全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(2): 245255 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由河北省自然科学基金项目 (C2010001594), 国家自然科学基金项目 (31071456), 现代农业产业技术体系建设专项资金
(nycytx-19), 河北省重点基础研究项目(10960122D)和中国农业科学院油料作物研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(16
10172010001)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 廖伯寿, E-mail: lboshou@hotmail.com, Tel: 027-86812725
第一作者联系方式: E-mail: chsl99@163.com, Tel: 027-86812725
Received(收稿日期): 2011-05-26; Accepted(接受日期): 2011-09-13; Published online(网络出版日期): 2011-12-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20111201.0922.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00245
花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析
陈四龙 1,2 黄家权 1 雷 永 1 任小平 1 文奇根 1 陈玉宁 1 姜慧芳 1
晏立英 1 廖伯寿 1,*
1 中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学重点开放实验室, 湖北武汉 430062; 2 河北省农林科学院粮油作物研究
所 / 河北省作物遗传育种实验室, 河北石家庄 050031
摘 要: 溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂合成途径的一个关键酶, 在植物油脂品质改良和提高种子含油量方
面具有重要的应用价值。本研究通过构建花生种子全长 cDNA 文库, 结合大规模 EST 测序和功能注释, 从花生中克
隆了溶血磷脂酸酰基转移酶基因, 命名为 AhLPAT。该基因 cDNA全长 1 629 bp, 对应的基因组序列 5 531 bp, 由 11
个外显子和 10个内含子组成, 内含子剪接方式符合 GT-AG剪接规则。根据编码区预测 AhLPAT编码一条 387个氨基
酸组成的多肽, 预测分子量为 43.2 kD, 等电点为 9.42。AhLPAT 蛋白含有一个典型的酰基转移酶保守功能结构域以
及溶血磷脂酰基转移酶相似的保守区域。该蛋白的氨基酸序列与已报道的其他物种 LPAT蛋白序列有较高的一致性。
AhLPAT与旱金莲、油菜、海甘蓝、蓖麻和拟南芥的 LPAT蛋白氨基酸相似性依次为 90%、89%、89%、88%和 87%。
系统进化分析表明, AhLPAT 与拟南芥 AtLPAT2 亲缘关系较近, 且同属于内质网型 LPAT 蛋白。RT-PCR 分析表明,
AhLPAT基因在花生根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达, 在花生开花后 50~60 d, 果针和种子中的表达量最高, 且
AhLPAT的表达量与花生种子含油量积累速率变化一致, 二者显著相关(r=0.63, P<0.05)。推测 AhLPAT基因在花生种
子油脂合成中起重要作用。
关键词: 花生; 溶血磷脂酸酰基转移酶; 基因克隆; 表达分析; 油脂合成
Cloning and Expression Analysis of Lysophosphatidic Acid Acyltransferase
(LPAT) Encoding Gene in Peanut
CHEN Si-Long1,2, HUANG Jia-Quan1, LEI Yong1, REN Xiao-Ping1, WEN Qi-Gen1, CHEN Yu-Ning1, JIANG
Hui-Fang1, YAN Li-Ying1, and LIAO Bo-Shou1,*
1 Key Laboratory of Oil Crop Biology of the Ministry of Agriculture / Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Wuhan 430062, China; 2 Institute of Food and Oil Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Laboratory of Crop Genetics and
Breeding of Hebei Province, Shijiazhuang 050031, China
Abstract: Lysophosphatidic acid acyltransferase (LPAT) is a key enzyme in biosynthesis pathway of vegetable oil in plant. It is
important for oil crops to improve oil quality and increase seed oil content through genetic engineering. We constructed a
full-length cDNA library of peanut (Arachis hypogaea) seed via a large number of sequences of expressed sequence tag (EST) and
gene functional annotation, a lysophosphatidic acid acyltransferase gene, designated AhLPAT, and its genomic DNA sequence
were isolated from peanut. The sequence of AhLPAT cDNA was 1 629 bp, and its genomic sequence was 5 331 bp. Bioinformatic
analysis showed that AhLPAT was composed of 11 exons and 10 introns with typical GT-AG characteristic in comparison of its
sequences of genomic DNA and cDNA by Splign in NCBI. A peptide of 387 amino acid residues with protein molecular weight of
43.2 kD and isoelectric point (pI) of 9.42 were deduced from AhLPAT. Conserved domains prediction indicated that AhLPAT
comprised a typical conserved acyltransferase domain and a conserved lysophospholipid acyltransferases domain. The deduced
amino acid had a high identity with the LPAT proteins reported from other species. Amino acid similarities of LPAT protein be-
246 作 物 学 报 第 38卷

