全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(9): 1631−1639 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目 (30900986, 31071802), 重庆市自然科学基金项目 (2009BB1298), 教育部博士点基金项目
(200806350006), 西南大学博士基金项目(SWUB2008042)和中央高校基本科研业务费专项(XDJK2010B010, XDJK2009C126)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 高启国, E-mail: gaoqg2004031@163.com; 王小佳, E-mail: wxj@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: jingyiwei85@yahoo.com.cn, Tel: 023-68250974
Received(收稿日期): 2012-01-19; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-07-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120703.0858.201209.0_022.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01631
甘蓝 eSRK重组体的构建及其与 SCR的相互作用
韦静宜 高启国* 任雪松 王小佳* 李成琼 宋 明
西南大学园艺园林学院 / 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400715
摘 要: SRK与 SCR是甘蓝自交不亲和雌雄性决定因子, 两者间相互作具有单倍型特异性。为了探讨 HVI/II区域在
SRK单倍型特异性及其与 SCR互作中的作用, 采用重组技术构建甘蓝不同单倍型 eSRK (SRKE与 SRKF)间的重组体
eSRKE-1、eSRKE-2和 eSRKE-3, 用酵母双杂交系统 3 检测各 eSRK 重组体与 SCR 之间的相互作用。结果表明: SCRE
能与 eSRKE作用, 而不能与 eSRKF作用, 说明 eSRKE、eSRKF属于不同单倍型; SCRE与重组体 eSRKE-1、eSRKE-2、
eSRKE-3均不发生作用, HVI 和 HVII 区域内差异的氨基酸位点共同参与了与 SCR 的作用; SCRF不能与 eSRKE-1、
eSRKE-2、eSRKE-3作用, 替换 HVI/II区域后并不能改变 SRK的单倍型。
关键词: 自交不亲性; SRK; SCR; 酵母双杂交
Construction of eSRK Chimeras and Interaction between eSRK Chimeras and
SCRs from Brassica oleracea L.
WEI Jing-Yi, GAO Qi-Guo*, REN Xue-Song, WANG Xiao-Jia*, LI Cheng-Qiong, and SONG Ming
College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University / Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous
Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715, China
Abstract: Self-incompatibility in Brassica is mediated by allele-specific interactions between stigma-expressed S-locus receptor
kinase (SRK) and pollen coat-localized S-locus cysteinerich (SCR) ligands encoded by the S-locus haplotype. To identify amino
acid fragments within the SRK extracellular domain (eSRK) that are required for ligand-selective activation, we constructed chi-
meric eSRK between two S-locus haplotypes in Brassica oleracea, and identified the interaction between eSRK chimeras and
SCRs by yeast two-hybrid system. The results showed that SRKE (not chimera) could interact with SCRE, and SRKF could interact
with SCRF. All of eSRK chimeras could not interact with SCRs. The hypervariable regions, HVI and HVII, were essential for
specificity in the SRK-SCR interaction. However, eSRK chimeras could not interact with SCRF, although they contained hyper-
variable regions come from eSRKF, which should be related with the overall sequence or 3D conformation of the segments deter-
mining SI specificity.
Keywords: Self-incompatibility; SRK; SCR; Yeast two-hybrid system
自交不亲和性(self-incompatibility, SI)在芸薹属
植物中(如甘蓝)普遍存在, 是预防近亲繁殖和促进
远系杂交、保持遗传多样性的一种重要机制[1]。这
一机制受 S-locus 编码的高度多态性的 S-位点受体
激酶(S-locus receptor kinase, SRK)及其配体之间特
异性识别和相互作用所控制。只有当相同单倍型的
花粉配体 S-位点半胱氨酸富集蛋白(S-locus cysteine
rich, SCR)[2-5]和柱头 SRK 发生特异性识别后, 定位
于花粉壁的 SCR才会与 SRK胞外域(eSRK)[6]相结合,
引起 SRK构象的变化, 使其释放原本结合在 SRK激
酶域的类硫氧还蛋白(thioredoxin-like protein, THL1/
THL2)[7], 激活 SRK。SRK 连同质膜上的 M-位点蛋
白激酶(M-locus protein kinase)发生自动磷酸化[8-9],
随后 SRK 与臂重复蛋白 1 (arm repeat protein 1,
ARC1)作用并使其磷酸化。ARC1具有 E3泛素连接
酶活性[10-12], 它促进了 SI反应中 EXO70A1的降解,
1632 作 物 学 报 第 38卷

