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Genetic Diversity Analysis of Black Sesame(Sesamum indicum DC) Core Collection of China Using SRAP Markers

应用SRAP标记分析黑芝麻核心种质遗传多样性


China has a long history and rich germplasm resources for growing black sesame


全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(10): 1936−1941 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家科技基础条件平台项目(2005DKA21001-20), 国家科技支撑计划项目(2006BAD13B05-2), 农业部物种保护项目(NB08-2130135-
34,35)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张秀荣,E-mail: zhangxr@oilcrops.cn
第一作者联系方式: E-mail: chezhuo1110@163.com ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2009-01-14; Accepted(接受日期): 2009-04-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01936
应用 SRAP标记分析黑芝麻核心种质遗传多样性
车 卓 1,2 张艳欣 1,** 孙 建 1 张秀荣 1,* 尚勋武 2 王化俊 2
1 中国农业科学院油料作物研究所, 湖北武汉 430062; 2 甘肃农业大学 / 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 甘肃兰州
730070
摘 要: 利用 SRAP 分子标记技术对中国芝麻资源核心收集品中的黑芝麻种质进行遗传多样性分析。结果表明, 13
对引物组合对 100份黑芝麻核心种质共扩增出稳定清晰的条带 182条, 其中多态性条带 126条, 占 69.2%, 每对引物
组合的条带数和多态性带数分别为 14.0 个和 9.7 个; 供试材料间成对遗传相似系数介于 0.469~0.986, 平均为 0.726,
通过 UPGMA 法, 在遗传相似系数为 0.68 处可将供试材料聚为 5 个类群, 表明黑芝麻核心种质具有较丰富的遗传多
样性, 聚类结果与地理分布没有明显的关系; 遗传多样性指数是南方黑芝麻核心种质(0.3557)>中部种质(0.3415)>
北方种质(0.2986)。本研究结果较全面反映了中国保存的黑芝麻种质资源遗传多样性特点, 为我国黑芝麻资源进一步
考察收集和引进, 以及优异黑芝麻基因资源挖掘和育种利用提供了理论依据。
关键词: 黑芝麻; 核心种质; SRAP; 遗传多样性
Genetic Diversity Analysis of Black Sesame (Sesamum indicum DC) Core Col-
lection of China Using SRAP Markers
CHE Zhuo1,2, ZHANG Yan-Xin1,**, SUN Jian1, ZHANG Xiu-Rong1,*, SHANG Xun-Wu2, and
WANG Hua-Jun2
1 Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China; 2 Gansu Agricultural University / Gansu Key
Laboratory of Crop Genetic Improvement and Germplasm Enhancement, Lanzhou 730070, China
Abstract: China has a long history and rich germplasm resources for growing black sesame. Black sesame is well used because of
its nutrition superior to black rice and black soybean. However, Research on black sesame is relatively less than that on other
crops. In the paper, genetic diversity of black sesame core collection of China was analyzed using SRAP (sequence-related ampli-
fied polymorphism) markers. The results showed that 13 SRAP primer combinations were employed to evaluate the genetic di-
versity of 100 black sesame accessions, a total of 182 amplified fragments were detected and 126 of them were polymorphic, the
polymorphism percentage was 69.2%, the number of amplified fragments and polymorphic fragments of each primer combination
were 14.0 and 9.7, respectively. The 100 accessions were grouped into five clusters at genetic similarity of 0.68, indicating the
genetic diversity of these accessions was abundant. As regards geographic regions, Shannons information index of black sesame
accessions in south China (0.3557) was the highest, the followings were that in central regions of China (0.3415) and north China
(0.2986). The characteristics of genetic diversity of black sesame core collection of China were fully revealed in this study, which
provided the theoretical foundations for further exploring, collecting and introducing black sesame germplasm as well as mining
and utilizing excellent black sesame germplasm in the future.
Keywords: Black sesame; Core Collection; SRAP; Genetic diversity
黑芝麻在我国种植历史悠久 , 资源丰富 , 有很高的
营养价值 , 但对其种质资源研究目前仅见表型方面的少
量报道[3-4]。利用分子标记技术能对种质资源进行准确、
科学的鉴定和评价 , 可为资源保存和育种等工作提供可
靠依据。
近年来, 基于基因组检测的 DNA分子标记已应用于
芝麻遗传变异的研究[5-12]。Bhat 等[5]用 RAPD 标记对 38
份种植于不同国家的芝麻材料进行分析 , 表明供试材料
间具有较高的遗传多样性; Kim 等[6]利用 14 对 ISSR 引
物分析了 75份来自韩国和其他国家的芝麻资源的多样性;
第 10期 车 卓等: 应用 SRAP标记分析黑芝麻核心种质遗传多样性 1937


