全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(1): 173−178 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由四川省教育厅自然科学研究基金项目(2006B006), 四川农业大学青年科技创新基金项目(00130900)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 黄玉碧, E-mail: yubihuang@sina.com
Received(收稿日期): 2008-03-28; Accepted(接受日期): 2008-07-13.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00173
四川部分晾晒烟种质遗传关系的 SRAP分析
龙 腾 1 刘 雷 2 黄玉碧 1,2,*
1 四川农业大学玉米研究所; 2 四川农业大学农学院, 四川雅安 625014
摘 要: 对 25份四川地方性晾晒烟材料、1份黄花烟和 1份普通烤烟材料进行了 SRAP分析。共检测到 3 368条扩
增带, 其中特异性条带为 998 条, 平均多态检出率为 29.6%。27 个应试材料间遗传相似系数在 0.26~0.97 间, 平均为
0.62, 表现出明显的遗传差异; 其中黄花烟、烤烟和晾晒烟 3 个栽培类型间遗传相似系数为 0.38~0.78; 在 25 份晾晒
烟品种间遗传相似性较高为 0.75~0.97, 显示出种内的遗传基础相对比较狭窄, 但苍龙毛烟与其他供试材料有较大的
遗传差异。经聚类分析, 可将黄花烟、烤烟和晾晒烟品种划分为 3个栽培类别, 反映出栽培类型间的遗传差异; 进一
步将 25份晾晒烟材料分为 3个亚类和 2个单一品种的个类; 但按传统方法命名的多个毛烟品种和柳烟品种未被明显
地分别聚为两类。SRAP标记技术能高效揭示亲缘关系很近的晾晒烟种质资源的遗传背景和亲缘关系。
关键词: 晾晒烟; 种质资源; 遗传关系; SRAP
Genetic Analysis of Sichuan Sun-Cured Tobacco Germplasm by SRAP
LONG Teng 1, LIU Lei 2, and HUANG Yu-Bi 1,2,∗
1 Maize Research Institute of Sichuan Agricultural University; 2Agronomy College of Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China
Abstract: SRAP was used to analyze genetic relationships of 25 sun-cured tobacco varieties, one Nicotiana rustica variety, and
one flue-cured tobacco variety collected from Sichuan province. PCR products were detected by polyacrylamide gel electrophore-
sis (PAGE). A total of 3 368 DNA fragments were obtained, 998 of them were specific bands (polymorphic ratio was 29.6%), the
average number of amplified DNA bands was 40 per primer. Genetic similarity ranged from 0.26 to 0.97 for all varieties, from
0.38 to 0.78 between Nicotiana rustica varieties, flue-cured tobacco varieties and sun-cured tobacco varieties, and from 0.75 to
0.97 among 25 sun-cured tobacco varieties. Cluster analysis was carried out with unweighted pair group method with arithmetic
mean (UPGMA)．The results showed that all 27 varieties could be clustered into three groups, which revealed the genetic diversity
among three cultivar-type tobacco germplasms. Furthermore, 25 sun-cured tobacco varieties could be classified into three sub-
groups and two single varieties. Maoyan and Liuyan were two traditional famous groups of Sichuan sun-cured tobacco species.
However, Maoyan and Liuyan varieties named by traditional method were not obviously grouped into two types. All results indi-
cated that SRAP analysis may be used to reveal the genetic relationships among sun-cured tobacco varieties, providing a scientific
basis for tobacco genetic research and breeding.