从而抑制“亲和”物质的分泌, 最终导致自花花粉萌
发受阻[13]。异花花粉落到柱头上后, 不同单倍型的
SCR与 SRK不相互作用, 不能引发上述信号传导过
程, 花粉能够正常萌发, 植株呈现亲和[14]。因此, 在
分子水平上深入研究 SCR 与 SRK 识别及作用机制,
对于自交不亲和性的研究和利用有重要的意义。
为了探索决定 SRK 单倍型特异性的氨基酸序
列及 SRK受配体特异性激活的基础, 众多学者将研
究集中在 eSRK 的多态氨基酸序列上, 即在进化过
程中长期保持着极高多态性的区域[15-20]。目前, 在
芸薹属植物和拟南芥中发现的 SRK 序列均超过了
50多条 , 在比对这些 SRK的氨基酸序列后发现 ,
SRK序列在芸薹属中存在 35%的差异[21], 而在拟南
芥中则高达 51% [20]。Kus 等[22]依据不同单倍型间
SRK氨基酸序列的保守性, 从 SRK胞外域氨基酸序
列划分出 3个高变区(HVI、HVII和 HVIII), 虽然那
些呈现出高度多态性的氨基酸广泛分布在整个 SRK
序列中, 但在这几个高变区上尤为普遍[21,23]。在这
几个高变区中 , 非同源 /同源替换率比值(Ka/Ks)明
显大于 1 [24], 且相对高于其他蛋白[25]。与此同时, 这
些高变区还包含许多具较高后验概率的氨基酸残基,
使植物体在选择压的作用下发生物理性状上的改
变[26]。这些特征表明, 这些区域的超变性是在多样
性选择下获得的, 而处在这个区域的可变氨基酸残
基很可能是决定 SRK 特异性的主要因素。Miege
等[27]也提出 HVI和 HVII区域上差异氨基酸残基是
SCR结合位点的猜想。
为分析 HVI和 HVII区域氨基酸在决定 SRK单
倍型及其与 SCR相互作用的功能, 我们已获取甘蓝
E、F 材料中的 eSRK 和 SCR 序列, 经 Blast 比对证
明 E 为 S28单倍型、F 为 S7单倍型。本文利用重组
PCR 技术, 分别用 eSRKF中 HVI 和 HVII 区域替换
eSRKE中对应的区域, 构建了 3个 eSRK重组体, 然
后用酵母双杂交系统检测各个 eSRK与 SCRE、SCRF
之间的作用, 分析 HVI和 HVII区域替换后对 eSRK
与 SCR 相互作用的影响, 以期为深入研究 SRK 与
SCR单倍型特异性识别及作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝材料 E、F 为西南大学十字花科蔬菜研究
所保存的高代自交系。开花前 1~2 d 分别采集柱头
和花药, 用于提取总 RNA。RNA提取试剂盒、大肠
杆菌(Escherichia coli) T1感受态、反转录试剂盒、
Taq DNA聚合酶、dNTP、等购自 TransGen公司。
DNA重组所用 T4 DNA连接酶、EcoR I和 BamH I
限制性内切酶等购自 Fermentas 公司。DNA 胶回收
试剂盒及质粒提取试剂盒购自 OMIGA 公司。酵母
双杂交系统 (matchmaker GAL4 two-hybrid system
3)、X-α-gal、3-AT以及酵母培养相关培养基等购自
Clontech公司。由上海英骏公司合成引物及测序。
1.2 SCR和 SRK基因的克隆与 eSRK重组体的构
建
依据我们已获得 SRK和 SCR序列, 设计引物扩
增 eSRK 和 SCR 成熟肽编码序列, 用于酵母表达质
粒的构建。表 1中下画单线为 EcoR I和 BamH I位
点, 下画双线为终止密码子; 参照 Meige 等[27]划分
的 HVI和 HVII区域包含的氨基酸, 通过 Blast比对
分析 eSRKE与 eSRKF上 HVI 和 HVII 对应核苷酸序
列, 设计引物, 用于构建 eSRK重组体(表 1)。
依据表 2 中的模板并引物 PCR 扩增 eSRKE、
eSRKF、SCRE、SCRF 和构建 eSRK 重组体, 其中将
eSRKE的 HVI 区域替换成 eSRKF的 HVI 后命名为
eSRKE-1; 将 eSRKE的 HVII替换成 eSRKF的 HVII后
命名为 eSRKE-2; 将 eSRKE的 HVI、HVII同时替换成
eSRKF的 HVI、HVII后命名为 eSRKE-3。PCR产物经
1%琼脂糖电泳, 回收目的条带与 pEasy Blunt simple
载体连接, 转化大肠杆菌 T1, 经菌落 PCR鉴定后挑
取阳性克隆送上海英骏生物公司测序。用 Vector
NTI Advance 11.0分析核苷酸序列和氨基酸序列。
1.3 酵母双杂交表达质粒的构建
经 EcoR I/BamH I 双酶切后, 将 SCRE与 SCRF
片段亚克隆至 pGBKT7载体, 转化 E. coli T1感受态
细胞 , 涂于 LB 平板 (含 Kan+抗性 ); 将 eSRKE、
eSRKE-1、eSRKE-2、SRKE-3 与 eSRKF 片段亚克隆至
pGADT7载体, 转化 E. coli T1感受态细胞, 涂于 LB
平板(含 Amp+抗性)。37℃培养过夜, 筛选阳性重组
子, 并进行菌液 PCR 和酶切鉴定, 将含有插入目的
片段的阳性克隆送上海英骏公司测序。
1.4 酵母双杂交表达质粒的自激活检测
根据酵母双杂交系统使用说明书(Matchmaker
GAL4 Yeast Two-Hybrid System 3 User Manual), 利
用 LiAc法制备感受态酵母菌 AH109。用 PEG/LiAc
法分别将 pGBKT7-SCRE、pGBKT7-SCRF、pGADT7-
eSRKE 、 pGADT7-eSRKE-1 、 pGADT7-eSRKE-2 、
pGADT7-eSRKE-3与 pGADT7-eSRKF转化 AH109酵
母感受态细胞 , 30℃培养 3~5 d, 分别观察其在
第 9期 韦静宜等: 甘蓝 eSRK重组体的构建及其与 SCR的相互作用 1633