tween peanut and Tropaeolum majus, Brassica napus, Crambe hispanica subsp. abyssinica, Ricinus communis, and Arabidopsis
thaliana were 90%, 89%, 89%, 88%, and 87%, respectively. A phylogenetic tree was constructed by the Neighbor-Joining method
using MEGA5.0. The phylogenetic tree suggested that AhLPAT and AtLPAT2 derived from Arabidopsis thaliana were grouped
into the same class. Both AhLPAT and AtLPAT2 were endoplasmic reticulum type LPATs. The tissue specific expression analysis
by using quantitative RT-PCR assays indicated that AhLPAT was ubiquitously expressed in root, stem, leaf, flower, gynophore,
seed of peanut with the highest level in gynophore and seed. The expression level reached a peak in the stage from 50 to 60 days
after flowering. The expression level of AhLPAT kept consistent with the rate of oil accumulation, indicating a significant correla-
tion between AhLPAT expression level and oil content (r=0.63, P<0.05). These results suggest that AhLPAT plays an important
role in peanut triacylglycerol synthesis.
Keywords: Peanut; Lysophosphatidic acid acyltransferase; Gene cloning; Expression analysis; Triacylglycerol synthesis
植物油主要来源于植物种子中储存的油脂, 三
酰甘油(triacylglycerol, TAG)是其作为能量和碳源的
贮藏形式。质体中从头合成的各种脂肪酸在酰基-
CoA 合成酶的作用下合成脂酰-CoA, 并从质体转运
到内质网或胞质当中[1]。之后, 通过 Kennedy途径将
游离的脂肪酸和甘油组装成 TAG。Kennedy 途径所
需的酶分别为甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT, EC
2.3.1.15)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT, EC 2.3.1.51)
和二酰甘油酰基转移酶(DGAT, EC 2.3.1.20)[2]。TAG
生物合成发生在内质网膜上[3], 因此以上 3 种酶也定
位于内质网上。其中, LPAT是 TAG组装过程的一个
关键酶, 它催化酰基链从脂酰-CoA转移至溶血磷脂
酸(LPA)的 sn-2位, 产生的磷脂酸(PA)既可继续进行
脱磷酸反应合成 TAG, 也可以进入磷脂合成途径,
进而参与形成生物膜结构[4]。所以, LPAT 具有极其
重要的生理功能。目前, LPAT 的同源基因已在拟南
芥(Arabidopsis thaliana)[5]、油菜(Brassica napus)[6]、
椰子(Cocos nucifera)[7]、玉米(Zea mays)[8]、旱金莲
(Tropaeolum majus)[9]等植物中被分离克隆出来。在
拟南芥中至少发现了 9个类型的 LPAT基因[10], 虽然
其基本功能相似, 但作用的底物、表达特性以及亚
细胞定位[11]等存在极大的差异[1,5,12]。研究表明, 在
植物中, LPAT 对不同的酰基-CoA 具有特异的选择
作用[13], 它在 sn-2 位上优先转移的底物是不饱和酰
基链[14], 所以 TAG 的不饱和脂肪酸通常位于 sn-2
位。可见, LPAT对利用基因工程改良种子脂肪酸成
分, 尤其是降低饱和脂肪酸比例具有重要的研究价
值。近年来研究发现, LPAT催化的溶血磷脂酸(LPA)
到磷脂酸(PA)的 TAG 组装过程[15]是 TAG 生物合成
的一个潜在限速步骤 [ 2 ] , 其活性的提高可以减轻
TAG 合成过程中的反馈抑制作用, 过表达 LPAT 基
因可以显著提高种子的含油量。在拟南芥和油菜中
过表达酵母的 LPAT 基因突变型(SLC1-1), 在增加
TAG sn-2 位上长链脂肪酸比例和含量的同时, 使种
子含油量提高了 8%~48%[16]。在拟南芥种子中特异
过表达油菜的 2 种微粒体 LPAT 基因(BAT1.13 和
BAT1.5), 转基因后代种子重量和脂肪酸含量分别比
对照平均增加 6%和 13%[2]。所以, LPAT日益成为改
善油脂脂肪酸组成和提高含油量研究的热点。
花生的含油量居大宗油料作物前列, 我国花生
总产 50%以上用于榨油。因此, 提高花生种子含油
量和改善其油脂品质已成为花生品质育种的首要目
标。但是, 由于花生基因组庞大而复杂[17], 其分子基
础研究处于起步阶段, 花生 LPAT的序列特征及表达
模式一直未见报道。本研究从花生种子中分离克隆
了 LPAT基因, 并对其进行了基本的生物信息学分析
和表达特性研究, 研究结果可有助于进一步理解花
生脂肪酸、油脂代谢机制, 为充分利用和改造 LPAT
基因调控花生等油料作物油脂合成奠定基础, 对花
生品质改良具有重要的理论价值和现实意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
用于目的基因筛选的花生种子全长 cDNA 文库
由本实验室构建。基因克隆和表达分析所用花生材
料 06-4104, 为中国农业科学院油料作物研究所经
多年选育的高含油量花生品系。花生材料种植于国
家种质武昌野生花生圃内, 田间常规管理。花生生
长期间, 分别采集根、茎、叶、花、果针和种子。
花生开花下针后, 采集其开花后 15、20、25、30、
40、50、60、70、80和 90 d的种子, 取其部分自然
风干 , 并将其他材料立即放入液氮于–80℃冰箱保
存备用。感受态大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α购
自 TransGen公司。
1.2 花生种子含油量测定
将风干恒重的花生种子剥壳 , 采用 Minispec
mq-20 核磁共振仪(NMR)测定含油量。每个时期的
籽仁分成 3份, 即测定 3个重复, 取平均值。
1.3 试验试剂
克隆载体 pMD19-T Simple Vector、Premix Ex
第２期 陈四龙等: 花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析 247