Keywords: Sun-cured tobacco; Germplasm; Genetic relationship; SARP
晾晒烟是生产雪茄烟和混合型卷烟的重要原料, 也
是开发新式卷烟的原料资源。四川种植的地方性晾晒烟品
种属于普通烟草亚属的普通烟草种(Nicotiana tabacum L.),
其典型代表毛烟、柳烟是中国特有的晾晒烟类型品种, 已
于 2003年被列入我国的“名晾晒烟名录”。然而 , 长期以
来四川省晾晒烟品种的引种、繁种、留种和命名等工作都
是由烟农自己完成, 缺乏系统性的管理和记录。当地烟农
往往根据烟草植株形态或叶片特征进行命名, 如将烟叶
长宽比较大的品种称为柳烟, 将叶片多毛的品种称为毛
烟; 这种命名方法极易造成品种命名混乱的现象 , 如现
有已知被冠以毛烟或柳烟的品种都各有 10 个左右。由于
这些原因, 使得许多四川地方性晾晒烟的品种来源不明、
品种间遗传关系不清, 这种状况已成为进一步改良和利
用晾晒烟的限制性因素。
鉴定并分析晾晒烟种质的亲缘关系是加快晾晒烟
品种改良和利用的基础。在种质鉴定和分析方面, 分子
标记是在 DNA 分子水平上对产生的变异直接进行标记,
不受基因表达与否的限制, 具有信息量大、多态性强、
174 作 物 学 报 第 35卷
快速准确、不受环境和发育时期影响等特点 [1]。因此用
分子标记来揭示晾晒烟的遗传多样性及其亲缘关系 , 建
立分子标记辅助育种技术体系非常必要。SRAP(Sequence
Related Amplified Polymorphism)标记是 2001 年美国加
洲大学蔬菜作物系的 Li 等 [2-3]在芸薹属植物上开发出的
一种新型的、基于 PCR的分子标记技术, 利用独特的引
物设计对 ORFs(Open Reading Frames, 开放阅读框)进行
扩增。SRAP 标记结合了 AFLP 及 RAPD 的优点 , 不需
预先知道序列信息 , 能够快速获得大量可用于遗传连
锁图构建及遗传多样性研究的信息 , 且试验结果可靠。
目前 , 该技术已应用于水稻、棉花、油菜、马铃薯 [4-10]
等作物的研究中 , 并取得了较好的成效。在烟草的遗
传多样性与亲缘关系研究中 , 已有 RAPD、 ISSR 和
AFLP[11-17]等分子标记技术被成功应用, 但涉及 SRAP标
记技术的极少。本研究以该标记技术对四川地方性晾晒
烟材料进行了亲缘关系的初步研究 , 以期为四川地方
晾晒烟种质鉴别、遗传分类和亲本合理选配等提供参
考。
1 材料和方法
1.1 供试材料
中国农科院烟草所的烟草中期种质库提供和民间收
集的四川地方晾晒烟(Nicotiana tabacum)品种材料共 25
个, 烤烟(Nicotiana tabacum)和黄花烟(Nicotiana rustica)
材料各 1个(表 1)。每个品种种植 10株, 水肥管理同当地
常规栽培。
表 1 供试材料的编码、品种名、类型和来源
Table 1 Serial number, name, type, and origins of materials in the study
材料编号
Serial No.
品种
Cultivar
类型
Type
产地来源
Origin
1 青毛籽 Qingmaozi 晾晒烟 SCT 四川郫县 Pixian, Sichuan
2 黄毛子 1 Huangmaozi 1 晾晒烟 SCT 四川郫县 Pixian, Sichuan
3 大涧槽 Dajiancao 晾晒烟 SCT 四川什邡 Shifang, Sichuan
4 小丝毛烟 Xiaosimaoyan 晾晒烟 SCT 四川邻水 Linshui, Sichuan
5 苍龙毛烟 Canglongmaoyan 晾晒烟 SCT 四川旺苍 Wangcang, Sichuan
6 仁河白毛烟 Renhebaimaoyan 晾晒烟 SCT 四川南江 Nanjiang, Sichuan
7 红峰毛烟 Hongfengmaoyan 晾晒烟 SCT 四川宣汉 Xuanhan, Sichuan
8 黄溪毛烟 Huangximaoyan 晾晒烟 SCT 四川城口 Chengkou, Sichuan
9 庙子毛烟 Miaozimaoyan 晾晒烟 SCT 四川万源 Wanyuan, Sichuan
10 半铁泡 Bantiepao 晾晒烟 SCT 四川什邡 Shifang, Sichuan
11 黑牛皮 Heiniupi 晾晒烟 SCT 四川什邡 Shifang, Sichuan
12 灵杰柳叶 Lingjieliuye 晾晒烟 SCT 四川什邡 Shifang, Sichuan
13 绵竹柳烟 Mianzhuliuye 晾晒烟 SCT 四川绵竹 Mianzhu, Sichuan
14 郫县柳叶 Pixianliuye 晾晒烟 SCT 四川郫县 Pixian, Sichuan
15 宜宾大柳叶 Yibindaliuye 晾晒烟 SCT 四川宜宾 Yibin, Sichuan
16 乐山小柳叶 Leshanxiaoliuye 晾晒烟 SCT 四川犍为 Qianwei, Sichuan
17 黑蛮柳 Heimanliu 晾晒烟 SCT 四川绵竹 Mianzhu, Sichuan
18 眉山小柳叶 Meishanxiaoliuye 晾晒烟 SCT 四川眉山 Meishan, Sichuan
19 锦江柳叶 4号 Jinjiangliuye 4 晾晒烟 SCT 四川新都 Xindu, Sichuan
20 四川柳叶 Sichuanliuye 晾晒烟 SCT 四川犍为 Qianwei, Sichuan
21 乐山毛毛叶 Leshanmaomaoye 晾晒烟 SCT 四川犍为 Qianwei, Sichuan