SD/–Trp、SD/–Trp/X-α-gal和 SD/–Leu、SD/–Leu/X-α-
gal 筛选平板上的生长情况。同时设立 pGBKT7-
Lam×pGADT7-T (阴性对照 )组和 pGBKT7-p53×
pGADT7-T (阳性对照)组。

表 1 引物及序列
Table 1 Primers and sequences
引物
Primer
序列
Sequence
eSRKS 5-GAATTCTCGTCTACAGAATCTCTTACAATC-3
eSRKAS 5-GGATCCCTTAAGCAGCCAGTCTGACATAAAG-3
SCRFS 5-GAATTCAATCTGATGAAGCAGTGCAAC-3
SCRFAS 5-GGATCCCTAAATTACCGTATACCAGATGTTCA-3
SCRES 5-GAATTCTGCATCTGTAGCGAATCGTTTG-3
SCREAS 5-GGATCCCGGACACCCTAGCAAATGTTTCG-3
HV1-1 5-GCATTAGATAAAACTCAGGAAGCCTTCTCGAACCTTCAAGCTTGTACGAGTAATC-3
HV1-2 5-TTCCTGAGTTTTATCTAATGCAAGGCGACGTTCGAGAGCACCGGAGCGGTCCATG-3
HV2-1 5-CAAATACCCTTCGGAACTTAATTTCAATCTCGAGTAGAAGCTGT-3
HV2-2 5-ACAGCTTCTACTCGAGATTGAAATTAAGTTCCGAAGGGTATTTG-3
HV2-3 5-GTAAGCGTAAGGCCCACACATCCTGTACATATCGCACTG-3
HV2-4 5-CAGTGCGATATGTACAGGATGTGTGGGCCTTACGCTTAC-3
下画单线为 EcoR I和 BamH I位点, 下画双线为终止密码子。
Uppercase letters with single underline are restriction endonuclease EcoR I and BamH I respectively, uppercase letters with double
underline are termination codon.

