全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(8): 1471−1482 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金重大国际合作交流项目(31061140457), 国家自然科学基金项目(31071360), 江苏省基础研究计划项目
(BK2009005), 2011年中央级科研院所基本科研业务费专项(农业) (201103003)和江苏省高校优势学科建设工程资助项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 杨建昌, E-mail: jcyang@yzu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: ntchtt@163.com
Received(收稿日期): 2012-01-13; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-06-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120604.1628.017.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01471
超级稻花后强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的差异
陈婷婷 谈桂露 褚 光 刘立军 杨建昌*
扬州大学 / 江苏省作物遗传生理重点实验室, 江苏扬州 225009
摘 要: 为进一步揭示水稻强、弱势粒灌浆差异的机制, 以 2 个超级稻品种两优培九(两系杂交籼稻)和淮稻 9 号(粳
稻)为材料, 通过双向电泳观察花后强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的差异并对差异蛋白进行质谱分析。结果表明, 弱
势粒花后 3~15 d的灌浆速率和最终粒重均显著小于强势粒。花后 3 d、8 d和 15 d弱势粒中蛋白质表达的点少于强势
粒, 花后 25 d则弱势粒多于强势粒。花后强、弱势粒间差异蛋白质表达量在 2倍以上的点有类似变化趋势。选择有
显著差异的 27 个蛋白点进行质谱分析, 其中 14 个点的功能得到鉴定。这些蛋白质分别参与籽粒的淀粉合成、蛋白
合成、光合作用、能量代谢、环境适应以及细胞信号转导等。说明强、弱势粒间多种灌浆相关蛋白质表达的差异是
其灌浆和粒重差异的重要原因。
关键词: 超级稻; 强、弱势粒; 灌浆相关蛋白质表达; 蛋白质功能; 籽粒灌浆
Differential Expressions of the Proteins Related to Grain Filling between Supe-
rior and Inferior Spikelets of Super Rice after Anthesis
CHEN Ting-Ting, TAN Gui-Lu, CHU Guang, LIU Li-Jun, and YANG Jian-Chang*
Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province / Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: Poor grain filling of the later-flowered inferior spikelets (in contrast to the earlier-flowered superior spikelets) is a seri-
ous problem in rice production. This problem is more aggravated in new bred super rice cultivars. To better understand the
mechanism underlying the poor grain filling of inferior spikelets, we investigated the difference in expressions of the proteins
related to grain filling in superior and inferior spikelets of two super rice cultivars, Liangyoupeijiu (indica hybrids) and Huaidao 9
(japonica) after anthesis through two-dimensional gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the MALDI analysis. Results showed that
the grain filling rate at 3–15 d after anthesis (DAA) and the final grain weight of inferior spikelets were much smaller than those
of superior spikelets. The spots of protein expressed were fewer in inferior spikelets than in superior spikelets at 3, 8, and 15 DAA,
and the results were reversed at 25 DAA. The spots of protein with two-fold expressions between superior and inferior spikelets
showed a similar changing tendency. Twenty seven protein spots with significant difference in the expression between superior
and inferior spikelets were chosen for the MALDI analysis, of which 14 protein spots were identified and their functions were
analyzed. These proteins were involved in grain starch synthesis, protein synthesis, photosynthesis, energy metabolism, environ-
mental adaptation and cell signal transduction. The results suggest that expression differences of the proteins related to grain fill-
ing account for the variation in grain filling between superior and inferior spikelets of rice.
Keywords: Super rice; Superior/inferior spikelets; Expressions of the proteins related to grain filling; Protein function; Grain
filling
水稻产量的高低决定于库容的大小和灌浆充实
的程度[1]。为了增加产量和提高产量潜力, 育种家们
主要通过增加每穗粒数, 即培育大穗型品种有效扩
大产量库容, 例如国际水稻研究所培育的新株型品
种、我国培育的亚种间杂交稻、超级杂交稻或超级
稻品种等[2]。但由于结实率低和结实率不稳定等问
题, 这些大穗型品种包括我国超级稻品种虽在生产
上大面积推广应用但并没有实现它们的增产潜力[3-6]。
1472 作 物 学 报 第 38卷