Taq PCR 酶和质粒少量提取试剂盒均购自 TaKaRa
公司 ; 凝胶回收试剂盒购自 OMEGA 公司 ; DNA
Marker购自 TransGen公司; Trizol植物总 RNA提取
试剂盒购自 Invitrogen 公司; 花生种子总 RNA 提取
试剂盒 RNeasy Plant Mini Kit 购自 QIAGEN 公司;
RNA 反转录试剂盒、荧光定量 PCR SYBR Green
Realtime PCR Master Mix购自 TOYOBO。实验所需
引物由 Invitrogen公司合成; 由华大基因公司测序。
其他常规试剂均为国产分析纯。
1.4 DNA与总 RNA提取
采用 CTAB 法从幼嫩叶片中提取花生基因组
DNA。采用 RNeasy Plant Mini Kit提取不同发育阶
段花生种子的总 RNA, 使用 Trizol 方法提取其他组
织总 RNA, 具体方法参照 Trizol试剂盒说明书。
1.5 AhLPAT基因全长序列的克隆
以 M13 通用引物(M13F 和 M13R)对筛选到的
AhLPAT 全长 cDNA 进行克隆和双向测序 , 通过
DNAMAN 软件拼接序列 , 得到一致序列后提交
NCBI ORF finder预测ORF, 并经BLASTX同源比对
验证。将 AhLPAT 的 cDNA 序列与拟南芥同源序列
AT3G57650 进行基因结构比对, 参考内含子剪接位
置, 在 cDNA 的保守区域设计 6 对基因特异引物
F1~F6和 R1~R6 (表 1), 分段扩增 AhLPAT的内含子
区。以基因组 DNA为模板, 以琼脂糖凝胶分离纯化
回收 PCR扩增产物, 克隆到 pMD19-T Simple Vector
载体上, 然后转化感受态大肠杆菌 DH5α。经菌落培
养和蓝白斑筛选随机挑取 8个克隆进行 PCR阳性验
证, 将阳性单克隆送华大基因公司测序。PCR 程序
为 94℃预变性 3 min; 94 30 s; 55 1 min; ℃ ℃ 72 2 ℃
min 30 s, 共 32个循环; 72 10 min; ℃ 结束反应。
1.6 序列生物信息学分析
用NCBI (http://ncbi.nlm.ncih.gov/)中的BLAST、
ORF及ExPASY (http://expasy.org/tools/)中的Compute
pI/Mw tool等软件进行生物信息学分析; 通过 NCBI
Splign[18]完成 cDNA序列与基因组 DNA比对, 分析
剪接位点供位、受位与识别序列等信息; 通过 NCBI
CDD[19]数据库(Conserved Domain Databases), 进行
保守结构域的分析; 采用 GSDS (http://gsds.cbi.pku.
edu.cn/index.php)进行基因结构作图。用 ProtParam
(http://expasy.org/tools/protparam.html)进行氨基酸基
本理化性质分析 ; 利用 Predictprotein (http://www.
predictprotein.org/)和 SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/
services/SignalP/)分别预测跨膜区、功能位点和信号
肽; 蛋白质的疏水性由 ProtScale tool (http://expasy.
org/tools/pscale/Hphob.Woods.html)预测; 利用 PSORT
(http://psort.hgc.jp/form.html)工具进行蛋白质的亚细
胞定位预测。以 AhLPAT作为查询母序列, 在 NCBI
的 GenBank数据库中搜索与该基因同源的其他物种
的氨基酸序列, 通过 ClustalX2软件进行氨基酸序列
比对, 采用 MEGA5.0 软件的 Neighbor-Joining 算法
构建系统进化树, 用 Bootstrap检验, 并重复 1 000次。
1.7 实时荧光定量 PCR检测目的基因表达特征
利用 Trizol法提取样品总 RNA。采用 ReverTra
Ace-α-试剂盒(TOYOBO)合成 cDNA第一条链。根据
目标基因的 cDNA序列设计实时荧光定量 PCR特异
引物 LPAT-qF和 LPAT-qR (表 1)。扩增目的片段长度
为 276 bp。20 μL反应体系含 SYBR Green Realtime
PCR Master mix 10 μL, LPAT-qF和LPAT-qR各 0.4 μL,
cDNA模板 5 μL, 去离子水 4.2 μL。扩增条件为 95℃
5 min; 95 15 s, 60 20 s, 72 20 s℃ ℃ ℃ (收集荧光信

表 1 AhLPAT基因克隆与表达所用引物
Table 1 Sequences of primers for AhLPAT isolation and expression
正向引物 Forward primer 反向引物 Reverse primer
名称 Name 序列 Sequence (5→3) 名称 Name 序列 Sequence (5→3)
F1 AACCCTACCACGCAACACTC R1 CCATCCAACAAGCCAATCA
F2 TGAAACGTTCCAATTGATGG R2 AGTACTGCCAAGGCAACCTG
F3 GGTTGCCTTGGCAGTACTTT R3 CTTGGCCCAGCTTCTCTCTA
F4 TCATTGGTTGGTCAATGTGG R4 GCTTCATCTGTTTCTGGCAAT
F5 GGTGCAAGTTCACATCAAGC R5 TCTTCCACTTGTTCCCCTGT
F6 GTTACGGGAGCCGTCAAGT R6 TGGGATAGATAGAACCTACAGAGG
LPAT-qF TGCAGCCTCTGCTGGATTGCCT LPAT-qR TCCTTGGCAACAAACACATCTCGAC
Ubiquitin-F AAGCCGAAGAAGATCAAGCAC Ubiquitin-R GGTTAGCCATGAAGGTTCCAG
M13F TGTAAAACGACGGCCAGT M13R CAGGAAACAGCTATGACC

