全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1290−1293 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 中国博士后科学基金项目(20060390773); 河南省教育厅自然科学基金项目(2006210007)
作者简介: 康国章(1971–), 男, 从事作物分子生理研究; 王永华(1973–), 男, 从事作物生理研究。**共同第一作者。
*
通讯作者(Corresponding author): 郭天财(1953–), 博士生导师, 从事作物生理研究。E-mail: gmzx-guo@371.net
Received(收稿日期): 2007-10-22; Accepted(接受日期): 2008-01-24.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01290
小麦 AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析
康国章** 王永华** 刘 超 沈丙权 郭天财* 朱云集
(河南农业大学国家小麦工程技术研究中心 , 河南郑州 450002)
摘 要: 从大粒型小麦品种豫教 2 号中克隆出调控小麦 ADPG 焦磷酸化酶(AGPase)胞质型大亚基基因(LSU I)cDNA
全长。在花后 15 d的小麦植株中, 通过半定量 PCR法, 发现 LSU I基因在叶、籽粒、叶鞘和颖壳中表达量较高, 但
在根和茎中表达量较低, 表明在绿色光合功能器官和淀粉合成器官中, LSU I基因量表达较高。比较了 LSU I基因在
千粒重不同的豫教 2号和兰考矮早八两小麦品种籽粒发育过程中的表达差异后, 发现在籽粒形成期, LSU I基因在两
品种籽粒内表达相似, 但在籽粒灌浆期和成熟期间, LSU I基因在千粒重较高的豫教 2号内表达量明显高于千粒重较
低的兰考矮早八, 这个表达差异与两品种间淀粉积累差异趋势相似, 表明 LSU I 基因的表达量可能与淀粉的积累量
密切相关。
关键词: 小麦; AGPase胞质型大亚基; 基因克隆; RT-PCR; 基因表达
Cloning and Expression of AGPase Cytoplasmic Large Subunit Gene in
Common Wheat
KANG Guo-Zhang**, WANG Yong-Hua**, LIU Chao, SHEN Bing-Quan, GUO Tian-Cai*, and ZHU Yun-Ji
(Engineering Research Center for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China)
Abstract: The 1941-bp full cDNA sequence (GenBank No. DQ839506) of LSU I, the cytoplasmic large subunit gene I of
adenosine 5 diphosphate glucose pyrophosphorylase (AGPase), was cloned from a high 1000-grain weight wheat (Triticum
aestivum L.) cultivar Yujiao 2. Semi-quantitive PCR analysis showed that LSU I expressed higher in leaves, glumes, sheaths,
and grain than in roots and stems, indicating that LSU I expressed actively in photosynthetic and starch synthesis-related
organs. During the primal period of grain development (5–10 d after thesis), there was no difference in transcript levels of
LSU I gene between Yujiao 2 and Lankao Aizao 8 (low 1000-grain weight), but the transcript amounts in grains of Yujiao 2
was markedly higher than that of Lankao Aizao 8 at grain filling and maturity stages. The changes of LSU I gene expression
were similar to the trend of starch accumulation in the two cultivars, suggesting that LSU I gene may be associated with
starch accumulation in common wheat.
Keywords: Triticum aestivum L.; Cytoplasmic large subsuit gene I of AGPase; Gene cloning; RT-PCR; Gene expression
小麦的产量由单位面积穗数、穗粒数和千粒重三要
素构成。近年来, 随着育种和生产水平的提高, 一大批高
产与超高产小麦品种不断出现。但一些品种, 尤其是大粒
型品种因受遗传及植株生育后期环境因素(“干热风”等)
的影响, 籽粒的充实度较低, 产量下降, 品质变劣。淀粉
占小麦籽粒库容重的 70%~80%, 是其充实度与千粒重的
决定因素, 因此提高籽粒的充实度应从提高籽粒内淀粉
的合成积累入手[1-2]。
AGPase 是淀粉合成关键酶[3], 分为胞质型(I)与质体
型(II)两种, 均是由成对的 2 个大亚基和 2 个小亚基构成
的异源四聚体。大亚基可能是 AGPase 活性的调节中心,
而小亚基可能是催化中心[4]。玉米质体型大亚基(LSU II)
突变体(Sh2)籽粒内 AGPase 活性下降 90%~95%, 淀粉含
量降低 75%左右[5] , 表明 LSU II亚基在 AGPase活性中起
重要作用。Smidansky等[6]把玉米 LSU II基因转入小麦后,
使 LSU II基因高表达, 发育中的籽粒 AGPase活性明显上
第 7期 康国章等: 小麦 AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析 1291