水稻籽粒充实的优劣和粒重及颖花在穗上着生的部
位有密切关系。一般来说, 着生在稻穗中上部早开
花的强势粒灌浆快、充实好、粒重高; 着生在稻穗
下部迟开花的弱势粒灌浆慢、充实差、粒重低[7-9]。
这种差异在超级稻品种上表现更突出[10-11]。人们从
同化物供应、激素平衡、酶活性和基因表达等方面
研究了其原因[12-17], 但其机理仍不清楚。
蛋白质组学是研究功能基因组重要的手段, 是
分子生物学中正在迅速发展的一个领域 [18]。目前 ,
水稻蛋白质组学研究主要集中在不同生育期基因表
达差异和不同环境因子条件下的适应性反应方
面[19-22], 对于水稻强、弱势粒灌浆期灌浆相关蛋白
质表达的差异缺乏系统研究。本研究旨在探讨超级
稻花后不同时期强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的
差异并分析其功能, 以进一步揭示水稻强、弱势粒
灌浆差异的机制。
1 材料与方法
1.1 供试品种与栽培情况
在扬州大学农学院实验农场种植通过农业部认
定的超级稻品种两优培九(两系杂交籼稻)和淮稻 9
号(粳稻)。两供试品种的主茎总叶数均为 17 叶, 伸
长节间数 5 个。试验地前茬为小麦, 土壤为沙壤土,
耕作层含有机质 2.02%、有效氮 103.2 mg kg–1、速
效磷 24.5 mg kg–1、速效钾 85.6 mg kg–1。5月 10~11
日播种, 6月 9~10日移栽。株、行距为 17 cm×20 cm,
每穴 2苗, 小区面积为 5.1 m × 6.6 m。重复 3次, 随
机区组排列。全生育期施尿素 420 kg hm–2, 按基肥
(移栽前 1 d)∶分蘖肥(移栽后 7 d)∶穗肥(叶龄余数
2.0)＝5∶2∶3施用。基施过磷酸钙(含 P2O5 13.5%)
445 kg hm–2。分别在移栽前 1 d和拔节期(叶龄余数
3.0)施用氯化钾(含 K2O 62.5%) 90 kg hm–2和 60 kg
hm–2。其余田间管理同当地常规高产栽培。
1.2 籽粒灌浆速率测定
于各小区抽穗期选择穗型大小基本一致的穗子
200个并挂上纸牌, 部分穗标记各颖花开花日期。自
开花至花后 21 d每隔 3 d、花后 21 d到成熟每隔 6 d,
取每品种标记穗 15个(每小区 5个)用于测定强、弱
势粒的重量。强势粒为穗上第 1、2天开花的颖花, 着
生在穗顶部一次枝梗; 弱势粒为穗上最后 2 d 开花
的颖花, 着生在穗基部二次枝梗。将摘取的强、弱
势粒在 70℃下烘干至衡重, 然后称重, 用 Richards
生长方程W=A/(1+Be−kt)1/N并按朱庆森等方法对籽粒
灌浆过程进行拟合计算灌浆速率[7,23]。方程中 W 为
粒重(mg), A为最终粒重(mg), t为花后天数。B、K、
N为回归方程所确定的参数。
1.3 蛋白提取及含量测定
分别于花后 3 d、8 d、15 d 和 25 d 取挂牌穗
12~15个 , 摘取强、弱势粒 , 置液氮中速冻后于−70
℃冰箱中保存用于蛋白质的提取。参照 Granier[24]
的 TCA/丙酮法提取蛋白质。称取冷冻籽粒试样
1.0~2.0 g, 将样品按 1∶4 加入提取介质(30 mmol
L–1 pH 8.8 Tris-HCl, 0.1 mmol L–1 pH 8.0 EDTA, 5
mmol L–1 MgCl2, 6 mmol L–1抗坏血酸, 1% PVP, 1%
甘油, 0.02% β-巯基乙醇), 在冰块上研磨, 放入 50
mL的离心管中, 4℃, 15 000×g离心 15 min, 取上清
液。加入 4~6 倍体积 10%三氯乙酸(TCA)溶液(丙酮
配制, 含 0.07% β-巯基乙醇), 混匀, −20℃静置 1 h以
上。4℃, 15 000×g离心 15 min, 沉淀经 80%冷丙酮
3~6 mL洗涤 3次后再用冷丙酮-乙醚液(体积比为 1∶
1)洗涤, 沉淀经真空干燥得到粉末状蛋白, −70℃冰
箱保存备用。参照 Bradford方法测定蛋白质含量[25]。
1.4 双向电泳
1.4.1 第一向固相 pH 梯度等电聚焦 称取一定
量的蛋白质样品, 用水化上样缓冲液(7 mol L–1尿素,
2 mol L–1硫脲, 4% CHAPS, 0.001%溴酚蓝, 用前加
入 65 mmol L–1 DTT和 0.2%两性电解质)充分溶解,
12 000×g离心 10 min, 取适量上清液加入水化上样
缓冲液至总体积为 350 μL (含蛋白质约为 1 000 μg),
将含样品的水化液加到水化盘中。取 pH 4~7, 11 cm
干胶条, 去掉保护膜。把干胶条胶面朝下置水化盘
中, 加入 1 mL矿物油均匀铺于胶面上, 于 17℃被动
水化 12~13 h。
取出水化好的胶条, 胶面朝下置聚焦盘中, 加
入 1 mL矿物油均匀铺于胶面上。根据以下电泳参数
进行等电聚焦(10.5 h): 250 V, 30 min; 1 000 V, 60
min; 8 000 V, 4 h; 8 000 V, 40 000 V h; 500 V, 任意时
间。
用平衡缓冲液 I (6 mol L–1尿素, 2% SDS, 20%
甘油, 2% DTT, 0.05 mol L–1 pH 8.8 Tris-HCl)振荡平
衡 15 min。换平衡缓冲液 II (6 mol L–1尿素, 2% SDS,
20%甘油 , 2.5%碘乙酰胺 , 0.05 mol L–1 pH 8.8
Tris-HCl)振荡平衡 15 min。取出胶条轻轻润洗, 并
去除多余的平衡液, 准备第二向电泳。
1.4.2 第二向 SDS-PAGE电泳 将已平衡好的第
一向胶条置第二向凝胶上方, 排除气泡, 使二者紧
第 8期 陈婷婷等: 超级稻花后强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的差异 1473


