全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(7): 11871195 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家科技支撑计划项目 (2012BAD06B03), 国家现代农业产业技术体系建设项目 (CARS-10-P18)和甘肃省重大专项
(1102NKDM025)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张俊莲, E-mail: zhangjunlian99@yahoo.com.cn; 王蒂, E-mail: wangd@gsau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: lyhui@yahoo.cn
Received(收稿日期): 2012-01-09; Accepted(接受日期): 2012-04-15; Published online(网络出版日期): 2012-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120511.1826.036.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01187
马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建
刘玉汇 1,2 王 丽 3 杨宏羽 1 余 斌 1,2 李元铭 4 张俊莲 1,2,*
王 蒂 1,2,*
1 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室 / 甘肃农业大学农学院, 甘肃兰州 730070; 2 甘肃省干旱生境作物学重点实验室, 甘肃
兰州 730070; 3 甘肃农业大学生命科学技术学院, 甘肃兰州 730070; 4 甘肃农村发展研究院, 甘肃兰州 730070
摘 要: GBSSI 是马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶, 为培育高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的转基因马
铃薯材料, 根据 GenBank 登录号 X58453 的序列设计特异引物, 采用 RT-PCR 技术获得马铃薯块茎 GBSSI 相似基因,
并利用生物信息学相关软件分析, 预测 GBSSI 相似基因 cDNA 序列编码的蛋白质结构和功能。结果表明, 克隆的
GBSSI相似基因与报道的 GBSSI基因序列相似性达到 99.78%, 其开放阅读框长 1 824 bp, 编码 607个氨基酸, 具有许
多重要功能位点。三级结构预测结果表明, 该蛋白具有淀粉合成功能, 基因序列已注册到 GenBank, 序列登录号为
EU403426。以此基因 CDS内 542 bp的靶标序列作为干扰区段, 扩增 GBSSI的正反向基因片段, 并引入 237 bp的内
含子序列, 构建由 Patatin启动子驱动的具有“正义基因片段 gbss A-内含子VP1-ABI3-like protein-反义基因片段 gbss B”
的植物干扰表达载体 pBI121g-PgABI。本研究结果将为淀粉合成的进一步研究和高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量
的马铃薯品种的培育奠定基础。
关键词: 马铃薯; 颗粒结合型淀粉合酶; 基因克隆; 序列分析; RNAi载体
Cloning of Granule-Bound Starch Synthase Gene and Construction of Its RNAi
Vector in Potato Tuber
LIU Yu-Hui1,2, WANG Li3, YANG Hong-Yu1, YU Bin1,2, LI Yuan-Ming4, ZHANG Jun-Lian1,2,*, and
WANG Di1,2,*
1 Gansu Key Laboratory of Crop Genetic & Germplasm Enhancement / College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
2 Gansu Key Laboratory of Aridland Crop Science, Lanzhou 730070, China; 3 College of Life Sciences and Technology, Gansu Agricultural University,
Lanzhou 730070, China; 4 Gansu Rural Development Research Institute, Lanzhou 730070, China
Abstract: There is about 17% starch in potato (Solanum tuberosum L.) tubers. Potato starch granules are composed of two poly-
saccharides, unbranched amylose (approximately 20% to 25%) and branched amylopectin (approximately 75% to 80%). To de-
velop transgenic potato with high-amylopectin in tubers, we got a cDNA sequence of the potato GBSSI from the total RNA of
potato tubers by RT-PCR using specific primers of conserved domain of GenBank Accession Number X58453 sequence. The
GBSSI cDNA sequence shared 99.78% similarity with the GBSSI gene in GenBank (accession No. X58453). The full-length of
cDNA was 1 824 bp, which contained 607 amino acids, three conserved domains and many important functional sites. The 3D
structure of GBSSI was highly similar to that of the glycogen synthase, indicating that GBSSI has a function of starch synthesis.