248 作 物 学 报 第 38卷

号), 40个循环; 72 5 min℃ 。以花生 Ubiquitin作为内
参基因[20], 设计扩增引物Ubiquitin-F和Ubiquitin- R
(表 1)。每个样品重复 3次, 利用 BIO-RAD IQ5.0实
时荧光定量 PCR仪检测目标基因的表达模式。
通过内参基因归一化得到目标基因的变化趋
势。采用 2–ΔΔCt法[21]分析目标基因的表达, 条件是目
标基因和内参基因的扩增效率都接近 100%, 且互相
间效率偏差在 5%之内。目标基因的相对表达量=2–ΔΔCt,
其中 ΔΔCt = [(待测样品目的基因的 ΔCt – 待测样品
内参基因的 ΔCt) – (对照组目的基因的 ΔCt – 对照
组内参基因的 ΔCt)]。该方法使用的实验结果由 PCR
仪自带的软件自动导出。采用 SAS 9.0软件进行目标
基因表达量与种子含油量相关分析及显著性检验。
2 结果与分析
2.1 花生 LPAT cDNA全长序列克隆
通过构建花生种子全长 cDNA 文库, 并经大规
模的 EST 测序和序列拼接, 获得 21 999 条 EST 序
列。将得到的Cluster和Contig与NCBI、SWISSPROT
等数据库中的序列大规模比对, 进而得到初步的功
能注释。其中的 1个 Contig群含有 3条花生 EST序
列 , 功能注释显示这些序列与拟南芥、蓖麻等的
LPAT 基因序列有较高的同源性, 经 ORF 预测并结
合 NCBI 的 BLASTP 比对分析表明, 在这 3 条序列
中有 1 个 EST 包含完整的开放阅读框, 该序列全长
为 1 753 bp, 包含 1个 1 164 bp的开放阅读框, 编码
387个氨基酸残基(图 1), 5端非翻译区长 204 bp, 起
始密码子 ATG位于序列的 205 bp处, 3端非翻译区
长 388 bp。
将获得的 cDNA 序列与已公开的其他物种基因
序列在 NCBI BLASTN 同源比对, 发现该基因与旱
金莲(Tropaeolum majus, FJ984563)的 TmLPAT2基因
和梅花(Prunus dulcis, AF213937) LPAT基因同源性
最高, 一致性达到 79%和 80%, 与蓖麻(Ricinus com-
munis, XM002526684)、向日葵(Helianthus annuus, EF
563991)、油菜(Brassica napus, GU045435)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana, NM115625)的 LPAT基因序列
一致性分别为 77%、75%、74%和 75%。从核酸水
平的同源性分析来看 , 该基因是花生中克隆到的
LPAT 全长 cDNA, 其与拟南芥 AtLPAT2 垂直同源,
被命名为 AhLPAT。
2.2 AhLPAT基因结构与剪接特征分析
根据 cDNA 测序结果设计了 6 对扩增基因组全
长序列的基因特异引物, 从花生基因组DNA中分段
扩增目的区段。这些序列之间含有 50 bp以上的重叠
序列, 通过 PCR扩增、克隆和测序, 拼接后得到了花
生 LPAT 的基因组序列。AhLPAT的基因组序列全长
为 5 331 bp, 起始密码子 ATG至终止密码子 TAG长



图 1 AhLPAT核酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence and putative amino acids of AhLPAT
框中的部分为酰基转移酶结构域; 灰色背景部分为溶血磷脂酰基转移酶结构域; 下画线部分为跨膜螺旋区;
斜黑体部分为预测的酰基供体结合区。
Boxes indicate conserved acyltransferase domain; Gray background indicate conserved lysophospholipid acyltransferases domain; underlined
letters indicate predicted hydrophobic transmembrane helices; Bold and italic letters indicate putative substrate-binding pocket.

第２期 陈四龙等: 花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析 249


4 156 bp。利用 NCBI Splign分析确定该基因的内含
子和外显子的组织结构, 发现 AhLPAT 的基因结构
包括 11个外显子和 10个内含子(图 2), 其内含子 5
剪接位点(受体)具有 A(T/C/G)G//GT的保守序列, 3
剪接位点(供体)含有 C(T)AG//G(A/T)的保守序列 ,
即花生 AhLPAT 基因外显子和内含子剪接位点剪接
方式符合经典的 GT-AG规律(表 2)。
参考 NCBI 中拟南芥、水稻、杨树和蓖麻的序
列信息, 构建了不同物种的 LPAT 基因结构分布图
(图 2), 可以看出, 不同物种间的 LPAT 基因内含子
长度存在较大差异, 但是基因结构、内含子剪接方
式(相位)等均基本一致, 反映出不同物种在 mRNA
剪接方式上的保守性较高。
2.3 AhLPAT基因推导的氨基酸序列分析
利用 ProtParam分析显示, AhLPAT的理论分子
量为 43.2 kD, 理论等电点为 9.42, 平均亲水系数
(grand average of hydropathicity, GRAVY)是 0.209。
通过蛋白质亚细胞定位 PSORT 工具预测, AhLPAT
蛋白定位于细胞质(可信度为 94.1), 其羧基末端具
有内质网定位信号 NVKQ, 预测概率为 55.6%, 不
包含明显的核定位信号 , 因此该蛋白应为胞质蛋
白。此预测结果表明分离得到的花生 LPAT 定位于
细胞的内质网上, 属于内质网结合型 LPAT蛋白。
SignalP 信号肽分析工具中的神经网络算法(NN)
和隐马可夫模型(HMM)联合分析 AhLPAT 的结果显
示 , 该蛋白位于分泌路径上 , 存在信号肽 , 概率为
0.998, 最可能的剪切位点于第 22 位丙氨酸(A22)与
第 23 位缬氨酸(V23)之间, 最大概率为 0.773, 表明
这段信号肽序列在蛋白转运并锚定到内质网后, 上
游 22个氨基酸即被剪切掉。
利用 Predictprotein对氨基酸序列的跨膜结构域
分析, 表明AhLPAT蛋白共有5个明显的跨膜区域, 是