密接触, 加入分子量标记蛋白。用 1%琼脂糖凝胶封
固胶条, 接通电源。100 V胶恒压电泳, 待溴酚蓝前
沿移出 IPG胶条后, 再增大电压至 200 V, 待溴酚蓝
前沿距凝胶板底 0.5 cm时停止电泳, 准备剥胶与染
色。
电泳结束后 , 小心取下凝胶 , 切角作记号 , 用
水洗 3次, 每次 5 min, 再放入 Bio safe coomassie染
色液在摇床上不断摇动, 染色过夜, 然后倾去染色
液, 最后用水洗 30 min。
1.5 质谱鉴定及数据库搜索
扫描仪扫描脱色后的凝胶 , 用 PDQuest v 7.3
(Bio-Rad公司)软件分析强、弱势粒灌浆相关蛋白质
表达的差异(上调、下调、表达或不表达)。挖取在
不同时期有特异表达及上调的蛋白质点 27个, 送江
苏大学测试中心进行质谱分析, 获得肽质量指纹图
谱。
用 Mascot Wizard 软件在网站 http://www.Matrix
science.com/的蛋白数据库中搜索。设置最大允许肽
质量误差为 0.2 Da, 选物种来源为 Oryza sativa
(rice), 不变修饰和可变修饰分别为 Carbamidome-
thyl (C), Oxidation (M)。对目的蛋白质的 PMF进行
网上数据库匹配, 根据实际等电点和分子量以及匹
配的结果确定与目的蛋白质的 PMF 最相符的蛋白
质。
2 结果与分析
2.1 强、弱势粒灌浆
与强势粒相比, 弱势粒在花后 0~15 d的灌浆速
率较小, 开花 15 d以后灌浆速率较大(图 1-B, D)。
两品种弱势粒的最终粒重显著低于强势粒(图 1-A,
C)。两优培九和淮稻 9号的结实率较低 , 分别为
78.5%和 80.3% (表略)。2个超级稻品种弱势粒灌浆
速率小可能是其结实率较低的重要原因。
2.2 强、弱势粒 2-DE总蛋白点表达量的差异
由图 2可见, 两优培九在花后 3 d强势粒新增的
点 96个, 表达量 2倍上调的点 66个, 均显著高于弱
势粒新增点 38个和表达量2倍上调点63个(图2-A, B);
在花后 8 d强势粒新增的点 89个, 表达量 2倍上调的
点 78 个, 均显著高于弱势粒新增点 68 个和表达量 2
倍上调点 77个; 在花后 15 d, 强势粒新增点 84个, 表
达量 2倍上调的点 114个, 均高于弱势粒新增点 83个
和表达量2倍上调点105个; 在花后 25 d, 弱势粒新增
的点 119个, 表达量 2倍上调的点 109个, 均高于强势
粒新增点 104个和表达量 2倍上调点 72个。

图 1 两供试品种强、弱势粒籽粒增重(A, C)和籽粒灌浆(B, D)曲线
Fig. 1 Changes of grain weight (A, C) and grain filling rate (B, D) in superior and inferior spikelets of the two rice cultivars

淮稻 9 号各时期凝胶蛋白点的差异与两优培九
趋势一致(图 2-C, D)。表 1表明, 灌浆前期(花后 3 d、
8 d、15 d) 2个品种的强势粒检测出的蛋白点数都显
著高于弱势粒, 而在灌浆后期(花后 25 d)弱势粒的
蛋白点总数却显著高于强势粒。花后强、弱势粒蛋
白质表达量差异的变化与籽粒灌浆速率的变化趋势
1474 作 物 学 报 第 38卷

一致(图 1和表 1)。
2.3 强、弱势粒 2-DE 胶差异蛋白质点质谱分析
及鉴定结果
根据蛋白质双向电泳的结果, 从强、弱势粒表
达谱中选取 27 个表达量较高且两品种差异明显的
点 , 并在胶上挖取这些点进行胶内酶解 , 然后用
Ultraflex-TOF-TOF质谱仪(德国 Bruker公司)进行质
谱分析, 每个蛋白质就可以得到自己特异的肽质量
指纹图谱(PMF)。图 3即是一幅通过质谱分析得到的
具有代表性的 PMF。将 PMF 的实验结果与理论图
谱比较和评价, 是由实验数据转换成具有生物学意
义的结果的关键, 所以得到蛋白质 PMF后需要与网
上的数据库进行检索和比对。
检索结果见表 2 和表 3。强、弱势粒中共有 18
个蛋白质(点)的 PMF 与已知蛋白质相匹配, 其中有
4个蛋白质(点)为功能未知的假设蛋白, 另外 9个蛋
白质(点)未能得到鉴定。
通过数据库检索以及文献查询, 强势粒中得以
鉴定的 15个差异蛋白, 其中有 3个为功能未知的假
设蛋白或相应的基因(L15, H7, H9), 将已知功能的
12个蛋白据其功能分为 6大类。
(1)淀粉合成相关蛋白 : 葡萄糖-1-磷酸腺苷酰