GBSSI similar gene obtained here was granule-bound starch synthase, and its sequence was submitted to GenBank, with the ac-
cession number of EU403426. On the basis of a 542 bp RNAi target region from the CDS of GBSSI, the sense and antisense
fragments were amplified and separated by a 237 bp intron to construct the RNA interference expression vector pBI121g-PgABI
containing “sense gbssA-VP1-ABI3-like protein intron-antisense gbss B” regulated by Patatin promoter, which will lay a solid
foundation for the study on synthesis of starch and breeding of transgenic potato with high amylopectin content or pure amy-
lopectin.
Keywords: Potato; GBSSI gene; Gene cloning; Sequence analysis; RNA interference vector
1188 作 物 学 报 第 38卷
马铃薯(Solanum tuberosum L.)淀粉作为一种廉
价易得的再生性资源, 已成为食品和工业等许多领
域的重要原料。马铃薯淀粉中 , 直链淀粉约占
20%~25%, 支链淀粉约占 75%~80%, 淀粉含量及直
/支链淀粉比例影响马铃薯加工淀粉的产量及其在
食品加工、造纸、化工等工业中的用途[1]。高支链
淀粉由于具有较好的稳定性、溶解性、黏滞性和透
明性, 适于作增稠预制剂、乳化剂、黏着剂等, 被广
泛用于食品添加剂, 也在造纸、纺织、建筑、石油
化工等方面广泛应用[2]。而高直链淀粉水溶性很低,
分子间易结合, 易发生凝沉, 较难糊化而易老化 [3],
目前在许多应用领域中, 都要求淀粉具有较低的糊
化温度和较弱的凝沉性, 已把淀粉的糊化性和老化
性作为其应用的重要参考指标 [4], 由于马铃薯没有
高支链淀粉的天然突变体, 而从普通马铃薯淀粉中
分离支链淀粉成本较高, 限制了马铃薯支链淀粉的
开发和利用。因此, 培育高支链淀粉含量或者纯支
链淀粉含量的马铃薯品种, 对于拓展马铃薯淀粉应
用领域, 促进马铃薯产业的发展及提高经济效益具
有重要的意义。
目前已知颗粒结合淀粉合酶 (granule-bound
starch synthase, GBSS)在淀粉生物合成过程中催化
形成 α-1,4-糖苷键, 将 ADP 葡萄糖连接在 α-1,4-葡
聚糖的非还原端, 延长 α-1,4-葡聚糖链, 是直链淀粉
形成过程中的关键酶[5-6]。GBSS 具多种同工型, 其
中 GBSSI 又称 Waxy 蛋白, 在淀粉贮存组织中对直
链淀粉的合成起关键作用[7]。Kuipers 等[8]通过反义
RNA (antisense RNA)技术抑制 GBSSI基因表达, 获
得了高支链淀粉含量的转基因植株, 在黏度、不易
凝胶和不易老化等方面具有独特优势。但随之发现,
反义 RNA引起的基因沉默效果不稳定[9]。新近开发
的 RNAi技术, 尤其是含有内含子发夹型的 RNA干
扰(intron splicing hairpin RNAi, ihpRNAi)技术, 能
引起靶基因 85%以上甚至 100%沉默[10]。RNA 干扰
已广泛应用于多种动植物功能基因组研究和代谢途
径分析 [11], 并且在作物改良中也得到了成功的应
用 [12-14], 但在改变马铃薯淀粉组成, 提高支链淀粉
含量方面的应用研究却鲜有报道。
本研究通过克隆 GBSSI基因及利用基因和蛋白
数据库资料对该序列及其推导的氨基酸序列进行功
能分析, 并选取 GBSSI 一段保守序列作为靶标, 构
建以 Patatin 启动子驱动的正向 gbss A-内含子-反向