表 2 eSRK重组体构建流程
Table 2 Protocol for eSRK chimera construction
1st PCR 2nd PCR 3rd PCR 重组体
Chimeric
eSRK
模板
Template
引物
Primer
模板
Template
引物
Primer
模板
Template
引物
Primer
eSRKE cDNAE eSRKS/eSRKAS
eSRKF cDNAF eSRKS/eSRKAS
SCRE cDNAE SCRES/SCREAS
SCRF cDNAF SCRFS/SCRFAS
eSRKE-1 eSRKE eSRKS/HV1-1
eSRKE HV1-2/eSRKAS Mixture of 1st PCR eSRKS/eSRKAS
eSRKE-2 eSRKE eSRKS/HV2-1
eSRKF HV2-2/HV2-3 Mixture of 1st PCR eSRKS/HV2-3
eSRKE HV2-4/eSRKAS Mixture of 2nd PCR eSRKS/eSRKAS
eSRKE-3 eSRKE-2 eSRKS/HV1-1
eSRKE-2 HV1-2/eSRKAS Mixture of 1st PCR eSRKS/eSRKAS

1.5 SCR与各 eSRK间相互作用的检测
根据酵母双杂交系统使用说明书, 利用 LiAc法
制备感受态酵母菌 AH109。用 PEG/LiAc 法将各个
质 粒 组 合 (pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE 、
pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE-1、pGBKT7-SCRE×
pGADT7-eSRKE-2、pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE-3、
pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKF 、 pGBKT7-SCRF×
pGADT7-eSRKE、pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE-1、
pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE-2 、 pGBKT7-SCRF×
pGADT7-eSRKE-3和 pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKF)
共转化 AH109感受态细胞, 同时设立 pGBKT7-Lam
×pGADT7-T (阴性对照)组和 pGBKT7-p53×pGADT7-
T (阳性对照)组, 然后涂布于 SD/–His–Trp–Leu平板
上, 30℃培养 3~5 d; 经菌落 PCR鉴定后, 为辅助菌
落复苏, 挑取 SD/–His–Trp–Leu 平板上的阳性克隆
悬浮于 2 μL的 0.5×YPDA培养基中, 用移液枪混匀
后, 取 1 μL悬浮液滴在 SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-
gal/25 mmol L–1 3-AT平板上, 30℃培养 3~5 d后观察
1634 作 物 学 报 第 38卷

其生长及显色情况。
2 结果与分析
2.1 SCR和 SRK基因的克隆与 eSRK重组体的构建
测序结果显示我们扩增的 eSRKE 和 eSRKF 均为
1 207 bp, 均编码 397个氨基酸, 推导的 eSRKE氨基酸
序列与 Bo SRK28 (GenBank登录号为 AB190355.1)对
应氨基酸序列完全一致, 包含了 SRK28第 26至 422位
氨基酸 ; eSRKF 与 Bo SRK7 (GenBank 登录号为
AB180898.1)对应序列完全一致, 包含了SRK7第25至
421位氨基酸。Blast比对表明 eSRKE、eSRKF均包含
了 12个保守的半胱氨酸、HVI和 HVII区域、完整的
B-lectin domain、S-locus glycop domain、PAN-APPLE
domain。依据Meige等[27]划分的 HVI和 HVII区域设
计中间引物, 通过重组 PCR 构建 eSRK 重组体, 测序
后推导的氨基酸序列 eSRKE-1为 398个氨基酸、
eSRKE-2为 396个氨基酸、eSRKE-3为 397个氨基酸, 序
列比对结果见图1, eSRKE-1中HVI成功被eSRKF中HVI
区域替代, eSRKE-2中 HVII成功被 eSRKF中 HVII区域
替代, eSRKE-1中 HVI和 HVII成功被 eSRKF中 HVI和
HVII区域替代, 表明 eSRK重组体符合预期目标。SCRE
PCR产物为 222 bp, 编码 61个氨基酸, 与 Bo SCR28
(GenBank 登录号为 AB190356.1)对应氨基酸序列完全
一致, 包含了SRK28完整的成熟肽序列, SCRF为249 bp,
编码 59个氨基酸, 与 Bo SCR7 (GenBank登录号为AB
180898.1), 包含了 SRK7完整的成熟肽序列。