22 什邡柳烟 Shifangliuye 晾晒烟 SCT 四川什邡 Shifang, Sichuan
23 基地烟 CW3 晾晒烟 SCT 四川什邡 Shifang, Sichuan
24 遂宁 1号 Suining 1 晾晒烟 SCT 四川遂宁 Suining, Sichuan
25 遂宁 2号 Suining 2 晾晒烟 SCT 四川遂宁 Suining, Sichuan
26 小黄烟 Xiaohuangyan 黄花烟 NR 四川阿坝 Aba, Sichuan
27 云烟 85 Yunyan 85 烤烟 FCT 云南玉溪 Yuxi, Yunnan
FCT: flue-cured tobacco; NR: Nicotiana rustia; SCT: sun-cured tobacco.
1.2 DNA提取
当供试材料长出 7~8个叶片时, 在同一品种的 10个
单株上采摘等量新鲜幼嫩叶片混合后进行烟草基因组
DNA 的提取 , 采用经过改良的 2×CTAB 法提取及检
测[18]。
1.3 SRAP扩增
引物由上海英骏生物(invitrogen)技术公司合成(表 2)。
PCR扩增程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min,
35℃复性 1 min, 72℃延伸 1 min; 5个循环, 94℃变性 1 min,
50℃复性 1 min, 72℃延伸 1 min; 35个循环, 最后 72℃延
伸 10 min, 4℃保存。
1.4 SRAP扩增产物的银染检测
PCR扩增后, 在 25 μL体系中加约 2~3 μL变性凝胶
加样缓冲液 SGB, 95℃变性处理 3~5 min后迅速将 PCR管
取出放置冰上, 迅速点样, 在 6%的 PAGE胶上每孔点样 5
μL, 恒功率 75 W, 电泳 1 h左右, 直至二甲苯氰带至板的
第 1期 龙 腾等: 四川部分晾晒烟种质遗传关系的 SRAP分析 175
表 2 SRAP引物序列表
Table 2 Sequences of SRAP primers
编号
Code
正向引物
Forward primers
编号
Code
反向引物
Reverse primers
me1 5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em1 5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′
me2 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′ em2 5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′
me3 5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em3 5′-GACTGCGTACGAATTGAC-3′
me4 5′-TGAGTCCAAACCGGACC-3′ em4 5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′
me5 5′-TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em5 5′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′
em6 5′-GACTGCGTACGAATTGCA-3′
2/3 处即可。将玻璃板从电泳槽取下, 迅速固定、染色、
显影、终止、漂洗晾干并拍照。
1.5 数据统计分析
将电泳图谱上清晰出现的条带记为1, 同一位置无条
带记为 0, 条带不够清晰或缺失记做 9。利用 NTSYS-pc
2.10 软件进行数据分析, 计算出每个材料间的遗传相似
系数。用 UPGMA法(Unweighted Pair-Group Method with
Arithmetic mean)进行聚类分析, 构建分子进化系统树状
图[19]。
2 结果与分析
2.1 扩增产物的多态性
从 30对 SRAP引物组合中选出扩增带纹丰富、清晰,
且多态性位点百分比较高的引物组合 25对, 对 27份烟草
材料进行扩增。图 1为引物 me2/em6在 27烟草材料中的
扩增图谱。根据数据分析采样原则对扩增条带进行统计,
图 1 引物组合 me2/em6的扩增结果
Fig. 1 Amplification results of me2/em6
1: Qingmaozi; 2: Huangmaozi 1; 3: Dajiancao; 4: Xiaosimaoyan; 5: Canglongmaoyan; 6: Renhebaimaoyan; 7: Hongfengmaoyan; 8: Huangximaoyan;
9: Miaozimaoyan; 10: Bantiepao; 11: Heiniupi; 12: Lingjieliuye; 13: Mianzhuliuye; 14: Pixianliuye; 15: Yibindaliuye; 16: Leshanxiaoliuye;
17: Heimanliu; 18: Meishanxiaoliuye; 19: Jinjiangliuye 4; 20: Sichuanliuye; 21: Leshanmaomaoye; 22: Shifangliuye; 23: CW3; 24: Suining 1;
25: Suining 2; 26: Xiaohuangyan; 27: Yunyan 85.