gbss B 的 ihpRNAi 植物表达载体, 旨在通过 RNAi
介导的基因沉默技术抑制 GBSSI 的表达 , 降低
GBSSI 基因的活性, 以期选育出高支链淀粉或者纯
支链淀粉的适宜加工的新型马铃薯品种, 该研究对
于改良马铃薯淀粉品质, 降低加工能量消耗, 拓宽
马铃薯淀粉的应用领域, 带动整个马铃薯产业的发
展具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马铃薯四倍体栽培种甘农薯 2 号微型薯由甘肃
省作物遗传改良与种质创新重点实验室(以下简称
重点实验室)提供。大肠杆菌(Escherichis coli)菌株
DH5感受态细胞、pGEM-T Easy Vector [抗性标记
为氨苄青霉素(Amp)], 购自 Promega 公司。各种限
制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购
自 TaKaRa 公司 ; PureLink Plant RNA Reagent、
Superscript III 逆转录试剂盒购自美国 Invitrogen 生
命技术有限公司(以下简称 Invitrogen公司); DNA凝
胶回收试剂盒购自北京天根公司; 其他生化试剂为国
产分析纯。带 Patatin启动子(2 500 bp)的载体 pBIC由
甘肃农业大学司怀军教授惠赠 ; 植物表达载体
pBI121g-35S由 pBI121改进而来, 与 pBI121的差别在
于 NOS终止子 5′端的 Sac I后引入了 Xho I位点[15]。
1.2 马铃薯块茎总 RNA提取与 cDNA合成
利用 PureLink Plant RNA Reagent试剂盒抽提马
铃薯块茎总 RNA。参照 Sambrook等[16]的操作方法,
防止 RNase 污染。将提取的总 RNA 在经焦碳酸二
乙酯(DEPC)处理的 1%琼脂糖凝胶上电泳, 以溴化
乙锭 (EB)染色后检查 RNA 的完整性。利用
Superscript III逆转录试剂盒, 其中以Oligo(dT)20为
引物, 在 M-MLV 反转录酶作用下合成 cDNA 第 1
链 , 具体操作过程见试剂盒说明书并在–20℃下保
存 cDNA第 1链。
1.3 马铃薯颗粒结合淀粉合酶基因(GBSSI)引物
设计及克隆
根据已报道的颗粒结合淀粉合酶基因(GenBank
登录号为 X58453)的编码序列, 用 Oligo6.0 设计 1
对引物 P1 (表 1), 由北京赛百盛公司合成。PCR反
应体系为 25 L, 由 cDNA模板 2 L、10×buffer 2.5
L、10 mmol L–1的 N-端和 C-端引物各 1 L、Taq
DNA聚合酶 0.5 L、ddH2O 17 L组成。扩增条件
为 94℃预变性 1 min; 94℃变性 50 s, 53℃退火 50 s,
72℃延伸 2 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min; 扩增
第 7期 刘玉汇等: 马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建 1189
产物经 EB染色后在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
将扩增得到的目的片段用琼脂糖凝胶试剂盒回
收纯化, 并与 pGEM-T Easy Vector载体连接, 转化
感受态细胞, 对所获得的白斑通过滞后质粒、PCR
扩增、Xho I和 BamH I双酶切鉴定, –80℃下保存。
并送阳性克隆 10个样品 (pGBSS)到生工生物工程
(上海)有限公司进行 DNA测序。
1.4 马铃薯块茎 GBSSI基因的序列分析
用 DNAMAN version 6.0 软件分析所测序列;
用 ClustalW2 网站的软件比对氨基酸序列 ; 用
MEGA4.0 进行相似序列进化树分析 ; 采用 NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)
保守功能区 (conserve domain)在线分析马铃薯
GBSSI 的保守序列; 用 PredictProtein Server网站分
析蛋白质二级结构; 将 GBSSI 氨基酸序列提交至
Phyre 网站, 进行 GBSSI 蛋白质三级结构预测及比