图 1 推导的 eSRKE、eSRKF和 eSRK重组体氨基酸序列比对图
Fig. 1 Alignments of deduced amino acids sequence of eSRKE, eSRKF, and eSRK chimeras

2.2 酵母双杂交表达质粒的构建
按照前述方法, EcoR I/BamH I 双酶切后构建
pGADT7-eSRK和 pGBKT7-SCR酵母表达质粒。经
菌落 PCR 筛选阳性克隆后提取质粒, 分别用 EcoR
I/BamH I 双酶切, 酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳
(图 2), 从图中可以看出均可以得到与 SCRE、SCRF、
eSRKE、eSRKE-1、eSRKE-2、eSRKE-3和 eSRKF大小一
致的片段。表达质粒测序结果表明各 eSRK 和 SCR
的插入位点、序列和读码框皆正确, 说明酵母表达
质粒构建成功。

图 2 重组质粒的 EcoR I和 BamH I双酶切图谱
Fig. 2 Double digestion patterns of recombinant plasmids

with
EcoR I and BamH I
(A) M: trans2K DNA marker; 1: pGADT7-eSRKE; 2: pGADT7-
eSRKF; 3: pGADT7-eSRKE-1; 4: pGADT7-eSRKE-2; 5:
pGADT7-eSRKE-3; (B) M: trans2K DNA marker; 1: pGBKT7-SCRF;
2: pGBKT7-SCRE.
第 9期 韦静宜等: 甘蓝 eSRK重组体的构建及其与 SCR的相互作用 1635


2.3 重组酵母双杂交表达质粒的毒性和自激活
检测
以 pGADT7-eSRK和 pGBKT7-SCR重组质粒转
化 AH109, 30℃培养 3 d 后 , 转化酵母分别在
SD/–Leu 和 SD/–Trp 平板上长出菌落, 菌落 PCR 也
能扩增出相应的目的条带(未附图), 说明重组质粒
转化酵母成功。转化酵母 AH109在 SD/–Trp/X-α-gal
和 SD/–Leu/X-α-gal平板上长出的菌落呈白色, 而阳
性对照 pGBKT7-53×pGADT7-T在 SD/–Leu/X-α-Gal
和 SD/–Trp/X-α-Gal平板上皆有菌落生长, 并且菌落
呈蓝色(表 3)。这说明 eSRK 和 SCR 均不能自激活
MEL1基因, 无自身转录激活活性。

表 3 质粒转化酵母的自激活检测
Table 3 Self-activation results of the transformed yeast strains
质粒
Plasmid
选择培养基
Selective agar plate
菌斑
Colony
颜色
Color
pGBKT7-SCRE SD/–Trp
SD/–Trp/X-α-gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White
pGBKT7-SCRF SD/–Trp
SD/–Trp/X-α-gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White
pGADT7-eSRKE SD/–Leu
SD/–Leu/X-α-gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White
pGADT7-eSRKE-1 SD/–Leu
SD/–Leu/X-α-gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White
pGADT7-eSRKE-2 SD/–Leu
SD/–Leu/X-α-gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White
pGADT7-eSRKE-3 SD/–Leu
SD/–Leu/X-α-gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White
pGADT7-eSRKF SD/–Leu
SD/–Leu/X-α-gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White
pGBKT7-p53×pGADT7-T SD/–Leu/–Trp
SD/–Leu/–Trp/X-α-Gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
蓝色 Blue
pGBKT7-Lam×pGADT7-T SD/–Leu/–Trp
SD/–Leu/–Trp/X-α-Gal
有 Yes
有 Yes
白色 White
白色 White

