全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(3): 459−468 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30960181, 30560070)和广西大学科研基金(XJZ100341)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何龙飞, E-mail: lfhe@gxu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: may2399@163.com
Received(收稿日期): 2010-08-24; Accepted(接受日期): 2010-12-03.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00459
硝普钠缓解花生铝毒害作用和影响 AhSAG和 AhBI-1基因表达
詹 洁 1,2 王天菊 1 何虎翼 1 李创珍 1 何龙飞 1,*
1 广西大学农学院, 广西南宁 530004; 2广西大学国防教育学院, 广西南宁 530004
摘 要: 以花生为材料, 研究了铝胁迫诱导花生发生细胞程序性死亡的条件下, 加入外源 NO 供体硝普纳(SNP)对不
同耐性花生品种根尖生长及相关细胞程序性死亡基因的影响。根长生长、根尖苏木精染色和铝含量测定结果表明, 适
当浓度的 SNP 能够缓解一定浓度铝对花生根生长的毒害作用, 1.0 mmol L−1 的 SNP 缓解作用最明显, 此浓度下,
99-1507和中花 2号与对照相比, 根长分别增加 45%和 52%, 根尖铝含量分别降低 10%和 23%, 苏木精染色变浅。加
入 1.0 mmol L−1的 SNP处理后, 与对应铝胁迫相比, 花生衰老基因 AhSAG的相对表达量在耐铝品种 99-1507中先升
高后降低, 0.1 mmol L−1和 0.4 mmol L−1 Al3+处理时显著下降; 在铝敏感品种中花 2号中呈缓慢升高的趋势, 0.1 mmol
L−1和 0.4 mmol L−1 Al3+处理时显著上升。花生细胞程序性死亡相关基因 AhBI-1的相对表达量在 99-1507中呈先升高
后降低的趋势, 在中花 2号中则先降低后升高, 当 99-1507在 0和 0.02 mmol L−1 Al3+处理时, 中花 2号在 0、0.02和
0.10 mmol L−1 Al3+处理时, SNP处理后的 AhBI-1表达量均低于对应的单独铝处理。由此说明, NO对花生铝毒害有一
定的缓解作用, 其作用机理可能与影响细胞程序性死亡基因表达而调控细胞程序性死亡有关。
关键词: 一氧化氮; 花生; 铝胁迫; 缓解效应; 基因表达
Effects of SNP on AhSAG and AhBI-1 Genes Expression and Amelioration of
Aluminum Stress to Peanut (Arachis hypoganea L.)
ZHAN Jie1,2, WANG Tian-Ju1, HE Hu-Yi1, LI Chuang-Zhen1, and HE Long-Fei1,*
1 College of Agronomy, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2 College of National Defense Education, Guangxi University, Nanning 530004,
China
Abstract: Nitric oxide (NO) plays an important role in mediating some biotic and abiotic stress-induced oxidative stresses in plant
kingdom. Aluminum (Al) toxicity is a major constraint for crop production in acidic soils worldwide, especially in southern China.
Using sodium nitroprusside (SNP) as the NO donor, we evaluated the effect of NO on root elongation and the expression levels of
related genes in peanut seedlings under different Al3+ stress. The results showed that exogenous NO in proper concentration could
alleviate Al toxicity in root tips of peanut, especially at 1.0 mmol L–1 SNP. SNP at 1.0 mmol L–1 enhanced root growth of 99-1507
(Al-resistant) and Zhonghua 2 (Al-sensitive) by 45% and 52%, respectively. After SNP (1.0 mmol L–1) treatment, the Al3+ con-
tents in root tips were decreased by 10% and 23% in both cultivars, respectively. Simultaneously, the color of root tips dyed with
hematoxylin became lighter. Compared to Al stress only, the relative expression levels of AhSAG gene in 99-1507 under 0.1 and
0.4 mmol L–1 Al3+ were increased at begining and then decreased significantly after adding SNP. In Zhonghua 2, the expressions
of AhSAG gene appeared in slow increases when SNP (1.0 mmol L–1) was added, and the increases were significant under 0.1 and
0.4 mmol L–1 Al3+ treatments. Compared with Al stress only, the relative expression level of programmed cell dealth
(PCD)-related gene, AhBI-1, showed an increase–decrease trend in 99-1507 and a reverse change in Zhonghua 2 after SNP was
added at 1.0 mmol L–1. The relative expressions of AhBI-1 gene were lower in the Al + SNP treatments than in the single Al
treatments at Al3+ concentrations of 0 and 0.02 mmol L–1 in 99-1507, whereas they were lower in the Al + SNP treatments than in
the single Al treatments at Al3+ concentrations of 0, 0.02, and 0.1 mmol L–1 in Zhonghua 2. The results showed that NO can
alleviate Al toxicity in peanut, and the possible mechanism is that NO regulates the expression levels of PCD-related genes.