升, 单株粒重平均增加 38%, 整株生物产量也显著提高。
Sakulsinghavoj 等[7]把具有高活性的大肠杆菌 AGPase 基
因的大亚基(经序列比较为 LSU II)导入水稻, 发现当外源
LSU II基因在胞质中表达时, 转基因水稻内 AGPase活性
上升 13倍, 粒重增加 11%, 产量显著提高。
目前, 对胞质型大亚基(LSU I)在作物籽粒淀粉合成
过程中的调控作用尚未见报道。本研究从小麦籽粒中克隆
LSU I全长(GenBank登录号: DQ839506), 并比较了它在
小麦植株不同部位及籽粒发育不同时期的表达状况, 旨
在分析该基因在调控小麦籽粒淀粉合成中的作用, 并为
下一步通过转基因提高小麦籽粒淀粉积累量与千粒重奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
选用千粒重不同及淀粉含量差异较大的两个大粒型
小麦品种豫教 2 号(千粒重较大)和兰考矮早八(千粒重较
小), 2006—2007 年生长季种植于河南农业大学科教示范
园区。试验地状况及管理同文献[8]。2006 年 10 月 15 日
播种, 两品种开花期均为 2007年 4月 22日, 2007年 5月
29日收获。
1.2 LSU I的克隆
在豫教 2号灌浆中期(花后 20 d左右), 取 0.5 g幼嫩
籽粒置液氮中, 研磨至粉末状, 用Trizol(Sigma公司)提取
总 RNA。参照 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(MBI公
司)操作步骤合成 cDNA。
根据 GenBank 中 LSU I 基因的核苷酸序列(Z21969
和 X67151)设计 1对引物, Sense primers为 5′-CTTCCCTG
CATTTGATTGA-3′; Antisense primers 为 5′-CTCGCTGC
CACTTCTTTAC-3′, 由北京奥科生物技术有限公司合成。
PCR扩增体系含 10× PCR缓冲液 3 μL、10 mmol L−1
dNTP 0.6 μL、10 μmol L−1引物各 1 μL、2 U mL−1 Taq DNA
聚合酶 0.5 μL、cDNA模板 1 μL、无菌双蒸水 21.9 μL。
PCR扩增程序为 95℃变性 5 min; 95℃ 50 s, 56℃ 1 min,
72℃ 2.5 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min。
将获得的 LSU I 全长经 T4(MBI 公司 )连接酶与
pMD20-T(大连宝生物公司)连接后, 转化大肠杆菌 DH5α
(湖南农业大学作物基因工程省重点实验室提供), 经菌落
PCR和质粒酶切鉴定为阳性的单克隆进行测序。
将上述阳性克隆送至上海英骏生物技术有限公司进
行测序。测序结果在 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/blast/) 上进行同源性比较分析。
1.3 LSU I的表达分析
取花后 15 d左右豫教 2号植株, 分别提取其根、茎、
叶、叶鞘、颖壳和籽粒的 RNA, 合成 cDNA, 并对 LSU I
进行扩增。通过半定量 PCR 法, 对此基因在植株不同部
位的表达进行分析。
在初花期, 挂牌标记两品种同一天开花的植株, 花
后每 5 d取标记的穗样, 提取其发育籽粒中的 RNA, 采用
半定量 PCR 法, 比较两品种间 LSU I 的表达差异。用β
-Actin作对照基因(AB181991), 其扩增引物 Sense primers
为 5′-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3′; Antisense
primers 为 5′-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3′,
扩增片段长度为 422 bp左右。
1.4 籽粒淀粉含量与蛋白质含量的测定
按 1.3节中测定 LSU I在籽粒发育不同时期的取样方
法。取样后剥下标记穗样上的籽粒, 于 105℃烘箱中杀青
10 min, 80℃烘干后待测。采用双波长法测定直链、支链
和总淀粉含量[9]。直链淀粉含量测定主波长为 620 nm, 参
比波长为 430 nm, 支链淀粉含量测定主波长为 540 nm,
参比波长为 720 nm, 总淀粉含量为直链淀粉与支链淀粉
含量之和。采用半微量凯氏定氮法[10] 测定蛋白质含量。
2 结果与分析
2.1 LSU I的克隆与序列分析
以特异引物对豫教 2 号进行扩增, 得到 2.0 kb 左右的
DNA片段(图 1)。此片段的大小与预计扩增的 LSU I大小相
近, 对此片段亚克隆后进行测序。测序结果表明(图 2), 小麦
LSU I cDNA全长为 1 941 bp (GenBank登录号: DQ839506)。
序列比较结果显示, 该 cDNA序列与小麦的 Z21969有 99%
同源性, 与大麦的X67151有 94%同源性, 与大麦的X67151
有 94%同源性, 与玉米的 AY104549有 84%同源性, 与水稻
的 AK100910有 83%的同源性, 表明克隆出了小麦 LSU I基
因的 cDNA序列(表 1)。与同源性最高的 Z21969相比, 编码
域内有 2个碱基的不同(图 4), 即 848 bp处的 C(Z21969 为
T) 和 923 bp处的 A(Z21969为 G), 但不影响其编码的氨基
酸(图 2)(同源性比较略)。

图 1 豫教 2号籽粒 LSU I基因 cDNA全长扩增的电泳结果
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of LSU I gene from grains of
common wheat cultivar Yujiao 2
Lane 1: LSU I gene; M: DL2000.