图 2 强、弱势粒花后 3 d的灌浆相关蛋白质表达差异图
Fig. 2 Difference in proteome expressions between superior and inferior spikelets at three days after anthesis
A、B分别为两优培九强势粒和弱势粒; C、D分别为淮稻 9号强势粒和弱势粒。红色×为强势粒新增的点, 红色●为弱势粒新增的点,
蓝色▲为强势粒比弱势粒表达量 2倍上调的点, 绿色■为弱势粒比强势粒表达量 2倍上调的点。
A and B: superior and inferior spikelets of the cultivar Liangyoupeijiu; C and D: superior and inferior spikelets of the cultivar Huaidao 9. ×
in red and ● in red mean new protein spots in superior and inferior spikelets respectively; ▲ in blue and ■ in green mean spots with
two-fold expression (up-regulation) in superior spikelets than in inferior spikelets, and in inferior spikelets than in superior spikelets,
respectively.

第 8期 陈婷婷等: 超级稻花后强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的差异 1475


表 1 两超级稻品种花后强、弱势粒蛋白质点 PDQuest比较分析
Table 1 PDQuest comparative analysis of the total protein spots in superior and inferior spikelets of the two super rice cultivars
after anthesis
品种
Cultivar
花后天数
Days after anthesis
总蛋白点数
Total spots
新增的蛋白点
New protein spots
表达量 2倍上调的点
Up-regulation protein spots
S-3 d 448 96 66
I-3 d 386 38 63
S-8 d 455 89 78
I-8 d 426 68 77
S-15 d 521 84 114
I-15 d 509 83 105
S-25 d 517 104 72
两优培九
Liangyoupeijiu
I-25 d 532 119 109


S-3 d 168 19 35
I-3 d 158 10 20
S-8 d 344 98 182
I-8 d 274 37 7
S-15 d 385 35 44
I-15 d 378 31 40
S-25 d 292 51 51
淮稻 9号
Huaidao 9
I-25 d 321 84 53
S: 强势粒; I: 弱势粒。S: superior spikelets; I: inferior spikelets.

图 3 一个蛋白质点的肽质量指纹图谱(点 L1)
Fig. 3 Peptide mass finger printing (PMF) of a protein (spot L1)

(基)转移酶小亚基。该蛋白于花后 3 d仅在强势粒中
表达, 花后 8 d和 15 d强势粒表达显著高于弱势粒,
而花后 25 d弱势粒表达量显著高于强势粒(图 4)。
(2)蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白: 包括蛋白质
1476 作 物 学 报 第 38卷

二硫键异构酶、丙酮酸磷酸双激酶前体和丙酮酸磷
酸双激酶 1。花后 3 d的蛋白质二硫键异构酶在强、
弱势粒中均无表达, 其他各时期蛋白质二硫键异构
酶表达量均强势粒高于弱势粒; 而丙酮酸磷酸双激
酶前体和丙酮酸磷酸双激酶 1 在花后 3 d 的强、弱
势粒中均无表达, 花后 8 d、15 d弱势粒二者表达量
显著低于强势粒(图 5)。
(3) 细胞能量调节相关蛋白: 核苷二磷酸激酶。
该蛋白花后 3 d 仅在强势粒中表达, 其余各时期强
势粒表达量均显著高于弱势粒(图 6)。