Keywords: Nitric oxide; Peanut (Arachis hypoganea L.); Aluminum stress; Ameliorating effect; Gene expression
460 作 物 学 报 第 37卷
植物受逆境胁迫后, 可通过信号因子诱导植物
体的特定部位发生细胞程序性死亡(programmed cell
death, PCD), 从而避免逆境对其他组织的伤害, 获
得对不良环境的适应性 [1]。一氧化氮(nitric oxide,
NO)、活性氧、Ca2+、乙烯、水杨酸等是环境胁迫诱
导植物 PCD的重要信号分子[1-2], 而 NO是生物体中
一种重要的氧化还原信号分子和毒性分子, 广泛存
在于植物组织中[3], 参与植物衰老[4]、呼吸作用、光
形态建成[5]、胁迫响应[3]、PCD[6]和抗病防御反应[7]
等过程。近年来, NO已成为植物抗逆性的研究热点。
高浓度外源 NO可以减缓铝对芙蓉葵的毒害作用 ,
低浓度则无效[8]。NO可作为抗氧化剂和抗凋亡物质
抑制 PCD的发生[6]。作为抗氧化剂, NO阻止活性氧
或病原菌前体处理引起的马铃薯叶片细胞死亡 [9],
延缓大麦糊粉层 PCD 发生 [ 6 ]。NO 供体硝普钠
(sodium nitroprusside, SNP)预处理能够减轻铝对决
明、小麦和黑麦等根伸长生长的抑制作用[10-12]。但
是, 当用丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)感染
豌豆悬浮细胞时, NO 和活性氧含量升高, 启动 HR
和 PCD[13], NO和活性氧可触动无毒病原体HR反应,
并激活衰老相关的标志基因[14]。因此, NO 可能是
PCD 的内源调节因子[6], 启动[13]或延缓[9]PCD 发生,
但其发生作用方式可能与胁迫条件有关。
我国南方花生种植面积占全国面积的 30%左右,
这些地区红黄壤分布广, 土壤交换性铝占阳离子交
换量的 20%~80%, 花生生长发育受铝毒危害, 平均
减产 20%以上, 是该区域长期以来花生单产一直低
于全国平均水平的重要原因[15-16]。然而, 对花生铝
毒害研究不多, 已有研究主要集中于耐铝基因型的
筛选、铝对形态、发育和生理的影响、离子吸收、
有机酸分泌等[17-21], 对 Al毒害及耐性机制的研究和
认识较少[22], 特别是对氧化胁迫、信号因子和信号
转导途径等还未见报告。尽管 NO 对植物有保护作
用, 缓解逆境胁迫已有报告[10-11,23-27], 但 NO是否能
够缓解铝对花生的毒害作用, 是否通过影响基因表
达, 调节 PCD 的发生来缓解铝毒害的影响, 还未见
报告。为此, 以花生为材料, 研究了外源 NO对铝毒
害的缓解效应及对 PCD相关基因表达的影响, 以期
为阐明植物铝毒害和耐性机制提供进一步证据。
1 材料与方法
1.1 材料的准备和处理
已通过 DNA 梯、显微结构、AO/EB 染色、原
位末端标记(TUNEL)等检测, 系统证实铝能够诱导
花生根尖细胞 PCD及其发生条件, 并阐明铝诱导花
生根尖 PCD与耐铝能力呈负相关, 并选择 0、0.02、
0.10、0.40 mmol L−1处理 4 d为试验的胁迫条件(资
料待发表)。
参照詹洁等[16]方法, 将供试花生种子于粗沙中
26℃催芽 4 d, 去种皮, 移栽到改良的Hoagland营养
液中培养, 每 2 d更换一次营养液。花生幼苗抽出第
二片真叶后, 在含有 0.5 mmol L−1 CaCl2 (pH 4.2~4.3)
的溶液中预处理 24 h。对培养好的幼苗分别表 1所
列进行处理。
1.2 幼苗根伸长量的测定
参照詹洁等[16]方法, 在加入 SNP上海生工生物
工程有限公司)前, 确定测量的基点。测量从基点到
根尖顶端的距离 , 然后将根置不同处理液中处理
表 1 花生幼苗处理
Table 1 Treatments of peanut seedlings (mmol L−1)
品种
Variety
处理 1: 含 0.4 mmol L−1 Al3+的 SNP浓度
Treatment 1: SNP concentration with 0.4 mmol L−1 Al3+
处理 2: 含 1.0 mmol L−1 SNP的 Al3+浓度
Treatment 2: Al3+ concentration with 1.0 mmol L−1 SNP