对分析, 并用 Rasmol2.6软件查看 GBSSI三级结构。
1.5 RNAi目标区段选择、引物设计及亚克隆
1.5.1 正义基因片段 gbss A和反义基因片段 gbss B
的 PCR扩增 根据 GenBank公布的 GBSSI序列,
以及 siRNA设计原则[17], 通过分子生物学分析软件
Oligo 6.0设计两对引物 P2 (gbss A)和 P3 (gbss B),
以克隆的 pGBSS 质粒为模板, 扩增反应体系为 25
μL, 由 cDNA模板 2 μL、10×buffer 2.5 μL、10 mmol
L–1 dNTP 1 μL、10 mmol L–1引物 p1 1 μL、10 mmol
L–1引物 p2 1 μL、Taq DNA聚合酶 0.5 μL、ddH2O 17
μL组成。扩增条件为 94 1 min; 94 50 s, 53 50℃ ℃ ℃
s, 72 2 min; 30℃ 个循环, 72 10 min; 4℃ ℃保存。扩
增产物经琼脂糖凝胶纯化回收后克隆到 pGEM-T
Easy 载体上, 经 PCR、酶切检测, 将正确的阳性克
隆分别命名为 pTg A/pTg B。
1.5.2 马铃薯 VP1-ABI3-like protein 基因内含子片
段(简称 VP1 intron)的克隆 根据 GenBank 公布
的马铃薯 VP1-ABI3-like protein基因内含子序列, 设
计 1 对引物(P4), 扩增反应体系同 1.5.1。扩增条件
为 94℃预变性 1 min; 进行 94 50 s, 49.5 50 s, ℃ ℃
72 2 min℃ , 30个循环; 再在 72℃下延伸 10 min, 4℃
保存。扩增产物经琼脂糖凝胶纯化回收后克隆到
pGEM-T Easy Vector载体上, 经 PCR、酶切检测, 正
确的阳性克隆被命名为 pTin。
表 1 目的基因 PCR扩增引物
Table 1 Specific PCR primers for target genes
基因
Gene
引物序列
Primers sequence (5–3)
退火温度
Annealing temperature ( )℃
产物长度
Length of product (bp)
P1 F: CGctcgag(Xho I)ATGGCAAGCATCACAGCTTCACAC 53.0 1824
R: CGggatcc(BamH I)GGGAGTGGCTACATTTTCCTTGGC
P2 F: GCggatcc(BamH I)GCTTTCTGCATCCATAACATTG 50.0 542
R: GCctgcag(Pst I)TTTTTGCCAGTTCCAAGGACT
P3 F: GCctcgag(Xho I)GCTTTCTGCATCCATAACATTG 50.0 542
R: GCaagctt(Hind III)TTTTTGCCAGTTCCAAGGACT
P4 F: GCctgcag(Pst I)CAGACAAAAGACAGGTTCGTT 49.5 237
R: GCaagctt(Hind III)TTACAATTACTATAGCGGGTGATTT
1.6 中间过渡载体及 RNAi载体的构建
用 Hind III和 BamH I双酶切 pBIC, 回收 pBIC
的小片段 (Patatin), 与经同样酶切并回收的载体
pBI121g-35S 连接 , 转化大肠杆菌 DH5α, 构成
pBI121g-P植物表达载体, 将 35S启动子换为 Patatin
启动子。
用 BamH I和 Pst I同时双酶切质粒 pTgA, 回收
pTgA 的小片段(gbss A), 与经同样酶切并回收的载
体 pBluescript SK(+)连接, 转化大肠杆菌 DH5α, 得
到重组质粒 pSKgA; 用 Pst I和 Hind III同时双酶切
pTin 质粒, 回收 pTin 的小片段(VPl intron), 与经同
样酶切并回收的载体 pSKgA 连接, 转化大肠杆菌
DH5α, 得到含有正向 gbss (gbss A)及内含子片段的
质粒 pSKgAI; 用 Xho I和 Hind III消化质粒 pTgB,
回收 pTgB 的小片段(gbss B), 与经同样酶切并回收
的载体 pSKgAI 连接, 转化大肠杆菌 DH5α, 完成