表 2 强势粒差异蛋白点质谱鉴定结果
Table 2 Identification results of the protein spots with expression differences in superior spikelets
编号
Code
蛋白质名称
Protein name
登录号
Accession number
分类
Taxonomy
分子量
MW
(kD)
等电点
pI
序列覆盖率
Sequence
coverage (%)
Mascot
得分值
Score
L2 根特异性病程相关蛋白 10
Root specific pathogenesis-related
protein 10
Q75T45_ORYSA
Oryza sativa
japonica group 17.00 4.88 53 110
L4 脱氢抗坏血酸还原酶
Dehydroascorbate reductase
Q84UH5_ORYSA
Oryza sativa 23.73 5.81 50 102
L7 核苷二磷酸激酶
Nucleoside-diphosphate kinase
S43330
Oryza sativa 16.85 6.30 53 88
L8 丙酮酸磷酸双激酶前体
Pyruvate, phosphate dikinase precur-
sor
T02979
Oryza sativa 103.59 5.98 32 166
L11 葡萄糖-1-磷酸腺苷酰(基)转移酶小
亚基
Glucose-1-phosphate adenylyltrans-
ferase small subunit
GLGS_ORYSJ
Oryza sativa
japonica group 56.47 6.58 25 82
L12 乙二醛酶 I
Glyoxalase I
gi|16580747 Oryza sativa
japonica group 32.52 5.51 42 99
L15 Os07g0638300 gi|115473617 Oryza sativa indica group 24.20 5.97 39 109
H1 类腺苷高半胱氨酸酶蛋白
Adenosylhomocysteinase-like protein
Q84VE1_ORYSA Oryza sativa
japonica group 53.86 5.62 26 96
H2 烯醇酶
Enolase
ENO_ORYSJ Oryza sativa
japonica group 48.29 5.41 28 65
H3 S -腺苷甲硫氨酸合酶 1
S-adenosylmethionine synthase 1
METK1_ORYSJ Oryza sativa
indica group 43.65 5.74 38 121
H4 L-抗坏血酸过氧化物酶 2
L-ascorbate peroxidase 2
APX2_ORYSJ Oryza sativa
japonica group 27.22 5.21 41 86
H5 丙酮酸磷酸双激酶 1
Pyruvate, phosphate dikinase 1
PPDK1_ORYSJ Oryza sativa
japonica group 103.58 5.98 31 167
H7 假设蛋白 OsJ_36598
Hypothetical protein OsJ_36598
gi|222617337 Oryza sativa
japonica group 54.48 9.53 22 68
H8 蛋白质二硫键异构酶
Protein disulfide isomerase
gi|7209794
Oryza sativa 33.50 4.81 44 117
H9 假设蛋白
Hypothetical protein
Q338D9_ORYSA Oryza sativa
japonica group 3.77 4.96 84 64
L: 两优培九; H: 淮稻 9号。L: Liangyoupeijiu; H: Huaidao 9.

表 3 弱势粒差异蛋白点质谱鉴定结果
Table 3 Identification results of the protein spots with expression differences in inferior spikelets
编号
No.
蛋白质名称
Protein name
登录号
Accession number
分类
Taxonomy
分子量
MW
(kD)
等电点
pI
序列覆盖率
Sequence
coverage (%)
Mascot
得分值
Score
L9 几丁质酶
Chitinase
Q9FWE9_ORYSA Oryza sativa
27.93 6.09 37 64
L10 核酮糖二磷酸羧化酶大亚基
Ribulose bisphosphate carboxylase large chain
Q5K3B1_ORYSA Oryza sativa
53.33 6.23 23 107
H11 Os07g0638300 gi|115473617 Oryza sativa
japonica group 24.20 5.97 45 111
L: 两优培九; H: 淮稻 9号。L: Liangyoupeijiu; H: Huaidao 9.
第 8期 陈婷婷等: 超级稻花后强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的差异 1477



图 4 强、弱势粒淀粉合成相关蛋白[葡萄糖-1-磷酸腺苷酰(基)转移酶小亚基]表达量的差异
Fig. 4 Difference in expression quantity of the protein related to starch synthesis (glucose-1-phosphate adenylyltransferase small
subunit) between superior and inferior spikelets
3DAA、8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 3 d、8 d、15 d、25 d。S: 强势粒; I: 弱势粒。
3DAA, 8DAA, 15DAA, and 25DAA denote 3, 8, 15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.

图 5 强、弱势粒蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白表达量的差异
Fig. 5 Differences in expression quantity of proteins related to metabolisms of proteins and amino acids between superior and
inferior spikelets
(a)蛋白质二硫键异构酶; (b)丙酮酸磷酸双激酶前体; (c)丙酮酸磷酸双激酶 1; 8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 8 d、15 d、25 d。
S: 强势粒; I: 弱势粒。
(a) Protein disulfide isomerase; (b) Pyruvate, phosphate dikinase precursor; (c) Pyruvate, phosphate dikinase 1; 8DAA, 15DAA, and 25DAA
denote 8, 15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.

图 6 强、弱势粒细胞能量调节相关蛋白(核苷二磷酸激酶)表达量的差异
Fig. 6 Difference in expression quantity of the protein related to cell energy regulation (nucleoside-diphosphate kinase) between
superior and inferior spikelets
3DAA、8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 3 d、8 d、15 d、25 d。S: 强势粒; I: 弱势粒。
3DAA , 8DAA, 15DAA and 25DAA denote 3, 8, 15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.