0 0
0.1 0.02
1.0 0.10
2.0 0.40
99-1507[22]
(耐铝品种)
99-1507
(Al resistance)
5.0 1.00
处理 3: 含 0.1 mmol L−1 Al3+的 SNP浓度
Treatment 3: SNP concentration with 0.1 mmol L−1 Al3+
处理 4: 含 1.0 mmol L−1 SNP的 Al3+浓度
Treatment 4: Al3+ concentration with 1.0 mmol L−1 SNP
0 0
0.1 0.02
1.0 0.10
2.0 0.40
中花 2号[22]
(铝敏感品种)
Zhonghua 2
(Al sensitive)
5.0 1.00
第 3期 詹 洁等: 硝普钠缓解花生铝毒害作用和影响 AhSAG和 AhBI-1基因表达 461
4 d, 再测量该距离 , 两次测量值之差即为幼苗根
伸长量。对每个品种每个处理测 15株幼苗。重复 3
次。
相对伸长率(%) = 处理的根伸长量/对照的根伸
长量×100
1.3 苏木精染色
参照詹洁等[16]方法, 将处理后的根尖在去离子
水中浸洗 15 min, 洗去表面残留的溶液, 置 0.1%苏
木精染液中(含 0.01% KIO3)染色 20 min, 再以去离
子水中浸洗 10 min, 观察并照相。
1.4 铝含量测定
参考何斌等[28]的方法, 将处理后的根尖在去离
子水中浸洗 15 min, 切取相同量的根尖, 称重, 转
入 2.0 mol L−1 HNO3 1.5 mL中浸泡 24 h。将浸泡液
全部转入 25 mL容量瓶, 依次加入 0.1 mol L–1 HNO3
1.0 mL, 0.005 mol L–1 CTMAB (溴化十六烷基三甲
胺) 2.0 mL, 0.05 mol L–1 EDTA-Zn 2.0 mL, 摇匀并
放置 2 min, 再加 0.05%铬天青 S显色剂 2.0 mL, 4.0
mL 40%六次甲基四胺溶液 , 以去离子水稀释至刻
度, 摇匀, 20~30℃下静置 20 min。以试剂空白为对
照, 于 635 nm处测定吸光度。计算铝含量。
1.5 花生根尖 RNA的提取
将处理好的根尖剪下约 1 cm, 约 0.2 g, 加液氮
磨样, 以 Trizol法提取 RNA。
1.6 反转录
使用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit
(#1621, Fermentas), 以 oligoT18为引物进行反转录,
具体操作步骤如说明书。
1.7 实时荧光定量 PCR
前期试验表明, 与耐铝品种 99-1507相比, 诱导
铝敏感品种中花 2号根尖 PCD发生的铝浓度低, 发
生时间早, PCD 发生与花生耐铝能力负相关。克隆
到铝胁迫花生根尖细胞产生 PCD时的 2个相关基因
AhSAG 和 AhBI-1。表达分析发现, 高铝浓度(0.10
mmol L−1和 0.40 mmol L−1)诱导花生(99-1507和中花
2号) AhSAG 基因表达增加和 PCD的发生。在 0.10
mmol L−1和 0.40 mmol L−1Al3+处理下, AhBI-1基因
在铝敏感性品种中花 2 号中的表达极显著低于耐铝
性品种 99-1507, 诱使 PCD 的早发生, 说明 AhBI-1
基因在铝诱导 PCD 中的负调控作用(资料待发表)。
根据序列设计引物(表 2), 使用 Hot Start Fluorescent
PCR Core Reagent Kit (BS643, BBI), 选用花生 Actin
基因做内参, 进行 RT-FQ PCR (Real-time Fluorescent
Quantitative PCR)。
PCR扩增体系 25 μL, 含 Hotstart Fluo-PCR Mix
12.5 μL、10 pmol正向和反向引物、模板 0.5 μL。反
应程序为 94℃预变性 5 min; 94℃ 20 s, 53.2℃ 20 s,
72℃ 20 s, 共 50 个循环, 循环结束后 72℃延伸 5
min。根据 2–ΔΔCt法计算相对表达量。
1.8 统计分析
采用 Microsoft Excel 处理试验数据 , 采用
DPS3.1数据统计系统软件, 以 LSD法检验差异性。