图 2 不同物种来源的 LPAT基因结构
Fig. 2 Structures of five putative LPAT genes encoding LPAT protein from different species
AhLPAT: 来自花生; AtLPAT2: 来自拟南芥; OsLPAT: 来自水稻; PtLPAT: 来自杨树; RcLPAT: 来自蓖麻; 白色方框代表外显子; 细线代
表内含子; 灰色粗实线代表 3、5非编码区; 0, 1代表内含子相位。
AhLPAT: LPAT of Arachis hypogaea; AtLPAT2: LPAT of Arabidopsis thaliana; OsLPAT: LPAT of Oryza sativa; PtLPAT: LPAT of Populus
trichocarpa; RcLPAT: LPAT of Ricinus communis. The white-boxes indicate exon; the lines indicate intron; the lines in gray indicate untrans-
lated region; 0 and 1 indicate intron phases.

表 2 AhLPAT基因内含子/外显子的剪接位点分析
Table 2 Analysis of splicing sites at intron/exon of AhLPAT
外显子序号
Order of
exon
外显子长度
Length of
exon (bp)
内含子序号
Order of
intron
内含子长度
Length of
intron (bp)
内含子类型
Type of
intron
5端接合处
Donor
3端接合处
Acceptor
插入氨基酸的位置
Location inserted in
amino acid sequence
1 871 1 367 0 TTCAG//GT．．T CAG．．//GCAG Q26-A27
2 123 2 109 0 TTAAG//GT．．A TAG．．//ATTGA K67-I68
3 40 3 135 1 GATGG//GT．．G CAG．．//GTAAA M80
4 74 4 256 0 CTCAG//GT．．G CAG．．//CGCTC Q105-R106
5 60 5 361 0 TGCCG//GT．．A CAG．．//GTCAT P125-V126
6 78 6 208 0 TAAAG//GT．．A CAG．．//TCAGG K151-S152
7 159 7 535 0 CTAAG//GT．．G CAG．．//GGATT K204-G205
8 126 8 783 0 CAGTG//GT．．A TAG．．//GTGCA V246-V247
9 93 9 115 0 CCAAG//GT．．G CAG．．//GATGC K277-D278
10 87 10 123 0 TTCTG//GT．．A CAG．．//GTAAC A306-V307
11 628

250 作 物 学 报 第 38卷

完整的或膜结合的蛋白质。其中 2个(310~330和 335~
352)在羧基末端, 另外 3个(10~32、47~64和 121~138)
位于氨基末端。2 个末端跨膜结构域之间有 171 个
氨基酸残基的间隔区域。二级结构预测表明其拥有
10 个 α-螺旋, 7 个 β-折叠, 分别占整个多肽链的
50.39%和 11.63%, 环状结构占 37.98%。
利用 ProtScale 对 AhLPAT 的疏水性预测发现,
蛋白氨基酸链第 6 位上的丙氨酸(A6)疏水性最强,
分值为 2.656; 分值最低的是第 301个氨基酸残基精
氨酸(R301), 为–2.533。该蛋白的疏水区域多于亲水
区域, 表现为明显的疏水性(图 3)。因此, 可推断该
蛋白是一种疏水性蛋白, 同时说明该蛋白符合跨膜
蛋白的特征。



图 3 AhLPAT蛋白疏水性预测
Fig. 3 Hydrophobicity analysis of protein encoded by AhLPAT
实线以上(纵轴正值)为疏水区; 虚线以上(横线部分)为预测的跨
膜区域; 采用 Kyte-Doolittle算法预测氨基酸疏水值, 参数
Window size设置为 9。
Residues above the horizontal solid lines (positive numbers on the
vertical scale) indicate hydrophobic regions, whereas those above
the horizontal dotted lines indicate transmembrane regions. And the
five predicted transmembrane regions are indicated by bars. The
hydrophobicity profile is obtained by using the Kyte-Doolittle
algorithm of sliding window average over nine neighboring residues.