Laurentin 等[8]利用 AFLP 分子标记分析了 32 份芝麻种质
资源的遗传差异, 利用 8对引物在 457个位点扩增出条带,
93%的具有多态性; 张秀荣等[11]利用 RAPD 分子标记方
法, 选取 14个随机引物, 对我国 19份芝麻种质资源进行
了遗传多样性分析。Li等[13]于 2001年开发出了一种新的
基于 PCR 的 SRAP (sequence-related amplified polymor-
phism)标记, 该标记具备 RFLP、RAPD、SSR和 AFLP等
分子标记的优点, 已得到广泛应用。本研究旨在从 DNA
水平上揭示我国黑芝麻资源的遗传多样性特点 , 为我国
黑芝麻育种和种质资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
中国芝麻核心收集品(共 453 份, 包含国内 422 份、
国外 31 份)中的全部黑芝麻种质 100 份(国内 92 份, 国外
8 份), 种子来源于国家油料种质资源中期库(中国农业科
学院油料作物研究所, 湖北武汉)[14]。
1.2 DNA提取与纯度检测
取幼嫩的黑芝麻叶片按照 Doyle[15]的 CTAB 改良法
提取黑芝麻基因组总 DNA, 用 RNaseA 消化除去 RNA,
0.6%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性, 采用紫外分光核
酸测定仪测定 DNA 质量和浓度, 并计算样品 DNA 浓度,
稀释至 20 ng μL−1, –20℃保存备用。
1.3 PCR扩增
根据 Li 等[13]设计 SRAP引物的原则, 设计正反向引
物各 11条(表 1), 由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。本实验对芝麻 SRAP-PCR 反应体系进行了优化并
确立了最优体系(15 μL):10 mmol L−1dNTPs 0.30 μL, 25
mmol L−1 Mg2+1.20 μL, 正反引物各 50 ng, DNA模板 80 ng,
10×buffer 1.5 μL, 1 U Taq DNA聚合酶(购自 MBI生物工
程公司)[16]。参照 Li等[13] PCR程序, 94℃ 3 min; 94℃ 1
min, 35℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共 5个循环; 94℃ 1 min,
50℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共 35个循环; 72℃延伸 10 min,
4℃保存。参照 Bassam等[17]的方法用 6%的聚丙烯酰胺凝
胶分离 PCR 扩增产物和银染显影, 电泳设备为北京六一
的 DYY-12型电泳仪和 DYCZ-20C电泳槽, 电泳缓冲液为
0.5×TBE, 恒定功率为 80 W, 预电泳 30 min左右, 至玻璃
温度达到 50℃。取上样缓冲液 (98%去离子甲酰胺 , 10
mmol L−1 EDTA, 0.05%溴酚蓝, 0.05%二甲苯青) 8 μL加入
SRAP扩增产物, 95℃变性 5 min, 迅速以冰水混合物冷却,
防止复性。每样品各取 3 μL, 上样于 6%的聚丙烯酰胺凝
胶上, 电泳至二甲苯青距离胶板底部 10 cm为佳。
1.4 数据统计与分析
统计清晰的 SRAP 扩增条带, 以相同迁移位置上有
带记 1, 无带记 0, 缺失记–, 建立数据库。用 NTSYS-pc2.10
分析软件进行数据分析, 利用 SimQual程序求Nei-Li相似
性系数矩阵, 用 SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分
析并生成聚类图; 利用 POPGENE1.32 软件计算群体的
Shannon遗传多样性指数。
2 结果与分析
2.1 SRAP多态性分析
利用表 1 所列的正反引物各 11 条, 随机组合 50 对
SRAP 引物对 6 个随机挑选的黑芝麻材料的 DNA 进行扩
增, 其中有效扩增引物 29对。选其中扩增条带易于识别、
带型清晰, 且都具有多态性的 13 对引物对供试材料进行
分析。结果表明, 13对引物共扩增出 182条带, 平均每对
引物 14.0 条, 其中多态性带共 126 条, 平均每对引物 9.7
条。各引物产生的多态性带比例为 40.0%~90.0%, 平均
69.2%(表 2)。图 1 为引物组合 Me09/Em06 的扩增结果的
截图。
2.2 遗传多样性分析
利用所得到 182 个 SRAP 标记对 100 份供试材料之
间的遗传相似系数(GS)进行分析, 结果表明, 黑芝麻核心