2.2 LSU I在小麦植株不同部位的表达
图 3显示, 花后 15 d LSU I的表达量在叶、籽粒和叶
鞘中较高, 在颖壳中次之, 在根和茎中较低。
1292 作 物 学 报 第 34卷


图 2 克隆的小麦胞质型大亚基基因 LSU I(DQ839506)的核苷酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence of cloned wheat LSU I (DQ839506) from grains of Yujiao 2 cultivar
起始编码子和终止编码子, 以下画线标出, 与 Z21969序列比对有差异碱基以阴影表示。
Start and stop codons are underlined. The different bases between LSU I and Z21969 are emphasized with shadows.

表 1 LSU I (DQ830506)和其他基因的同源性比较
Table 1 Homologous comparison between cDNAs encoding LSU I (DQ839506) from common wheat and genes from other crops
Gene name Accession number Identity (%)
Triticum aestivum AGP-L gene Z21969 99
H. vulgare ADP-glucose pyrophosphorylase X67151 94
Zea mays PCO103001 mRNA sequence AY104549 84
Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA clone: J023132J11 AK100910 83


图 3 LSU I在小麦植株不同部位的表达
Fig. 3 Transcripts of LSU I gene in different organs of wheat
plants

2.3 LSU I基因在籽粒不同发育阶段的表达分析
图 4表明, LSU I基因在两品种籽粒不同发育阶段的
表达总趋势相似。在花后 5 d表达量较弱, 10 d达到高峰,
之后开始下降。籽粒内 LSU I基因的表达, 在花后 5~10 d
的籽粒形成期 , 两品种无明显差异; 但在灌浆期和成熟
期间(花后 15~35 d), 豫教 2号下降较慢, 一直维持在较高
水平; 而兰考矮早八下降较快, 前者明显高于后者。

图 4 豫教 2号和兰考矮早八花后籽粒内 LSU I基因的表达
Fig.4 Transcripts of LSU I gene in grains of Yujiao 2 and Lankao
Aizao 8 after anthesis

兰考矮早八的千粒重为 43.60 g, 豫教 2号为 57.02 g, 豫
教 2 号比兰考矮早八高 30.78%, 表明两品种间籽粒的内
容物积累量有较大的差异(表 2)。小麦籽粒内容物主要由
淀粉和蛋白质组成 , 其中淀粉约占干重的 65%~80%,
蛋白质约占干重的 10%~20%[1]。两品种间蛋白质含量无显著

表 2 兰考矮早八和豫教 2号千粒重、蛋白质和总淀粉含量的差异
Table 2 Differences of 1000-grain weight and contents of protein and starch between Lankao Aizao 8 and Yujiao 2
品种
Cultivar
千粒重
1000-grain weight (g)
蛋白质含量
Protein content (%)
总淀粉含量
Starch content (%)
豫教 2号 Yujiao 2 57.02±0.46 a 12.56±0.11 a 67.07±3.36 a
兰考矮早八 Lankao Aizao 8 43.60±0.38 b 13.32±0.13 a 56.61±2.18 b
表中数据为 4次重复的平均值±标准差。数据不同字母表示品种间达显著差异。
Data in the table are mean±SD of four replicates. Values followed by a different letter are significantly different at P＜0.05.
第 7期 康国章等: 小麦 AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析 1293



图 5 兰考矮早八和豫教 2号花后籽粒内总淀粉的积累量
Fig. 5 Starch accumulation in grains of Lankao Aizao 8 and Yu-
jiao 2 after anthesis