(4)解毒类蛋白: 包括脱氢抗坏血酸还原酶、L-
抗坏血酸过氧化物酶 2和乙二醛酶 I。在多数时间脱
氢抗坏血酸还原酶和 L-抗坏血酸过氧化物酶 2的表
达量强势粒均显著高于弱势粒; 花后 3 d 弱势粒中
的乙二醛酶 I 的表达量显著高于强势粒, 而花后 8
d、15 d和 25 d, 该蛋白弱势粒中的表达量则显著低
于强势粒(图 7)。
(5)环境适应相关蛋白: 包括类腺苷高半胱氨酸
酶蛋白、S-腺苷甲硫氨酸合酶 1和烯醇酶。花后 3 d、
8 d和 15 d, 类腺苷高半胱氨酸酶蛋白和 S-腺苷甲硫
氨酸合酶 1 二者表达量强势粒均显著高于弱势粒,
而花后 25 d 弱势粒显著高于强势粒; 各个时期下,
烯醇酶的表达量均为强势粒高于弱势粒(图 8)。
(6)病程相关蛋白: 根特异性病程相关蛋白 10。
花后 3 d、25 d强势粒中根特异性病程相关蛋白 10
表达量显著高于弱势粒; 而花后 8 d、15 d弱势粒表
达量显著高于强势粒(图 9)。
弱势粒 3 个得以鉴定的差异蛋白中有 1 个为功
能未知的假设蛋白(H11), 其余 2 个可按功能分类如
下:
1478 作 物 学 报 第 38卷


图 7 强、弱势粒解毒类蛋白表达量的差异
Fig. 7 Differences in expression quantity of the proteins related to detoxification between superior and inferior spikelets
(a) 脱氢抗坏血酸还原酶; (b) L-抗坏血酸过氧化物酶 2; (c) 乙二醛酶 I; 3DAA、8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 3 d、8 d、15 d、
25 d。S: 强势粒; I: 弱势粒。
(a) Dehydroascorbate reductase; (b) L-ascorbate peroxidase 2; (c) Lactoylglutathione lyase; 3DAA, 8DAA, 15DAA, and 25DAA denote 3, 8,
15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.


图 8 强、弱势粒环境适应相关蛋白表达量的差异
Fig. 8 Differences in expression quantity of the proteins related to environmental adaptation between superior and inferior spikelets
(a) 类腺苷高半胱氨酸酶蛋白; (b) S-腺苷甲硫氨酸合酶 1; (c) 烯醇酶; 3DAA、8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 3 d、8 d、15 d、
25 d。S: 强势粒; I: 弱势粒。
(a) Adenosylhomocysteinase-like protein; (b) S-adenosylmethionine synthase 1; (c) Enolase; 3DAA, 8DAA, 15DAA, and 25DAA denote 3, 8,
15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.


图 9 强、弱势粒病程相关蛋白(根特异性病程相关蛋白 10)表达量的差异
Fig. 9 Difference in expression quantity of the protein related to pathogenesis (root specific pathogenesis-related protein 10) between
superior and inferior spikelets
3DAA、8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 3 d、8 d、15 d、25 d。S: 强势粒; I: 弱势粒。
3DAA, 8DAA, 15DAA, and 25DAA denote 3, 8, 15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.

(1)病程相关蛋白: 几丁质酶。除花后 3 d, 其余
各时期几丁质酶在弱势粒中的表达量显著高于强势
粒(图 10)。
(2)光合作用相关蛋白: 核酮糖二磷酸羧化酶大
亚基。花后 3 d, 核酮糖二磷酸羧化酶大亚基在强势
粒中的表达量高于弱势粒。而花后 8 d、15 d和 25 d,
弱势粒中的表达量高于强势粒(图 11)。
3 讨论
本研究表明 , 超级稻籽粒灌浆速率和粒重在
强、弱势粒间存在很大差异。对于水稻强、弱势粒
灌浆差异的机制, 人们从同化物供应、激素平衡、
第 8期 陈婷婷等: 超级稻花后强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的差异 1479



图 10 强、弱势粒病程相关蛋白(几丁质酶)表达量的差异
Fig. 10 Difference in expression quantity of the protein related to pathogenesis (chitinase) in superior and inferior spikelets
3DAA、8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 3 d、8 d、15 d、25 d。S: 强势粒; I: 弱势粒。
3DAA, 8DAA, 15DAA, and 25DAA denote 3, 8, 15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.

图 11 强、弱势粒光合代谢相关蛋白(核酮糖二磷酸羧化酶大亚基)表达量的差异
Fig. 11 Difference in expression quantity of the protein related to photosynthetic metabolism (ribulose bisphosphate carboxylase
large chain) between superior and inferior spikelets
3DAA、8DAA、15DAA、25DAA分别代表花后 3 d、8 d、15 d、25 d。S: 强势粒; I: 弱势粒。
3DAA, 8DAA, 15DAA, and 25DAA denote 3, 8, 15, and 25 days after anthesis. S: superior spikelets; I: inferior spikelets.