表 1 SRAP分析所用的引物及其序列
Table 1 SRAP primers sequences
正向引物 Forward primer (5′–3′)

反向引物 Reverse primer (5′–3′)

引物编号
Primer code
引物序列
Primer sequence
引物编号
Primer code
引物序列
Primer sequence
Me01 TGAGTCCAAACCGGATA Em01 GACTGCGTACGAATTAAT
Me02 TGAGTCCAAACCGGAGC Em02 GACTGCGTACGAATTTGC
Me03 TGAGTCCAAACCGGAAT Em03 GACTGCGTACGAATTGAC
Me04 TGAGTCCAAACCGGACC Em04 GACTGCGTACGAATTTGA
Me05 TGAGTCCAAACCGGAAG Em05 GACTGCGTACGAATTAAC
Me06 TGAGTCCAAACCGGTAA Em06 GACTGCGTACGAATTGCA
Me07 TGAGTCCAAACCGGTCC Em07 GACTGCGTACGAATTCAA
Me08 TGAGTCCAAACCGGTGC Em08 GACTGCGTACGAATTCTG
Me09 TGAGTCCAAACCGGACG Em09 GACTGCGTACGAATTCGA
Me10 TGAGTCCAAACCGGACT Em10 GACTGCGTACGAATTCAG
Me11 TGAGTCCAAACCGGAGG Em11 GACTGCGTACGAATTCCA
1938 作 物 学 报 第 35卷

表 2 SRAP引物组合及扩增结果
Table 2 The primer and the amplified results of SRAP analysis
引物组合
Primer
combination
总位点数
Total locus
多态性位点数
Polymorphic
locus
多态性比率
Percentage of poly-
morphic locus (%)
Me01/Em01 10 9 90.0
Me01/Em02 11 9 81.8
Me02/Em02 11 6 54.6
Me02/Em03 8 6 75.0
Me03/Em02 14 11 78.6
Me06/Em05 10 4 40.0
Me07/Em06 26 12 46.2
Me08/Em04 14 10 71.4
Me08/Em05 23 17 73.9
Me09/Em04 11 6 54.6
Me09/Em06 14 10 71.4
Me09/Em08 16 14 87.5
Me10/Em10 14 12 85.7
总计 Total 182 126 –
平均 Average 14.0 9.7 69.2