差异, 籽粒内容物含量的差异主要来自于总淀粉含量。花
后籽粒淀粉的积累与 LSU I 的表达相似, 在花后 5~10 d
的籽粒形成期 , 两品种无明显差异 , 但在随后的籽粒灌
浆期和成熟期, 豫教 2 号明显高于兰考矮早八(图 5), 表
明两品种籽粒发育中后期淀粉积累量的差异导致其最终
籽粒内容物含量的不同。
3 讨论
在小麦、水稻等禾本科植物的胚乳中, AGPase 主要
为胞质型, 其催化生成 ADP 葡萄糖的反应大多在胞质中
发生。因此与质体型大亚基(LSU II)相比, 研究胞质型大
亚基(LSU I) 意义更重要, 而目前有关作物淀粉合成关键
酶—AGPase的基因工程研究主要集中在 LSU II上[6-7,11]。
本文克隆了小麦 LSU I的 cDNA全长, 为通过转 LSU I基
因来提高小麦籽粒内淀粉的积累奠定了基础。
淀粉的合成积累主要在光合作用器官(淀粉暂时性
贮藏器官)和籽粒(淀粉永久性贮藏器官)中进行[12]。LSU I
在叶片、叶鞘、颖壳等光合作用较强的器官和淀粉积累器
官—籽粒中表达量较高, 而在含光合能力较低的茎和根
部表达较低(图 3), 表明 LSU I 可能在淀粉合成与积累中
起重要作用。在籽粒形成期, LSU I在豫教 2号和兰考矮
早八两品种籽粒内的表达无明显差异, 但在淀粉合成积
累的关键时期—灌浆期与成熟期, 在千粒重较高的豫教 2
号籽粒内表达量明显高于兰考矮早八(图 4, 图 5)。LSU I
在两品种间的表达差异与两品种间淀粉积累的差异相似,
这更进一步表明, LSU I在淀粉合成中发挥着重要作用。
本研究克隆了小麦 LSU I基因 cDNA全长, 下一步的工作
是利用该 cDNA序列, 构建过表达载体, 并把它转到淀粉
含量与千粒重较低的小麦品种中, 以提高灌浆期间 LSU I
的表达, 提高 AGPase活性及增加灌浆期间籽粒淀粉积累
量, 为通过基因工程提高小麦产量开辟一个新途径。
References
[1] Nakamura Y. Towards a better understanding of the metabolic system
for amylopectin biosynthesis in plants: Rice endosperm as a model
tissue. Plant Cell Physiol, 2002, 43: 718−725
[2] Hu T-J(胡廷积). Wheat Ecosystem and Techniques in Production (小
麦生态与生产技术). Zhengzhou: Henan Sci & Tech Press, 1986. pp
140−149
[3] Linebarger C R L, Boehlein S K, Sewell A K, Shaw J, Hannah C.
Heat stability of maize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase is
enhanced by insertion of a cysteine in the N terminus of the small
subunit. Plant Physiol, 2005, 139: 1625−1634
[4] Johnson P E, Patron N J, Bottrill A R, Dinges G R, Fahy B F, Parker
M L, Waite D N, Denyer K. A low-starch barley mutant, Risaφ16,
lacking the cytosolic small subunit of ADP-glucose pyrophosphory-
lase, reveals the importance of the cytosolic isoform and the identity
of the plastidial small subunit. Plant Physiol, 2003, 131: 684−696
[5] Giroux M J, Hamnah L C. ADP-Glc pyrophosphorylase in shrunken-2
and brittle-2 mutant of maize. Mol Gen Genet, 1994, 243: 400−408
[6] Smidansky E D, Clancy M, Meyer F D, Lanning S P, Blake N K,
Talbert L E, Giroux M J. Enhanced ADP-glucose pyropyosphorylase
activity in wheat endosperm increases seed yield. Proc Natl Acad Sci
USA, 2002, 99: 1724−1729
[7] Sakulsinghavoj C, Choi S B, Hwang S K, Edwards G E, Bork J,
Meyer C R, Preiss J, Okita T W. Engineering starch biosynthesis for
increasing rice seed weight: The role of the cytoplasmic ADP-glucose
pyrophosphorylase. Plant Sci, 2004, 167: 1323−1333
[8] Ma D-Y(马冬云), Guo T-C(郭天财), Zha F-N(查菲娜), Wang
C-Y(王晨阳), Zhu Y-J(朱云集), Wang Y-H(王永华). Effects of
planting density on activities of nitrogen metabolism enzymes in flag
leaves and grain protein content in winter wheat with two spike types.
Acta Agron Sin (作物学报), 2007, 33(3): 514−517 (in Chinese with
English abstract)
[9] He Z-F(何照范). Analysis Technique for Grain Quality of Ce-
reals and Oils (粮油籽粒品质及其分析技术). Beijing: Agri-
culture Press, 1985. pp 290−294 (in Chinese)
[10] Nanjing Agricultural University(南京农业大学). Analysis of Soil and
Agricultural Chemistry, 2nd edn (土壤农化分析, 第 2版). Beijing:
Agriculture Press, 1986. pp 213−216 (in Chinese)
[11] Smidansky E D, Martin J M, Hannah L C, Fischer A M, Giroux
M J. Seed yield and plant biomass increases in rice are con-
ferred by deregulation of endosperm ADP-glucose pyrophos-
phorylase. Planta, 2003, 216: 656−664
[12] Grennan A K. Regulation of starch metabolism in Arabidopsis
leaves. Plant Physiol, 2006, 142: 1343−1345