2.5 SCR与各个 eSRK相互作用的检测
所有的质粒组合在 SD/–His–Trp–Leu上均有白色
的单菌落且生长状况良好(表 4和图 3-A)。用通用引物
对SD/–His–Trp–Leu平板上的菌落进行菌液PCR检测,
发现, 同一单菌落有明显的 SCR和 eSRK目的片段(未
附图 ), 进一步证明了重组质粒 pGBKT7-SCR 和
pGADT7-eSRK 成功转入酵母菌。为进一步检测各个
组合蛋白质间相互作用, 排除假阳性和假阴性的出现,
将 SD/–His–Trp–Leu平板上的单克隆转移至 SD/–His–
Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT平板上, 30℃
黑暗条件下培养 5 d后, 观察菌落生长和显色状况(表
4 和图 3-B), 只有 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE、
pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKF 和 阳 性 对 照 组
pGBKT7-p53×pGADT7-T 组合的菌斑能生长且呈蓝色,
表明 Mel1 基因已被激活, 说明这 3 对组合蛋白间
能相互作用 ; 而 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKF 和
pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE 两对组合的菌落在
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT平板
上不能生长且呈白色(表 4、图 3-B中 1和 7所示), 表
明 eSRKE与 SCRE、eSRKF与 SCRF能相互作用, 而
eSRKE与 SCRF、eSRKF与 SCRE间不能作用; 在 eSRK
重组体与 SCR 相互作用检测中 pGBKT7-SCRE×
pGADT7-eSRKE-1、pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE-2
和 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE-3 3 对组合的菌斑
在 SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT平
板上均不能生长且呈白色(表 4和图 3中 3~5所示), 说
明 SCRE与重组体 eSRKE-1、eSRKE-2、eSRKE-3均不发
生作用; pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE-1、pGBKT7-
SCRF×pGADT7-eSRKE-2和 pGBKT7-SCRF×pGADT7-
eSRKE-3组合的菌斑在 SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-
gal/25 mmol L–1 3-AT 平板上均不能生长且呈现
色 (表 4 和图 3 中 8~10 所示 ), 说明 SCRF与重
组体 eSRKE-1、eSRKE-2、eSRKE-3也均不能发生
作用。

1636 作 物 学 报 第 38卷

表 4 各个 eSRK与 SCR的相互作用在酵母中的表现
Table 4 Interactions between eSRKs and SCR in yeast
编号
Number
质粒
Plasmid
选择培养基
Selective agar plate
菌斑生长与否
Colony grow or not
颜色
Color
1 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKF SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu-Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
2 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
生长 Yes
白色 White
蓝色 Blue
3 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE-1 SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
4 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE-2 SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
5 pGBKT7-SCRE×pGADT7-eSRKE-3 SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
6 pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKF SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
生长 Yes
白色 White
蓝色 Blue
7 pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
8 pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE-1 SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
9 pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE-2 SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
10 pGBKT7-SCRF×pGADT7-eSRKE-3 SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White
11 pGBKT7-p53×pGADT7-T SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
生长 Yes
白色 White
蓝色 Blue
12 pGBKT7-Lam×pGADT7-T SD/–His–Trp–Leu
SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT
生长 Yes
不长 Not
白色 White
白色 White

图 3 酵母中各 eSRK与 SCR相互作用分析
Fig. 3 Analysis of the interactions between eSRK and SCR in yeast
A: SD/–His–Trp–Leu agar plate; B: SD/–His–Trp–Leu–Ade/X-α-gal/25 mmol L–1 3-AT agar plate.
The numbers shown in the Figure correspond with those given in Table 4.

3 讨论
SRK 与 SCR 分别是甘蓝自交不亲和唯一的雌
雄决定因子, 两者相互作用具有单倍型特异性, 只
有单倍型相同时, SCR才能与 SRK胞外域(eSRK)作
用[14]。在分析了甘蓝 E、F中 SRK和 SCR序列, 通
过 Blast证明 E为 S28单倍型、F为 S7单倍型, 我们
构建了 eSRKE、eSRKF、SCRE和 SCRF酵母双杂交
表达质粒 , 双杂交检测结果显示 eSRKE与 SCRE、
eSRKF与 SCRF能相互作用 , 而 eSRKE与 SCRF、
eSRKF与 SCRE间不能作用 , 表明 E与 F应属于不
同的单倍型 , 这与序列分析结果一致 , 说明酵母
双杂交系统可用来鉴定甘蓝自交不亲和系的单倍
型。
本研究中依据 HVI/II 区域包含的氨基酸序列,
设计中间引物 , 利用重组 PCR技术构建了 3种
eSRKE重组体, 其中 eSRKE-1中HVI被 eSRKF中HVI
区域替代, eSRKE-2中 HVII被 eSRKF中 HVII区域替
代, eSRKE-1中 HVI和 HVII被 eSRKF中 HVI和 HVII
第 9期 韦静宜等: 甘蓝 eSRK重组体的构建及其与 SCR的相互作用 1637