种质间的成对遗传相似系数范围为 0.469~0.986, 平均为
0.726, 表明黑芝麻核心种质具有较丰富的遗传多样性。遗
传差异最小的是来自湖北的炭芝麻和浙江的黑芝麻(GS
为 0.986), 来自安徽的大演黑和广西的新和黑芝麻遗传差
异最大(GS为 0.4688), 亲缘关系最远。
采用非加权平均法(UPGMA)进行聚类分析, 构建亲
缘关系树状图(图 2), 在遗传相似系数 0.68 处可将所有供
试材料划分为 5个类群。类群 I, 包括 72份来源不同的材
料, 平均 GS为 0.820, 表明该组黑芝麻核心种质具有较高
的遗传相似性, 亲缘关系较近; 类群 II, 共有 6 份材料,
分别是中国福建芝麻 13 (聚类图中编号, 下同)、湖北黑芝
麻 37、山东新编五号 59和四川黑芝麻 79, 以及中国浙江
的四棱芝麻 89和多枝黑芝麻 92, 平均 GS为 0.736; 类群
III, 有 9份材料, 分别是中国河北黑芝麻 32、海南黑芝麻
29、湖北黑芝麻 40、云南包葶种 81、中国台湾芝麻 84、
阿联“24-1”94、日本 TKV-306(20)96、韩国 662(30)97 及
刚果野芝麻 100, 平均 GS为 0.767; 类群 IV, 包括 11份材
料, 来自中国安徽的大演黑 6和双桥芝麻 11、中国江西的
芝麻 48 和海会黑芝麻 49、中国上海的华漕黑芝麻 72 和
青春黑芝麻 73、中国四川的芝麻 75和黑芝麻 80、中国广
西的芝麻 13、中国陕西的黑芝麻 68及浙江的密蒴芝麻 86,
平均 GS为 0.734; 类群 V, 2份材料, 来自中国广东的乌芝
麻 15和四川的黑芝麻 77, GS为 0.825。除了来自生态区
VI和生态区 V的种质分别在类群 I和类群 IV中有少量成
簇分布现象外 , 其他不同来源种质在聚类图上均相互交
错分布。
2.3 不同区域黑芝麻核心种质遗传多样性比较
参考中国农业科学院油料作物研究所主编的《中国
芝麻品种志》[18]和《中国芝麻品种资源目录》[19]对我国
芝麻各生态区的划分, 将国内 92 份黑芝麻核心种质分为
3 个组, 即东北、华北、西北一年一熟春播区种质为第 1
组(北方种质); 黄淮、江汉及长江中下游一年两熟夏播区
种质为第 2 组(中部种质); 华中南、华南及西南一年两熟
或三熟春、夏、秋播区种质为第 3 组(南方种质)。从表 3
看出, 南方种质的多态性条带比率最高, 为 60.1%, 其次
是中部种质的 58.2%和北方种质的 45.6%, 国外种质多态
性条带比率较低, 为 31.9%; 平均 GS为南方种质(0.7188)
<中部种质 (0.7289)<国外种质 (0.7546)<北方种质
(0.7755); 遗传多样性指数南方种质 (0.3557)>中部种质
(0.3415)>北方种质(0.2986)>国外种质(0.2422)。以上结
果表明, 我国华中南部、华南及西南地区的黑芝麻种质遗
传变异较高, 遗传多样性较丰富; 国外黑芝麻核心种质平
均 GS 较高, 多态性条带比率及遗传多样性指数均较低,
原因可能是供试材料较少(仅 8份)。



图 1 引物组合 Me09/Em06的扩增结果
Fig. 1 SRAP fingerprint of black sesame accessions from primer combination Me09/Em06
编号同表 1。The code is same as Table 1.
第 10期 车 卓等: 应用 SRAP标记分析黑芝麻核心种质遗传多样性 1939




图 2 100份黑芝麻材料的聚类图
Fig. 2 Dendrogram of 100 black sesame accessions

3 讨论
SRAP标记是在总结已有的 DNA分子标记的优缺点
的基础上开发的一种新的基于 PCR 的 DNA 分子标记技
术。RFLP 标记要求高纯度和高浓度的 DNA 和使用放射
性同位素, SSR 标记要花费大量人力物力进行引物开发,
AFLP 需要预扩增和连接, 而 SRAP 标记扩增结果的多态
性可与 AFLP标记相媲美, 又易于操作, 经济有效。SRAP
1940 作 物 学 报 第 35卷