对 AhLPAT 基因编码的推导氨基酸序列进行功
能位点分析, 经 Prosit同源检索, 发现多个蛋白功能
位点(motif)(图 1)。其中包括 1个 cAMP与 cGMP依
赖性蛋白激酶磷酸化位点 KKSS位于 119~122区域;
5个蛋白激酶 C磷酸化位点 SSK、TLK、SDK、SWK、
SER分别位于 121~123、150~152、292~294、332~334
和 359~361位点; 5个酪蛋白激酶磷酸化位点TDHE、
SDID、TFSD、SQSE和 STGE分别位于 73~76、94~97、
290~293、357~360和 374~377位置; 6个 N-肉豆蔻
酰化位点 GIAAAA、GLAVNL、GCLGST、GTRFTQ、
GLIVTG和 GIAIST分别位于 2~7、20~25、109~114、
170~175、314~319和 335~340位点。这些基序均是
与 LPAT酶的作用底物结合和催化的保守域。
根据 NCBI 保守结构域预测, 发现在 AhLPAT
蛋白中存在一个典型的酰基转移酶功能结构域
(pfam01553, E-value 3.52E–11), 分布于 A86~I195之
间。还包含与溶血磷脂酰基转移酶相似的保守区域
(cd07990, E-value 1.18E–66), 分布于 D62~K253 之
间。另外, 在紧接酰基转移酶功能区域上游还预测
到 1个酰基底物结合区, 分布于 I45~L60 (图 1), 该
区域与 LPAT 对底物的选择性有一定关系。综合分
析表明, 推导的 AhLPAT 蛋白含有酰基转移酶的功
能区段, 其作用与花生油脂代谢过程相关。
2.4 AhLPAT蛋白序列的同源比对
将 AhLPAT用 NCBI BLASTP与其他植物 LPAT
氨基酸序列同源比对(图 4)结果表明 , 其与拟南芥
(NP567052)、甘蓝型油菜(ADC97478)、海甘蓝(ABN
09946)、梅花(BAE48660)、蓖麻(XP002526730)和旱
金莲(ACV73676)的一致性/相似性依次为 79%/88%、
79%/89%、78%/89%、80%/88%、76%/87%和 81%/
90%。不同物种间 LPAT氨基酸序列的高度相似性说
明该蛋白在生物生命活动中执行着不可替代的重要
功能。不同物种间 LPAT 氨基酸序列差异主要在羧
基末端, 而AhLPAT的 12~373氨基酸区段与AtLPA-
T2 及其他植物的 LPAT 高度同源。在该保守区域内
含有酰基转移酶保守氨基酸序列, 如图 4 中框 I~IV
所示, I为 MBOAT基序(NH(X4)D)：NHRSDID, 位
于 N91~D97 位置 ; II 为 LPVIGW 基序 ; III 为
WLALFVEGT基序, IV为 NVLIPRTKGF基序。已有
的研究发现, I 中 NH(X4)D 残基的 H92、D97 和 III
中 E172-G173-T174 是酰基转移酶催化活性的重要
功能位点, 而且 EGT区还含有酰基转移酶作用底物
溶血磷脂酸的结合位点。
通过 AhLPAT 与已公开发表的其他物种 LPAT
蛋白进化关系分析(图 5), 序列聚类结果表明, AhLPAT
与大豆推导的 LPAT 蛋白(ACU18782)和蓖麻 LPAT
(XP002526730)聚于同一个小的进化分支, 且与拟南
芥的 AtLPAT2 进化关系也较近。参与比对的 23 个
物种在进化距离 50处可以分成 4个大类群: 第 I 类
为内质网型 LPAT, 此类包括花生 AhLPAT以及拟南
芥 AtLPAT2等; 第 II类为内膜型 LPAT, 包括拟南芥
AtLPAT4、AtLPAT5, 以及来自水稻基因组中的推导
OsLPAT; 第 III 类为质体型 LPAT, 包括典型的拟南
芥 AtLPAT1, 及油菜 BnLPAT1; 第 IV类为种子特异
型 LPAT, 如椰子 CnLPAT 等, 另外酵母和大肠杆菌
的 PLSC (即1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶)也聚在
此进化分支内。
第２期 陈四龙等: 花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析 251




图 4 LPAT氨基酸序列的多重比对
Fig. 4 Multiple sequence alignment of LPAT amino acid sequences
AtLPAT2: 拟南芥(NP567052); AhLPAT: 花生; BnLPAT: 甘蓝型油菜(ADC97478); ChLPAT: 海甘蓝(ABN09946); PmLPAT: 梅花
(BAE48660); RcLPAT: 蓖麻(XP002526730); TmLPAT2: 旱金莲(ACV73676)。1~4依次为 cAMP与 cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,
蛋白激酶 C磷酸化位点, 酪蛋白激酶磷酸化位点, N-肉豆蔻酰化位点; I~IV框依次为酰基转移酶的保守区域。序列比对图中, 完全相
同、基本相同与不同的氨基酸残基分别用黑色、灰色和白色背景表示。横线代表为优化比对结果而引入的空位。
AtLPAT2: Arabidopsis thaliana (NP567052); AhLPAT: Arachis hypogasa; BnLPAT: Brassica napus (ADC97478); ChLPAT: Crambe his-
panica subsp. abyssinica (ABN09946); PmLPAT: Prunus mume (BAE48660); RcLPAT: Ricinus communis (XP002526730); TmLPAT2:
Tropaeolum majus (ACV73676). Regions 1–4 represent a cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, a protein kinase
C phosphorylation site, a casein kinase II phosphorylation site, and an N-myristyation site, respectively. Boxes I–IV represent motifs con-
served in related acyltransferases in various species. In the alignment of seven predicted amino acid sequences with ClustalX2 program,
residues identical to those in AhLPAT in some of the other six LPATs are lightly shaded, and those identical in all seven LPATs are heavily
shaded, and non-similar residues are denoted by white background. Dashes represent spaces introduced to optimize the alignment.