酶活性和基因表达等方面研究了其原因[12-17], 但有
关超级稻强、弱势粒灌浆过程中蛋白质组表达差异
的动态研究, 还未见报道。本研究观察到, 不同灌浆
时期强、弱势粒中蛋白质表达量明显不同, 蛋白质
的功能也有 6类。笔者根据差异蛋白质功能分析, 推
测水稻强、弱势粒灌浆的差异可能有如下原因。
(1)淀粉合成相关蛋白 : 葡萄糖-1-磷酸腺苷酰
(基)转移酶小亚基表达的差异。葡萄糖-1-磷酸腺苷
酰(基)转移酶是催化葡萄糖-1-磷酸+ATP+PPi 反应
来合成腺苷二磷酸葡萄糖的关键酶, 蔗糖合酶能利
用腺苷二磷酸葡萄糖为葡萄糖的供体, 与果糖合成
蔗糖, 籽粒中的蔗糖必须在蔗糖合酶和转化酶等的
作用下降解为单糖, 才能合成淀粉[26]。因此, 葡萄
糖-1-磷酸腺苷酰(基)转移酶与籽粒中淀粉的形成有
关。弱势粒灌浆早中期葡萄糖-1-磷酸腺苷酰(基)转
移酶表达量低会导致这些籽粒可溶性糖转化为淀粉
的能力低, 灌浆启动慢, 淀粉合成少。
(2)蛋白质及氨基酸代谢相关酶: 蛋白质二硫键
异构酶表达的差异。蛋白质二硫键异构酶催化蛋白
质分子内天然二硫键的形成, 是与新生肽折叠和成
熟密切有关的多功能蛋白。大部分时期特别是灌浆
早期该两蛋白质表达量强势粒高于弱势粒, 说明强
势粒中蛋白质积累较弱势粒快。
(3)细胞能量调节相关酶: 核苷二磷酸激酶表达
的差异。核苷二磷酸激酶(NDPK)的主要功能是通过
催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间的磷
酸基团转移来维持生物体细胞内核苷三磷酸(NTP)
的浓度。此外它还具有 NDP激酶活性和蛋白磷酸转
移酶活性, 并参与转录调控和细胞内信号传导, 可
以调节细胞增殖、分化、发育和凋亡[27-29]。任世英
等[30]指出, NDPK 能够调节细胞中 NTP 的浓度, 从
而可能影响细胞对磷的吸收能力。灌浆各时期强势
粒中 NDPK 表达量高于弱势粒, 说明强势粒具有较
强的能量代谢环境, 这是强势粒灌浆启动早、灌浆
速率快的重要保证。
(4)解毒酶类: 脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、L-
抗坏血酸过氧化物酶 2(APX)和乙二醛酶 I表达的差
异。DHAR 能保持植物体内还原型抗坏血酸(ASA)
水平以清除氧化反应产生的活性氧自由基[31]。此外,
DHAR在植物抗逆反应中发挥着重要作用。APX也
叫维生素 C 过氧化物酶, 一般认为, APX 是叶绿体
中利用抗坏血酸为电子供体清除 H2O2 维持植物正
常的生理功能的主要酶[32]。DHAR和 APX表达量的
高低与清除细胞中的过氧化物能力的高低直接有
关[32-33]。灌浆期大部分时间这两种酶的表达量强势
粒均显著高于弱势粒, 说明强势粒具有较高的自我
调节和保护机制, 而弱势粒较差的防御解毒能力影
响其中的各种酶和蛋白等活性物质的功能发挥, 致
使灌浆慢、粒重轻。
植物乙二醛酶是一种与环境密切相关的多功能
酶, 它与环境胁迫如盐、重金属等胁迫正相关[34-35]。
乙二醛酶包含乙二醛酶 I 和乙二醛酶 II 两种, 一起
参与体内甲基乙二醛的代谢[36]。乙二醛酶 I 的主要
生理作用是与乙二醛酶 II协同将细胞正常代谢产生
的毒性甲基乙二醛转化为无毒的 D-乳酸。本研究观
察到灌浆期大部分时期弱势粒中乙二醛酶 I 表达下
1480 作 物 学 报 第 38卷