“正向 gbss片段(gbss A)+VPl intron +反向 gbss片段
(gbss B)”拼接克隆, 命名为 pSKgABI。
用BamH I+Xho I酶切 pSKgABI, 回收 pSKgABI
的小片段(gbssA+VPl intron+ gbss B), 与经同样酶切
并回收的载体 pBI121g-P 连接, 转化大肠杆菌 DH5α,
构成具有 Patatin 启动子驱动的表达载体 pBI121g-
1190 作 物 学 报 第 38卷
PgABI。
2 结果与分析
2.1 总 RNA的提取及 GBSSI基因的克隆
本研究用 Invitrogen公司的 PureLink Plant RNA
Reagent 提取试剂盒进行块茎总 RNA 的提取, 琼脂
糖凝胶电泳结果显示总 RNA 的 5S、18S 和 28S 的
带清晰、完整。利用 cDNA 第 1 链合成试剂盒, 在
反转录酶 M-MLV 的作用下, 获得了马铃薯块茎的
cDNA 第 1 链。根据已发表的马铃薯 GBSSI 基因序
列, 利用 P1 特异性引物, 以 cDNA 第 1 链为模板,
在 Taq DNA聚合酶的作用下进行 PCR扩增, 期望获
得约 1 824 bp大小的 DNA片段。对扩增产物电泳检
查结果表明, 其大小与预期片段基本一致(图 1), 说
明可能获得了 GBSSI基因的 cDNA克隆。将扩增获
得的 GBSSI基因片段与 T载体连接。蓝白斑筛选后,
进行滞后质粒筛选, 然后利用 PCR及 BamH I和 Xho
I双酶切鉴定(图 2), 结果显示, 切下约 1 824 bp大小
的 DNA 片段, 由此可初步确定目的片段已连接到
pGEM-T Easy Vector载体上, 将其定义为 pGBSS。
图 1 马铃薯 GBSS I基因的 PCR扩增
Fig. 1 PCR amplification of GBSSI gene
M: marker III分子量标记; 1~2: PCR扩增产物。
M: DNA marker III; 1–2: PCR products.
图 2 白斑滞后质粒的 BamH I和 Xho I酶切鉴定
Fig. 2 Identification of white spots plasmid digested by
BamH I and Xho I
2.2 GBSSI基因的 cDNA序列及蛋白序列分析
2.2.1 GBSSI基因的 cDNA序列分析 将 pGBSS
质粒交上海生工公司测序。测序结果与原序列(登录
号为 X58453)比较后发现, 二者同源性达 99.78%,
根据 ProtParam软件预测表明, 克隆到的GBSSI相似
基因序列其开放阅读框架为 1 824 bp, 编码 607个氨
基酸和 1个终止密码子(TAA)(图 3)。将该基因登记
在 GenBank中, 登录号为 EU403426。
该蛋白在第 57~59、66~68、121~123、313~315、
362~364、435~437、510~512 和 567~569 处具有蛋
白激酶 C功能, 能将靶蛋白的 Ser/Thr磷酸化, 从而
激活细胞质中某些酶的活性 , 参与生化反应调控 ;
还可与核中转录因子相互作用 , 参与基因表达调
控。在第 364~370 氨基酸处, 该蛋白具有 1 个酪氨
酸蛋白激酶磷酸化位点, 可经自身的酪氨酸磷酸化
或各种不同靶蛋白的酪氨酸磷酸化实现信号传递 ,
其转导的信号通常与细胞生长、繁殖、分化、生存
有关。此外 , 该蛋白分别在第 16~19、271~274、
329~332、374~377、480~483、510~513和 585~588
个氨基酸残基处还具有 7个酪蛋白激酶 II磷酸化位
点, 在细胞生存、生长、增殖及凋亡过程中具有重
要的功能; 第 31~34和第 213~216个氨基酸处具有 2
个 N 端糖基化位点, 使蛋白质能够抵抗消化酶的作
用、赋予蛋白质传导信号的功能、或某些蛋白只有
在糖基化之后才能正确折叠; 2个酰胺化位点位于第
299~302和第 435~438个氨基酸处; 7个 N端酰基化
位点分别在第 70~75、105~110、250~255、309~314、
348~353、506~511和 581~586个氨基酸处。
用 DNAMAN软件对该序列与 GenBank中登记
的部分物种的 GBSSI基因的 cDNA序列进行同源性
比较, 并对其氨基酸序列与其他物种 GBSS 蛋白用