表 3 不同地理区域材料遗传多样性比较
Table 3 Comparison of genetic diversity from different regions
种质
Germplasm
材料数
Accession
number
多态性条带比率
Rate of polymorphic
bands (%)
最小相似系数
Minimum genetic
similarity
最大相似系数
Maximum genetic
similarity
平均相似系数
Average genetic
similarity
多样性指数
Shannon’s informa-
tion index
南方种质 South China 34 60.1 0.472 0.9802 0.7188 0.3557
中部种质 Central zone of China 43 58.2 0.4918 0.9519 0.7289 0.3415
北方种质 North China 15 45.6 0.6102 0.9505 0.7755 0.2986
国外种质 Oversea 8 31.9 0.6111 0.9038 0.7546 0.2422

标记的这些优点已经在油菜、野牛草、西葫芦、甜菜和棉
花的遗传多样性研究中得到证实[20-24]。王华忠等[23]对甜
菜单胚雄性不育系及保持系等 49 份材料进行遗传多样性
分析, 11对 SRAP引物组合共产生 199条扩增带, 其中有
86条多态性带, 多态性带的比率平均为 43.7%, 李武等[24]
利用 132 对 SRAP 引物, 对我国海岛棉 36 个国内品种及
20 个国外品种进行遗传多样性分析, 共检测到 419 个多
态性位点。本研究利用 SRAP标记技术对 100份黑芝麻核
心种质资源进行遗传多样性分析, 13对引物共扩增出 182
条带, 其中多态性带 126 条, 多态性带比例为 69.2%, 说
明它是一种可靠有效的标记。
本研究表明黑芝麻核心种质具有较丰富的遗传多样
性, 与前人对芝麻种质资源 DNA遗传多样性研究相比较,
分析的材料数较多, 但同属于一个栽培种, 来源相对较集
中(92%来源于国内), 种质间遗传相似系数为 0469~0.986,
遗传跨度较小, 其遗传多样性低于前人的研究结果。Bhat
等[5]利用 RAPD 标记分析了来自 21 个国家(22 份)和印度
18 个省(36 份)芝麻种质资源, 供试材料间遗传相似系数为
0.19~0.89; Laurentin 等[8]应用 AFLP 分子标记分析了 32
份来自印度、非洲、东亚(中、日、韩)、中亚及西亚芝麻
种质的遗传多样性, 其多态性条带比率为 93%, 材料间遗
传相似系数为 0.38~0.85, 平均 0.65; Laurentin等[9]利用 8
对 AFLP引物对来自委内瑞拉、中国、墨西哥等国家的芝
麻品种进行了分析, 其多态性条带比率为 91%, 品种间遗
传相似系数为 0.31~0.78, 平均为 0.52。因此, 在黑芝麻种
质资源和育种工作中, 应加强对国外种质的引进, 进一步
丰富我国黑芝麻遗传类型。
利用分子标记技术检测作物 DNA 遗传多样性差异
来推断其传播趋势已在小豆[25]、甘蔗[26]及大豆[27]等作物
遗传演化研究中应用。作物一般有自生物多样性丰富区向
次丰富区传播的趋势, 本研究发现, 我国南部地区的黑芝
麻核心种质资源平均遗传相似系数最低 , 多态性条带比
率、遗传多样性指数均最高, 是我国黑芝麻类型最丰富的
区域, 可能与这些地区地形复杂、气候差异较大有关, 中
部地区遗传多样性中等 , 而北部地区黑芝麻种质遗传多
样性较贫乏。这可能为研究黑芝麻在中国的演变和传播历
史提供一定的参考。
由供试材料的聚类结果看, 来自不同生态区和省份
及国外的黑芝麻核心种质相互交错聚在一起 , 表明黑芝
麻种质的遗传关系相似程度与地理分布远近之间没有明显
的关系, 与国内外已报道的芝麻相关研究结果相一致[7-9,12]。
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