的亚细胞定
位情况, 将GmNF-YC2构建到荧光表达蛋白YFP的
N 端。利用原生质体转化技术, 将 pEXSG-GmNF-
YC2-YFPN 质粒转入拟南芥原生质体后, 在激光共
聚焦显微镜下观察。结果表明 GmNF-YC2蛋白定位
在细胞核中(图 6)。

图 4 不同条件下 GmNF-YC2 mRNA的表达
Fig. 4 Expression of GmNF-YC2 mRNA in different conditions
A: 长日–连续光照(LD–LL); B: 长日–连续黑暗(LD–DD); C: 短日–连续光照(SD–LL); D: 短日–连续黑暗(SD–DD)。
横坐标上的白色方框表示光照范围，黑色方框表示黑暗范围。GmACT11为内参基因。
A: long day (continuous light); B: long day (continuous dark); C: short day (continuous light); D: short day (continuous dark).
White box on X-axis indicated the light region, black box for dark region. GmACT11 was used as the internal reference.
第 9期 曹 岩等: 大豆 GmNF-YC2基因的克隆与功能分析 1613



图 5 GmNF-YC2在不同发育时期和不同器官中的表达模式
Fig. 5 Soybean GmNF-YC2 mRNA expression profiles in different tissues/organs at different developmental stages
A: 不同组织器官; B: 不同组织发育时期种子; C: 不同组织发育时期叶; D: 不同组织发育时期地上部。Seedling: 播种后 1周幼苗; U-R: 单叶
全展期根; U-H: 单叶全展期下胚轴; U-C: 单叶全展期子叶; U-U: 单叶全展期单叶; U-E: 单叶全展期上胚轴; U-SAM: 单叶全展期茎顶端;
F-R: 开花期根; F-St: 开花期茎; F-L: 开花期侧生叶; F-U: 开花期单叶; F-T1: 开花期第 1复叶; F-T2: 开花期第 2复叶; F-T3: 开花期第 3复
叶; F-T4: 开花期第 4复叶; F-PE: 开花期叶柄; F-F: 花蕾; PD1: 开花后 7 d的荚; PD2: 开花后 14 d的荚; PD3: 开花后 21 d的荚; 7DAF: 开花
后 7 d的种子; 14DAF: 开花后 14 d的种子; 21DAF: 开花后 21 d的种子; Mature: 成熟期种子; T1-U: 第 1 复叶全展期单叶; T2-U: 第 2 复叶
全展期单叶; T3-U: 第 3 复叶全展期单叶; T1-T1: 第 1复叶全展期第 1复叶; T2-T1: 第 2复叶全展期第 1复叶; T3-T1: 第 3复叶全展期第 1
复叶; T4-T1: 第 4复叶全展期第 1复叶; T2-T2: 第 2复叶全展期第 2复叶; T3-T2: 第 3复叶全展期第 2复叶; T4-T2: 第 4复叶全展期第 2复
叶; T3-T3: 第 3复叶全展期第 3复叶; T4-T3: 第 4复叶全展期第 3复叶; T4-T4: 第 4复叶全展期第 4复叶; U-A: 单叶全展期地上部; T1-A: 第
1复叶全展期地上部; T2-A: 第 2复叶全展期地上部; T3-A: 第 3复叶全展期地上部; T4-A: 第 4复叶全展期地上部。
A: different tissues/organs; B: seeds at different developmental stages; C: leaves at different developmental stages; D: aerial parts at different deve-
lopmental stages. Seedling: 1 week-old seedlings; U-R: roots at unifoliolates fully expanded; U-H: Hypocatyls at unifoliolates fully expanded; U-C:
cotyledons at unifoliolates fully expanded; U-U: unifoliolates at unifoliolates fully expanded; U-E: epicotyls at unifoliolates fully expanded; U-SAM:
shoot apex at unifoliolates fully expanded; F-R: roots at flowering; F-St: stems at flowering; F-L: lateral leaves at flower onset; F-U: unifoliolates at
flowering; F-T1: 1st trifoliolates at flowering; F-T2: 2nd trifoliolates at flowering; F-T3: 3rd trifoliolates at flowering; F-T4: 4th trifoliolates at flow-
ering; F-PE: petioles at flowering; F-F: buds; PD1: pods at 7 days after flowering; PD2: pods at 14 days after flowering; PD3: pods at 21 days after
flowering; 7DAF: seeds at 7 days after flowering; 14DAF: seeds at 14 days after flowering; 21DAF: seeds at 21 days after flowering; Mature: seeds at
maturity; T1-U: unifoliolate at 1st trifoliolate fully expanded; T2-U: unifoliolate at 2nd trifoliolate fully expanded; T3-U: unifoliolate at 3rd trifoli-
olate fully expanded; T1-T1: 1st trifoliolate at 1st trifoliolate fully expanded; T2-T1: 1st trifoliolate at 2nd trifoliolate fully expanded; T3-T1: 1st
trifoliolate at 3rd trifoliolate fully expanded; T4-T1: 1st trifoliolate at 4th trifoliolate fully expanded; T2-T2: 2nd trifoliolate at 2nd trifoliolate fully
expanded; T3-T2: 2nd trifoliolate at 3rd trifoliolate fully expanded; T4-T2: 2nd trifoliolate at 4th trifoliolate fully expanded; T3-T3: 3rd trifoliolate at
3rd trifoliolate fully expanded; T4-T3: 3rd trifoliolate at 4th trifoliolate fully expanded; T4-T4: 4th trifoliolate at 4th trifoliolate fully expanded; U-A:
aerial parts at unifoliolates fully expanded; T1-A: aerial parts at 1st trifoliolate fully expanded; T2-A: aerial part at 2nd trifoliolate fully expanded;
T3-A: aerial parts at 3rd trifoliolate fully expanded; T4-A: aerial parts at 4th trifoliolate fully expanded.