2.5 AhLPAT组织表达特异性
图 6 表明, AhLPAT 在花生各器官中均有表达,
表明该基因与 Kennedy 途径相关, 而其编码的氨基
酸序列与拟南芥微粒体 AtLPAT2氨基酸序列具有高
度的同源性也得以证实。但是, AhLPAT表达量在不
同器官中具有一定差异, AhLPAT在果针、种子中表
达量最高, 在根中表达量中等, 而在茎、叶、花中表
达量最低, 说明该基因具有一定的组织器官特异性,
同时反映出该基因与花生种子贮藏物质的合成与代
谢有一定关系。
种子发育初期, AhLPAT 的表达量较低, 在开花
后 50~60 d 的种子中其表达丰度达到最大值, 而后
随着种子进入成熟阶段, AhLPAT的表达又逐渐减弱,
即呈现单峰变化。利用核磁共振技术(NMR)测定相
应发育阶段的种子含油量(图 7)发现, 在种子整个发
育过程中, 其种子含油量逐渐增加, 油分积累速率
呈现出慢-快-慢的变化趋势。在开花后 40~50 d, 种
子含油量增加速率达到最快, 此时 AhLPAT 的表达
量也达到最大, 即在花生种子油分快速积累的关键
期, AhLPAT在种子中的表达丰度与含油量的增加同
步, 推测 AhLPAT基因参与花生种子油脂合成过程。
另外, 通过 AhLPAT 表达量与同期种子含油量的增
加值的相关分析得出, 二者的 Pearson相关系数 r为
0.63, 经检验达到显著水平(P=0.0398<0.05)。
3 讨论
LPAT 是植物油脂合成过程中酰基转移酶家族
成员之一。从亚细胞定位来看, LPAT可以分为质体

252 作 物 学 报 第 38卷



图 5 LPAT的系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree of LPAT
AtLPAT1~5: 拟南芥 LPAT1~5; AhLPAT: 花生 LPAT; BnLPAT: 甘蓝型油菜 LPAT; CnLPAT: 椰子 LPAT; EcPLSC: 大肠杆菌 PLSC;
GmLPAT: 大豆 LPAT; LaLPAT2、LdLPAT1: 草地泡沫 LPAT2和 LPAT1; OsLPAT和 OsPLS1: 水稻 LPAT和 PLS1; PdLPAT: 杏 LPAT;
RcLPAT: 蓖麻 LPAT; ScPLSC: 酿酒酵母 PLSC; TmLPAT2: 旱金莲 LPAT; ZmLPAT: 玉米 LPAT。I为内质网型 LPAT; II为内膜型 LPAT;
III为质体型 LPAT; IV为种子特异型 LPAT。进化树分支上的数字表示 Bootstrap验证中该分支可信度的百分比。PLS即 1-酰基-甘油-3-
磷酸酰基转移酶。
AtLPAT15: LPAT of Arabidopsis thaliana; AhLPAT: LPAT of Arachis hypogaea; BnLPAT: LPAT of Brassica napus; CnLPAT: LPAT of
Cocos nucifera; EcPLSC: PLSC of Escherichia coli; GmLPAT: LPAT of Glycine max; LaLPAT2: LPAT of Limnanthes alba; LdLPAT1: LPAT
of Limnanthes douglasii; OsLPAT, OsPLS1: LPAT or PLS1 of Oryza sativa japonica Group; PdLPAT: LPAT of Prunus dulcis; RcLPAT: LPAT
of Ricinus communis; ScPLSC: PLSC of Saccharomyces cerevisiae; TmLPAT2: LPAT of Tropaeolum majus; ZmLPAT: LPAT of Zea mays.
group I indicates endoplasmic reticulum LPATs; group II indicates endomembrane LPATs; group III indicates plasmid LPATs; group IV
indicates seed-specific LPATs. The number in each node represents bootstrap support value, which is percentage of homology among LPAT
verified by bootstrap. PLS indicates 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase, also known as LPAT.

内膜结合型和内质网胞质结合型。从油菜和拟南芥
中分离的质体型 LPAT 对 16:0-CoA 的活性高于对
18:1-CoA, 即具有原核类型 LPAT 酶的特征[6,22], 拟南
芥中仅含有一类编码质体型 LPAT的基因(AtLPAT1)。
胞质结合型 LPAT 对 18:1-CoA 的偏好性较强, 是典
型的真核类型 LPAT 特征[1], 以拟南芥的 AtLPAT2
为代表, 它是目前拟南芥中发现的与油脂合成相关
的真核途径的 LPAT。一些植物的胞质结合型 LPAT
基因已经从成熟种子或其他组织中分离出来[23]。本
研究通过构建花生种子的 cDNA 文库, 筛选出花生
的一个 LPAT基因, 经预测其推导的蛋白质序列包含
跨膜区域, 且定位于内质网上, 表明该蛋白属于胞
质结合型 LPAT。结合 AhLPAT蛋白信号肽分析, 推
测该蛋白在细胞质基质中合成后, 经过蛋白质转运,
锚定于细胞内质网膜上行使催化功能, 这与预测的
AhLPAT 是跨膜蛋白的结论相一致。而且从氨基酸
序列同源性分析, AhLPAT与拟南芥 AtLPAT2编码的
定位于内质网上的组成型表达的 AtLPAT2 蛋白[5]处
第２期 陈四龙等: 花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析 253




图 6 AhLPAT在不同器官中的表达模式
Fig. 6 Expression level of AhLPAT in differnt tissues in peanut
R: 根; St: 茎; L: 叶片; F: 花; G: 果针; Se: 种子。
R: root; St: stem; L: leaf; F: flower; G: gynophore; Se: seed.