MEGA4.0构建进化树(图 4), 结果发现, 该序列与已
登记的马铃薯 GBSSI 基因的同源性高达 99%以上,
但与其他科植物同源性较低, 其中, 与旋花科甘薯
和大戟科木薯的同源性相对较高, 其次为十字花科
拟南芥和豆科类作物, 而与禾本科作物的同源性较
低。15 个物种的 GBSS 蛋白被聚为 7 个类群, 茄科
马铃薯与旋花科甘薯和大戟科木薯聚为一类; 豆科
的豌豆、大豆和菜豆聚为一类; 豆科的黄芪和豇豆
聚为一类 ; 禾本科单子叶的小麦和大麦聚为一类 ;
禾本科单子叶的粟和高粱聚为一类; 禾本科单子叶
的玉米和水稻聚为一类; 十字花科的拟南芥单独为一
类, 基本表现为属内同源性高, 属间相对低的特点。
第 7期 刘玉汇等: 马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建 1191
图 3 马铃薯 GBSS I基因的 cDNA序列及其推测的氨基酸序列
Fig. 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of GBSSIcDNA of S. tuberosum
□: 蛋白保守区; : 蛋白激酶 C磷酸化酶位点; 【】: 酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点; { }: 酪蛋白激酶 II磷酸化位点; : N端糖基化位
点; : 酰胺化位点; ■: N端酰基化位点。
□: protein conserved region; : protein kinase C phosphorylation site; 【】: tyrosine kinase phosphorylation site; { }: casein kinase II
phosphorylation site; : N-glycosylation site; : amidation site; ■: N-myristoylation site.
1192 作 物 学 报 第 38卷
图 4 马铃薯 GBSS与已知 GBSS类基因氨基酸同源性比对树状图
Fig. 4 Phylogenetic tree based on the amino acid homologues of GBSS and some GBSS genes alignment documented
进化树分支上的数字代表 Bootstrap值(重复抽样次数为 1000), 直线标尺代表 5%序列差异。
Numbers on branch nodes are bootstrap values (1000 resamplings). Bar represents 5% sequence divergence.
2.2.2 GBSSI 蛋白质序列特征分析 运用 NCBI
的 Conserved Domains 工具分析克隆基因保守结构
域, 发现了 3个完全保守区, 即 Glycos_transf_1 (糖
基转移酶 glycosyl transferase)、glgA (糖原/淀粉合酶
glycogen/starch synthases, ADP-glucose type) 和
Glyco_transf_5 (淀粉合酶催化区 starch synthase
catalytic region), 分别在 97~101 (GGLGD)、480~490
(SRFEPCGLXQL)和 503~510 (STGGLVDT)氨基酸
残基处 , 说明这些区域具有十分重要的功能 , 如
glgA为 ADP_葡萄糖结合位点[18-19]。
2.2.3 蛋白质二级结构和三级结构预测 通过
PredictProtein Server 网站的相关软件分析发现, 组
成GBSSI蛋白的 607个氨基酸中, 169个氨基酸可能
形成 α 螺旋结构, 115 个氨基酸可能形成 β 折叠片,
323 个氨基酸可能形成无规则卷曲, 将 GBSSI 氨基
酸序列提交至 Phyre, 用 PSI-Blast 方法进行多序列
比对建模, 对其进行比对分析后选取 d1rzua (糖原合
酶 glycogen synthase 1)—GlgA from Agrobacterium
tumefaciens (31% i.d., E-value=0, Estimated precision