区域替代 , 序列比对表明 (图 1和图 4), eSRKE与
eSRKF的 HVI有 9个氨基酸的差异, HVII区域有 13
个氨基酸差异, 酵母双杂交检测证明 3 种重组体均
不能与 SCRE作用(表 4 和图 3), 表明 HVI 和 HVII
区域差异点共同参与了 eSRKE与 SCRE作用, 这与
Miege 等[27]提出 HVI 和 HVII 区域上差异氨基酸残
基是 SCR结合位点的猜想一致。而进一步验证表明
3 种重组体也均不能与 SCRF作用, 表明替换 HVI/II
区域后, 并不能改变 eSRKE的单倍型, 虽然 3 种重
组体带有 eSRKF的 HVI、HVII序列, 很可能是由于
eSRK 结构和功能的与整个氨基酸序列有关, 即只
有在所有必需氨基酸保持不变的情况下每个 eSRK
才能维持自己的单倍型特异性。在比对现有的 eSRK
序列后可以发现高变区 HVI、HVII和 HVIII之外[26-27]
也存在着一些高度变化的位点(图 6), 通常认为这些
位点与平衡选择的位点紧密连锁[28], 并接受正向选
择信号。由此我们推断, 这些“正向选择位点”可能是
决定 SRK功能特异性的位点。

图 4 eSRK序列对比图
Fig. 4 Alignments of eSRKs
* 表示各序列间高度变化的氨基酸位点。
* Show amino acids with high diversity between eSRKs.

根据以上分析, 我们认为大多数 SI特异性是由
位于 C末端的 HVI和位于 C端中间的 HVII所决定
的, 而这些片段的完整序列或者这些片段的三维构
象是决定 SI特异性的主要因素。至于单个的氨基酸
位点是否能决定 eSRK 的单倍型特异性, 这还需要
对 HVI、HVII上高度变化的位点进行研究和分析。
事实上, 由分散在 2个不连续区域上的氨基酸残基
来控制 SRK特异性并不是不可能的, 这在其他的分
子识别机制中也能找到相同的例子 [29-31]。而研究
HVI、HVII 区域外存在的“正向选择位点”对阐明
eSRK单倍型特异性形成机制也会有很大的帮助。经
eSRK 空间结构预测, 我们推测 HVI、HVII 两个区
域上的高度变化位点可能位于 SRK 蛋白的表面并
在三维结构上相互靠近, 共同形成 SCR结合口袋的
一部分。配体结合状态和非结合状态下 SRK的高解
析度的三维结构将有助于解决这个问题。不过, 对
SRK结构域三维结构的预测也表明 HVI是 LLD2结
构域中暴露于溶剂中的部分[32]。因此, HVI上任何氨
基酸残基的变化(如电荷的改变)都将改变 eSRK 的
结构甚至功能, 相比之下, 位于 LDD2 和 EFG-like
结构域上的HVII就没有那么清晰明了, 这个区域上
的氨基酸残基如何引起 SRK 结构和功能的改变也
无从得知。在今后的研究中, 构建各种 SRK点突变,
对其结构和功能进行分析, 并结合三维结构研究将
有助于揭示在 SRK 配体特异性结合中起其重要作
用的氨基酸位点, 也将有助于解释 SRK如何与 SCR
共进化以保持它们高度特异性的相互作用。这将对
SRK与 SCR作用机制的深入研究有重要意义, 也将
为利用自交不亲和性创造芸薹属作物新的育种理论
和方法奠定基础。
1638 作 物 学 报 第 38卷

4 结论
利用酵母双杂交技术检测到不同单倍型 SRK
与 SCR 之间识别的单倍型特异性, 当 SRK 中 HVI
和 HVII 区域被来自不同单倍型 SRK 对应区域替换
后 SRK 不能与相同单倍型 SCR 作用, 且 HVI 和
HVII区域被替换后并不能转变 SRK识别 SCR的单
倍型特异性, 这对于进一步研究 SRK与 SCR识别的
单倍型特异性机制具有重要的意义。
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