图 7 AhLPAT在花生不同发育阶段种子中的表达模式
Fig. 7 Expression of AhLPAT during peanut seed development

于同一进化分支上 , 氨基酸序列相似性高达 88%,
表明两者具有相似的功能。氨基酸保守结构域预测
发现, 在 AhLPAT 中存在一个典型的酰基转移酶功
能结构域(pfam01553), 还包含有溶血磷脂酰基转移酶
相似的保守区域(cd07990)。前人鉴定的酰基转移酶
催化活性位点及结合位点 , 如 MBOAT 基序 (NH
(X4)D)和“EGT”Box等在 AhLPAT中均保守存在[9,24]。
已有的研究发现, NH(X4)D基序中的 H92和 D97以
及“EGT”Box基序中的 E172、G173和 T174是酰基
转移酶催化活性的重要功能位点 [25], 而且“EGT”
Box 还含有酰基转移酶作用底物溶血磷脂酸的结合
位点[24]。结合 AhLPAT 一级结构推导的氨基酸残基
跨膜模型可以看出, MBOAT基序和“EGT” Box被第
3 个跨膜螺旋(S121~L138)分隔开来, 分别位于内质
网膜的两侧, 而这 2 个功能位点要彼此协同作用将
溶血磷脂酸与脂酰-CoA酯化成磷脂酸, 其作用机理
现在仍不清楚。该蛋白拓扑结构与人类的 LPAT 相
类似[26]。
目前, 拟南芥中公开报道的编码 LPAT 的基因
至少有9个[10], 花生属异源四倍体(AABB, 2n=40)植物,
基因组大小与玉米相当, 是拟南芥的 22.4倍[27-28], 从
花生中直接克隆基因的难度较大, 而对于呈数量性
状遗传的种子含油量相关基因的克隆难度更大。目
前, 我们通过构建种子 cDNA 全长文库, 结合序列
注释和比对, 已获得 2 个 LPAT 基因同源的 Contig,
另一个在 5端不完整, 需要通过 RACE 方法进一步
克隆基因全长。鉴于在其他物种中 LPAT基因家族的
多样性 , 因此不排除在花生中还存在其他类型的
LPAT家族成员。
本研究发现 AhLPAT 在花生各个组织器官中普
遍表达 , 与已经报道的拟南芥 AtLPAT2[5]和油菜
BAT1.13基因(编码微粒体 LPAT)[2]的表达模式一致。
另外, 在油料植物种子中的 sn-2 位上还含有另外一
些特殊的脂酰-CoA类型, 说明这些植物中还含有对
特殊酰基-CoA具有活性的种子特异性 LPAT [29-30]。
同时 AhLPAT 在不同组织器官中的表达水平存在明
显差异, 即在果针和种子中表达量最高, 而在根中
表达量次之, 在茎、叶、花中的表达水平最低。推
测其与参与种子中储藏物质——油脂等的合成有很
大关系。本研究中观察的花生种子油分积累模式和
积累进程与我们前期研究结果一致[31]。在种子不同
发育时期, AhLPAT的表达丰度与种子含油量的增加
呈显著相关关系(r=0.63, P<0.05), 表明该基因参与
了种子中油脂的合成过程。然而, Maisonneuve 等[2]
利用种子特异性启动子在拟南芥中过表达油菜的微
粒体 LPAT基因, 结果表明转基因后代种子总脂肪酸
含量与 LPAT 基因的表达水平相关性很低(R2=0.16),
指出可能是基因表达影响油脂合成的阈值很低造成
的, 而且 mRNA 转录后加工也对种子的代谢造成一
定影响。随后, 通过种子特异启动子将相同的 LPAT
基因在种子中反义表达后发现, 种子总脂肪酸含量
大幅下降, 最终证明 LPAT基因的表达与转基因种子
油脂含量之间存在显著的相关性。当然, 种子油脂
合成代谢是一个复杂的过程 , 有众多基因参与 [32],
在种子油脂快速积累期会伴有其他大量相关基因的
高水平表达[33-34]。
本研究通过氨基酸序列分析发现, 在 AhLPAT
的溶血磷脂酰基转移酶保守功能域上游(I45~L60)存
在一个酰基底物结合区 , 已有研究表明该区域与
LPAT对底物选择的特异性有一定关系[35]。在植物中,
LPAT 对不同脂酰-CoA 的特异性是控制脂肪酸成分
的重要调控机制, 植物种子的 LPAT 存在多种不同
的脂肪酸特异性已被多方证实[36]。但是, 花生种子
中的 AhLPAT 脂肪酸偏好性, 及其影响油脂积累和
254 作 物 学 报 第 38卷

实现对脂肪酸成分的调节机制还仍未研究。因此 ,
采用分子生物学策略进一步阐明上述问题成为本研
究需进一步深入研究的重点。
4 结论
从花生中分离克隆了种子油脂合成的关键酶基
因 AhLPAT, 它与拟南芥 AtLPAT2 的性质相近, 同属
于内质网结合型 LPAT蛋白。AhLPAT具有组成型表
达特性, 但在果针和种子中表达水平最高, 并且其
表达量与花生种子油分积累密切相关, 在种子油脂
快速积累时期其表达水平同步增加 , 暗示 AhLPAT
参与了花生种子油脂合成过程, 可以作为培育高含
油量花生材料的候选基因。
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