=100%)作为模板进行 GBSSI 蛋白三级结构预测分
析, 将 Phyre网站返回的 d1rzua模板和 GBSSI模型
用 Rasmol软件查看, 结果发现两者单体结构十分相
似(图 5), 表明马铃薯GBSSI蛋白与原核生物农杆菌
的淀粉合酶可能具有相同的功能。
图 5 d1ruza单体三级结构(左)与预测的 GBSSI单体三级结构
(右)比较
Fig. 5 Monomer 3D structure of d1ruza (left) and GBSSI
(right)
2.3 RNAi 目标区段基因的克隆及 RNAi 载体的
构建
2.3.1 马铃薯 GBSSI基因正反义片段的克隆 以
克隆的 GBSSI 基因的质粒 pGBSS 为模板、P2、P3
为引物分别进行 PCR扩增, 分别获得 542 bp左右的
条带, 长度与目标片段长度一致, 回收纯化后分别
与 pGEM-T Easy Vector连接转化 DH5α, 进行 BamH
第 7期 刘玉汇等: 马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其 RNAi载体的构建 1193
I和 Pst I和 Xho I和 Hind III酶切鉴定。以马铃薯基
因组 DNA 为模板, P4 为引物进行 PCR 扩增, 获得
237 bp 左右的条带, 长度与目标片段长度一致, 回
收纯化后分别与 pGEM-T Easy Vector 连接转化
DH5α, Pst I和 Hind III双酶切鉴定。
gbss A与克隆载体 pBluescript SK(+)的重组, 用
BamH I 和 Pst I 酶切鉴定, 构建重组质粒 pSKgA;
gbss A与 VPl intron的拼接, 用 BamH I和 Hind III
双酶切鉴定以及 Pst I和 Hind III双酶切鉴定, 构成
含有“gbssA+VPl intron”的质粒 pSKgAI; gbss A+VPl
intron+gbss B的拼接, 用 BamH I和 Xho I双酶切鉴
定、Xho I 和 Hind III 酶切鉴定(图 6 和图 7), 完成
“gbss A+VPl intron+gbss B”的 ihpRNAi结构, 命名
为 pSKgABI; 用 patatin启动子替换掉 pBI121g- 35S
的 35S启动子, 经 Hind III和 BamH I酶切鉴定(图
8), 命名为 pBI121g-P; 用 BamH I+Xho I 酶切
pSKgABI 和 pBI121g-P, 回收 pSKgABI 的小片段
(gbss A+VPl intron+gbss B)及 pBI121g-P的大片段,
图 6 用 BamH I和 Xho I鉴定重组质粒 pSKgABI (gbss
A+intron+gbss B)
Fig. 6 Digestion of the recombinant plasmid pSKgABI by
BamH I and Xho I
M: DNA marker III; 1, 2, 4: pBluescript SK(+)+ gbss
A+intron+gbss B; 3: false positive plasmid.
图 7 用 Xho I和 Hind III鉴定重组质粒 pSKgABI (gbss B)
Fig. 7 Digestion of the recombinant plasmid pSKgABI by Xho
I and Hind III
M: DNA marker I; 1, 2, 4: pBluescript SK(+)+ gbss A+intron+gbss
B; 3: false positive plasmid.
图 8 用 Hind III和 BamH I鉴定表达载体 pBI121g-P
Fig. 8 Digestion of pBI121g-P by Hind III和 BamH I
M: DNA marker III; 1, 2: pBI121g-P; 3: absence; 4: pBIC.
图 9 用 Bam HI和 Xho I鉴定表达载体 pBI121g-PgABI
Fig. 9 Digestion of pBI121g-PgABI by Bam HI and Xho I
M: DNA marker III; 1–4: pBI121g-PgABI.