结果表明 25 对引物组合共扩增产生 3 368 条带, 多态性
条带为 998条, 每个引物组合的多态性条带数为 21~69条
不等, 平均每个引物组合产生 135 条带和 40 条多态性条
带, 平均多态检出率为 29.6%。引物组合中 me2/em5产生
的条带最多, 为 147条; 其中多态性条带数为 69, 多态率
为 46.9%。
25对引物组合中有 19个组合在黄花烟(No.26)的扩
增产物中有明显的特异性条带。个别引物组合能够特异识
别某一个晾晒烟材料 , 如图 2中第 5泳道显示 me3/em3
组合对苍龙毛烟(No.5) 扩增时产生的特异性条带可十分清
楚地将苍龙毛烟与其他普通烟草品种区分开, 可作为鉴别
苍龙毛烟的首选分子标记。此外第 26 泳道显示该引物组合
对黄花烟(No.26)的扩增产物也有明显的特异性条带。
2.2 供试材料的遗传关系
2.2.1 遗传相似系数分析 从表 3可见 27份材料的遗
传相似系数为0.26~0.97, 平均为 0.62。黄花烟品种阿坝
小黄烟 (Nicotiana rustia)与其他 26 种普通栽培烟草
(Nicotiana tabacum)遗传差异极其明显, 遗传相似系数在
0.26~0.51 之间。其中阿坝小黄烟与苍龙毛烟遗传相似系
数最低, 为 0.26; 与云烟85 的相似系数为 0.51。烤烟品
种云烟 85与 25份晾晒烟品种之间的遗传相似系数也较低,
在 0.66~0.78 之间; 其中与苍龙毛烟遗传相似系数最低,
为 0.66。说明参试的黄花烟、烤烟和晾晒烟品种之间存在
较大的遗传差异性。25份晾晒烟品种之间相似性较高, 遗
传相似系数在 0.75~0.97 之间, 平均为 0.86; 其中苍龙毛
烟与其他晾晒烟材料的遗传相似系数相对较低 , 在
176 作 物 学 报 第 35卷
图 2 引物组合 me3/em3的扩增结果
Fig. 2 Amplification results of me3/em3 combination
1: Qingmaozi; 2: Huangmaozi 1; 3: Dajiancao; 4: Xiaosimaoyan; 5: Canglongmaoyan; 6: Renhebaimaoyan; 7: Hongfengmaoyan; 8: Huangximaoyan;
9: Miaozimaoyan; 10: Bantiepao; 11: Heiniupi; 12: Lingjieliuye; 13: Mianzhuliuye; 14: Pixianliuye; 15: Yibindaliuye; 16: Leshanxiaoliuye;
17: Heimanliu; 18: Meishanxiaoliuye; 19: Jinjiangliuye 4; 20: Sichuanliuye; 21: Leshanmaomaoye; 22: Shifangliuye; 23: CW3; 24: Suining 1;
25: Suining 2; 26: Xiaohuangyan; 27: Yunyan 85. Arrows a and b show polymorphic bands.