调, 这可能造成弱势粒解毒能力减弱, 导致弱势粒
灌浆速率小。
(5)环境适应相关蛋白 : 类腺苷高半胱氨酸酶
(SAHH)、S-腺苷甲硫氨酸合酶 1(SAMS)和烯醇酶表
达量的差异。SAHH 是调节细胞内甲基反应的一个
关键酶。SAHH在生物体内主要催化 S-腺苷-L-高半
胱氨酸(SAH)水解 , 使 SAH 甲基顺利转移 , 所以
SAHH 在基因表达调控中起类似开关的作用, 调控
植物的生长发育。在生物体内, SAHH还可通过影响
细胞分裂素的含量来诱导植物的抗性防御 , 因此 ,
SAHH 在生物体抗病毒性、抗逆性等抗性防御中也
起重要作用。SAMS催化甲硫氨酸和 ATP生成 S-腺
苷甲硫氨酸(SAM)。SAM是生化反应中的主要甲基
供体[37], 在正常的磷脂、DNA、RNA和蛋白质甲基
化反应和基因表达中提供甲基基团, 其在代谢过程
中的细微含量变化都可能对细胞的生长、分化、功
能产生巨大的影响[38]。同时, SAM是多胺和乙烯合
成的前体, 近年来的研究表明乙烯和多胺都参与植
物抗逆反应, 所以 SAMS 在植物抗逆生理方面可能
也发挥一定作用。水稻灌浆早期强势粒中较高的
SAHH 和 SAMS 表达有利于增强其环境适应能力,
提高各种基因的表达, 促进细胞的生长及分化, 进
而促进强势粒的灌浆。
烯醇酶是糖酵解途径中的一个重要酶类, 可催
化磷酸甘油酸脱水形成磷酸烯醇式丙酮酸。它被广
泛认为是与植物抗逆性相关的基因[39]。灌浆各期强
势粒中烯醇酶的表达量均高于弱势粒, 说明强势粒
较弱势粒有较高的损伤修复能力, 保证其灌浆的正
常进行。
(6)光合作用相关蛋白: 丙酮酸磷酸双激酶前体
和核酮糖二磷酸羧化酶大亚基表达的差异。丙酮酸
磷酸双激酶(PPDK)是 C4 植物叶绿体里与光合作用
有关的重要酶。在 C3植物的组织器官中 PPDK是一
个普遍存在的低丰度酶。Chastain 等[40]的研究证明,
C3植物叶片和发育种子中 PPDK活性同样受到蛋白
质可逆磷酸化的诱导, 在处于发育阶段的颖谷类植
物种子中 PPDK 的丰度较高。据此推测, 弱势粒灌
浆初期丙酮酸磷酸双激酶前体表达量较低, 可能会
造成弱势粒光合速率低, 灌浆速率小。
核酮糖二磷酸羧化酶 /加氧酶是植物光合作用
卡尔文循环中固定 CO2的一个关键酶 , 由 8个大亚
基和 8 个小亚基构成。亚基具有催化功能, 活性部
位位于大亚基上, 其酶活性的高低直接影响植物的
净光合产量。本研究观察到, 在灌浆初期, 强势粒
中核酮糖二磷酸羧化酶大亚基较弱势粒表达量高 ,
这可能是强势粒灌浆启动早的一个重要原因。在灌
浆后期, 强势粒颖壳变黄, 而弱势粒仍保持绿色较
好地进行光合作用 , 所以弱势粒中核酮糖二磷酸
羧化酶大亚基的表达较强势粒高。这也可能是弱势
粒在开花后 20~30 d具有较高灌浆速率的一个原因
所在。
本研究还观察到强、弱势粒中病程相关蛋白—
—几丁质酶和根特异性病程相关蛋白(PR)10 表达量
存在差异, 且因灌浆期的不同其在强、弱势粒中的
表达量表现不一。对于病程相关蛋白表达的差异与
强、弱势粒灌浆的关系, 有待深入研究。
还应当指出, 本研究虽然从蛋白质组学方面探
讨了水稻强、弱势粒灌浆差异的机理, 从 6 类蛋白
质的功能方面分析了弱势粒灌浆差的原因, 较之以
前测定酶的活性或激素含量等, 本研究内容和方法
有新的拓展, 并为水稻强、弱势粒灌浆差异的分子
机制研究提供了重要参考。但本研究未能提供直接
证据证明这 6 类蛋白表达的差异就是造成强、弱势
粒灌浆差异的原因, 也没有证明哪一类蛋白在哪一
个灌浆阶段起关键调控作用。因此, 要阐明水稻强、
弱势粒灌浆差异的蛋白质组学原理, 仍需做大量的
工作。
4 结论
超级稻弱势粒灌浆速率和粒重显著小于强势
粒。灌浆期参与淀粉合成(葡萄糖-1-磷酸腺苷酰(基)
转移酶小亚基)、蛋白质及氨基酸的代谢(蛋白质二
硫键异构酶、丙酮酸磷酸双激酶前体和丙酮酸磷酸
双激酶 1), 细胞能量调节(核苷二磷酸激酶)、环境适
应(类腺苷高半胱氨酸酶蛋白、烯醇酶和 S-腺苷甲硫
氨酸合酶)、解毒酶类(脱氢抗坏血酸还原酶、L-抗坏
血酸过氧化物酶 2和乙二醛酶 I)、光合作用(核酮糖
二磷酸羧化酶大亚基)和病程相关蛋白(根特异性病
程相关蛋白 10 和几丁质酶)的表达量在强、弱势粒
间有很大差异。灌浆期特别是灌浆早期弱势粒中葡
萄糖-1-磷酸腺苷酰(基)转移酶小亚基的缺少, 丙酮
酸磷酸双激酶、核苷二磷酸激酶、脱氢抗坏血酸还
原酶、L-抗坏血酸过氧化物酶 2、乙二醛酶 I和类腺
苷高半胱氨酸酶蛋白及 S-腺苷甲硫氨酸合酶和烯醇
酶表达量低可能是其灌浆启动慢、灌浆速率小、粒
重轻的重要原因。
第 8期 陈婷婷等: 超级稻花后强、弱势粒灌浆相关蛋白质表达的差异 1481


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