利用 T4 DNA 连接酶进行粘端连接, 连接产物转化
大肠杆菌 DH5α 的感受态细胞。转化细胞在 LB 固
体平板上进行 50 mg L–1 的 Kan 筛选后, 再进行
PCR、酶切鉴定(图 9), 构成具有 Patatin启动子驱动
的表达载体 pBI121g-PgABI, 其结构如图 10所示。
3 讨论
本试验根据已发表的马铃薯 GBSSI 基因序列,
采用 RT-PCR技术克隆到 GBSSI相似基因, 利用生
物信息学方法分析发现 , 该基因具备一个完整的
开放阅读框架 , 大小为 1 824 bp, 编码 607个氨基
酸, 具 3 个保守功能区域, 存在着许多重要功能位
点。三级结构预测结果表明该蛋白具有淀粉合成功
能, 以上信息可为 RNAi 目标片段的选择提供预测
参考。
在 RNAi技术上, Hammond等[20]认为干扰片段
在 300~500 bp之间干扰效果好, 太长或太短干扰效
果都不太好, 而且靶基因序列长度与载体的填充片
段长度有关, 若载体填充片段较长, 目的基因片段
太短就不能形成发夹结构[21]。Burch-Smith等[22]认为
所选最适片段长度应为 200~600 bp, 而在干扰片段
1194 作 物 学 报 第 38卷
图 10 pBI121g-PgABI表达框架示意图
Fig. 10 Structure map of pBI121g-PgABI expressing framework
区域的选择上要求不干扰其他基因的表达。因此 ,
本研究通过对 GBSSI 蛋白的结构分析, 选取 GBSSI
基因保守区的 542 bp的靶标序列作为干扰区段, 扩
增 GBSSI的正反向基因片段, 分别与 pGEM-T Easy
Vector 重组。之后进行一系列的酶切、连接、转化
操作, 分别将正反向基因和内含子与酶切位点相对应
的中间克隆载体 pBluescript SK(+)重组, 成功构成载
体 pSKgABI。引入内含子的设计是为了使其形成发夹
结构, 高效表达 dsRNA, 之后将 pSKgABI 中的“正义
基因片段 gbssA-内含子 VP1-ABI3-like protein-反义基
因片段 gbssB”片段插入到 pBI121g 植物表达载体中,
成功构建 RNAi干扰载体 pBI121g-PgABI。
多项研究结果表明, 反义 GBSSI 基因或 RNAi
沉默 GBSSI基因, 可显著提高植株的支链淀粉含量,
培育糯质型作物新品种[23]。Visser等[24]、Salehuzza-
man等[25]和 Kuipers等[8]利用反义 RNA技术抑制了
马铃薯块茎中 GBSS 的表达, 发现直链淀粉含量减
少 , 而支链淀粉含量显著升高。但由于采用反义
RNA 抑制技术获得的转基因植株中能够有效抑制
靶标基因表达的植株的比例很小 , 仅为 3%~
15%[26]; 而采用RNAi技术, 可引起靶基因 85%以上
甚至 100%的沉默[10], 其抑制效率比单独应用正义
或反义 RNA强 10倍以上[27], 因此利用 RNAi 技术
在 RNA 水平抑制基因的表达成为一种高效的基因
功能研究方法 , 已有大量研究证实 RNAi 可以特
异性抑制特定基因的表达, 成为研究基因功能的良
好工具[28-29]。
在农业上 RNAi 技术已发展成为控制病虫
害[30-31]、抗逆[32]、提高作物品质[12,33]、功能基因组
研究及代谢途径分析[11]的新方法。有关利用 RNAi
技术进行淀粉品质改良的报道较多, 但主要集中在
小麦、水稻、玉米、甘薯上, 操作基因多为 SBE, 还
未见有利用 RNAi 技术沉默马铃薯块茎 GBSSI 基因
的报道。本研究构建含有 GBSSI 基因保守序列的
RNAi 植物表达载体, 有望提高马铃薯支链淀粉的
含量或者创造出纯支链淀粉的新种质资源。目前 ,
我们准备转化淀粉含量较高的优良马铃薯材料, 以
便选育出高支链淀粉或纯支链淀粉的适宜加工的新
型马铃薯品种。
4 结论
获得的马铃薯块茎 GBSSI相似基因与已发表的
GBSSI 基因(GenBank 登录号为 X58453)序列相似性
达 99.78%, 其开放阅读框长 1 824 bp, 编码 607个氨
基酸, 存在蛋白激酶 C、酪氨酸蛋白激酶磷酸化、
酪蛋白激酶 II磷酸化、糖基化、酰胺化和酰基化等
功能位点。该蛋白具有淀粉合成功能, 基因序列已
注册到 GenBank, 序列登录号为 EU403426, 以此为
靶序列, 选择 GBSSI基因保守序列区的 542 bp区段,
构建了 Patatin启动子驱动的干扰表达载体。
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