0.75~0.84之间。上述结果表明 , 这些地方晾晒烟品种间
遗传相似有一定差异, 但总的遗传基础相对较狭窄。
2.2.2 聚类分析 聚类分析(图 3)表明, 黄花烟、烤烟
和晾晒烟 3个烟草栽培类型彼此间的遗传相似系数很低,
当遗传相似系数为 0.74时, 可将三者明显地区分开。黄
花烟与普通烟草遗传相似系数仅为 0.38, 说明在进化过
程中二者已经较早地形成了不同的分支。烤烟和地方晾晒
烟类群间的相似系数为0.72, 说明在栽培过程中经自然和
人工选择 , 两者遗传组成已产生了较大的差异 , 其亲缘
关系已变得渐远。晾晒烟材料间相似系数为 0.75~0.97,
图 3 基于 SRAP数据绘制的 27份供试材料的聚类图
Fig. 3 Dendrogram of 27 tobacco accessions based on SRAP makers
第 1期 龙 腾等: 四川部分晾晒烟种质遗传关系的 SRAP分析 177
根据其差异可将此类群进一步划分, 当遗传相似系数为
0.89时, 可分为以下类别, 第 I类包括 1、3、4、10、14、
15、16、22、23、24和 25号, 组内遗传相似系数在 0.92~0.97
之间; 第 II类包括 7、12、17、19、20、21号, 组内遗传
相似系数在 0.91~0.94之间; 第Ⅲ类包括 2、6、8、9、11、
18 号, 组内遗传相似系数在 0.90~0.95 之间; 另有 5 号和
13 号 2 个单一品种的个类, 与其他晾晒烟材料的平均相
似系数分别为 0.79 和 0.87。总体上晾晒烟品种间的亲缘
关系较近, 但苍龙毛烟(5号)在群体中亲缘关系较远。
3 讨论
3.1 SRAP分子标记在晾晒烟种质资源研究中的高效性
SRAP 利用特殊设计的引物扩增 ORFs 区域, 而 ORFs
区域是基因序列的重要组成部分, 是不同品种之间呈现
差别的重要因素。前人研究认为, SRAP 是评价遗传多样
性、品种鉴定和系统发生的有效方法, 在对育种目标性状
的评价方面有较高的多态性标记比率[20]。
本研究表明, SRAP 扩增效果良好, 产率中等, 条带
清晰 , 可以在烟草中产生的多态性丰富 , 平均多态检出
率为 29.6%。利用 SRAP分子标记求得 3个不同的烟草栽
培类型间的遗传相似系数为 0.26~0.97, 这与梁景霞等[12-15]
利用 ISSR 得到的研究结果基本一致。SRAP 不仅能明确
地区分黄花烟、普通烤烟与晾晒烟 3个不同的烟草栽培类
型, 而且在亲缘关系很近的晾晒烟栽培类型的品种之间
也有较好的分辨能力。个别引物组合针对个别品种的鉴别
能力尤其突出 , 甚至能够特异识别某一个栽培品种 , 如
me3/em3引物组合可作为鉴别苍龙毛烟的首选分子标记,
SRAP 引物是以前后引物随机组合的方式出现的, 合成少
量前后引物后即可获得大量的引物组合, 极大提高引物
的使用效率和降低了实验成本。
3.2 晾晒烟种质资源的亲缘关系
试验中选用的四川晾晒烟草的典型代表毛烟和柳烟
材料是当地烟农根据传统命名划分的两个类别。在晾晒烟
品种群体中取遗传相似系数为 0.89时, 划分出的 3个类群
组里都同时含有部分毛烟和部分柳烟品种; 全部毛烟品
种(如: 小丝毛烟、苍龙毛烟、仁河白毛烟、红峰毛烟、
黄溪毛烟、庙子毛烟等)或全部柳烟品种(如: 灵杰柳叶、
绵竹柳烟、郫县柳叶、宜宾大柳叶、乐山小柳叶、黑蛮柳、
眉山小柳叶等)均未被明显地聚为一个类群。这表明生产
中沿用的四川晾晒烟传统类别划分体系及相关品种的命
名可能未能充分反映种质材料在遗传物质上的差异。所以,
利用现代分子标记对四川晾晒烟种质材料进行分析是充
分认识和合理利用晒烟种质材料十分必要的基础工作。
供试的晾晒烟品种来自四川省内多个地方, 然而品
种间的亲缘关系相对较近、遗传基础较狭窄。在现有四川
晾晒烟种质材料中苍龙毛烟与其他材料间的遗传差异相
对较大, 在杂交育种中可作为亲本考虑。进行四川晾晒烟
品种改良还应考虑引入外源基因, 拓宽育种的遗传基础,
尤其是充分挖掘利用我国各地丰富的地方性晾晒烟种质
资源; 还可开展不同烟草类型间的杂交 , 例如与四川地
方晾晒烟品种同属于普通烟草亚属的烤烟不仅有许多优
良的品质性状且与晾晒烟之间存在较大的遗传差异, 也
可选作晾晒烟品种改良的亲本。
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