图 6 GmNF-YC2-YFP蛋白的亚细胞定位分析
Fig. 6 Subcellular localization of GmNF-YC2-YFP fusion proteins
图中从左到右依次是 YFP信号、叶绿体信号、明场和叠加信号。比例尺为 10 μm。
From left to right, signals from YFP, chlorophyll, bright filed, and overlapped figure were successively shown. Scale bar: 10 μm.
1614 作 物 学 报 第 38卷

3 讨论
复合转录因子 NF-Y 是由 NF-YA、NF-YB 和
NF-YC 三个亚基组成, 在所有真核生物中都能发现
它够在多种基因表达调控中起作用[1-2]。NF-YC蛋白
是 NF-Y 转录因子复合物的一个重要组成成分, 但
其详细功能尚未见报道。我们克隆到的大豆
GmNF-YC2 蛋白含有 DNA 结合域、与 NF-YA 和
NF-YB 的相互作用区域以及 CCAAT 结合域, 这些
功能域与拟南芥等植物中的同源基因 NF-YC9 高度
保守 , 表明 GmNF-YC2 基因可能具有与拟南芥的
AtNF-YC9 类似的功能 [14], 可能参与光周期开花调
控。
基因的表达分析表明 , 在不同光周期条件下 ,
GmNF-YC2的 mRNA积累与光照有关, 在长日照下
表达峰值出现在早晨, 在短日照下 GmNF-YC2 表达
峰值出现在下午。但是在随后的连续黑暗和连续光
照条件下, 这种表达节律变得不明显。说明该基因
的表达不是严格受光周期调控的, 而具有更为复杂
的调节机制。
时空表达分析结果说明, GmNF-YC2 的表达与
早期的营养生长和开花期的生殖生长之间的关系更
为密切, 因为它在单叶期和开花期的地上部表达量
最高。但是, 在不同器官组织、不同发育时期中的
表达变化有差异, 推测该基因的功能具有时空的差
异。如在单叶期子叶中 GmNF-YC2 含量最高, 可能
与子叶中的物质输出有关; 大豆单叶作为诱导器官,
在开花诱导过程中具有明显的作用[39-40], 而 GmNF-
YC2 主要在第 2 复叶期单叶中发挥作用, 因此推测
GmNF-YC2 可能与这一时期的光周期诱导有关; 在
开花期, 光周期对于植物开花的诱导和花的发育同
样具有明显的作用[39-41]。GmNF-YC2 在开花期的根
和第 3复叶中表达水平最高, 说明 GmNF- YC2可能
与地上部花发生与发育及其地下部的协同调控有
关。这些 GmNF-YC2在花的发生与发育等过程中具
有多重功能。
YFP 融合荧光蛋白的分析结果表明 , GmNF-
YC2 蛋白定位于细胞核, 很可能它是在核内发挥作
用的; 之前报道 CO 蛋白定位于细胞核内[14-15], 因
此推测叶片中 GmNF-YC2 蛋白可能在细胞核内与
CO蛋白相互作用, 进而诱导成花素基因 FT的表达,
FT蛋白通过韧皮部运输到生长点, 后者在生长点与
FD等蛋白互作导致花芽分化。
4 结论
预测到大豆基因组共有 15个 GmNF-YC家族成
员, 分布在 9 条染色体上, 从大豆垦农 18 中克隆出
与 AtNF-YC9 亲缘性最高的 GmNF-YC2 基因 ,
GmNF-YC2 具有一定的光周期节律, GmNF-YC2 的
表达具有发育和组织器官特异性, 并在细胞核内发
挥功能。推测 GmNF-YC2在大豆光周期开花调节发
挥重要作用。
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