表 2 本研究所用的引物
Table 2 Primers used in this work
引物名称
Name of primers
引物序列
Sequence of primers (5′→3′)
大小
Size (bp)
用途
Application
AH-Actin-F ACCTTCTACAACGAGCTTCGTGTG
AH-Actin-R GAAAGAACAGCCTGAATGGCAAC
200 花生内参 Actin PCR扩增
PCR amplification of control Actin in peanut
AhSAG-F CCTCCGATTCACGGAATAAG
AhSAG-R AGGTGTAGGATAAGTGGGAGC
86 AhSAG荧光定量 PCR扩增
PCR amplification of AtSAG gene in qRT-PCR
AhBI-F ATCTGGTGTCTCCCTCATGTGG
AhBI-R ACAGAGTCATGGCATGCTTCAC
188 AhBI荧光定量 PCR扩增
PCR amplification of AtBI gene in qRT-PCR
2 结果与分析
2.1 SNP对花生根伸长生长的影响
在一定铝浓度处理下, SNP对 Al毒害有缓解作
用。从图 1可见, 0.4 mmol L−1 Al3+条件下, 与对照相
比, 外加 SNP 处理的花生根生长发生了变化, SNP
浓度为 0.1 mmol L−1和 1.0 mmol L−1时, 99-1507根
伸长高于对照, 分别增长 15%和 45%, 在 SNP为 1.0
mmol L−1时差异显著, 但 SNP浓度过高则抑制根伸
长。进一步检测显示 1.0 mmol L−1 SNP对大于 0.1
mmol L−1浓度的 Al3+毒害具有一定缓解作用(图 2)。
与 0.1 mmol L−1 Al3+胁迫对照相比, 加入外源
SNP也能够缓解铝对中花 2号根生长的抑制。加 0.1
mmol L−1 SNP 时, 根长增加 40%, 缓解效果明显;
462 作 物 学 报 第 37卷
1.0 mmol L−1 SNP处理效果最明显, 根长增加 52%;
2.0 mmol L−1 处理与对照接近, 其后表现出抑制作
用(图 3)。
图 1 0.4 mmol L−1 Al3+胁迫 4 d后 SNP对 99-1507根尖生长的
影响
Fig. 1 Effects of SNP on root elongation in 99-1507 under 0.4
mmol L−1 Al3+ stress for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Root elongation marked with a different capital or small letter are
significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the
basis of LSD test, respectively.
图 2 1.0 mmol L–1 SNP对不同铝胁迫 4 d下 99-1507根尖生长
的影响
Fig. 2 Effects of 1.0 mmol L−1 SNP on root elongation in
99-1507 under Al3+ stress for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Root elongation marked with a different capital or small letter are
significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the
basis of LSD test, respectively.
在 1.0 mmol L–1 SNP条件下改变铝浓度, 结果表
明没有铝或铝浓度为 0.02 mmol L–1时, 加入 SNP显著
抑制根生长, 根长降低 21%和 24%; 但在 0.1 mmol L–1
铝时, SNP 则起缓解作用; 进一步提高铝处理浓度,
SNP处理没有明显变化(图 4)。进一步说明适当的 SNP
能够对一定浓度的铝胁迫具有缓解作用。
2.2 根尖染色
通过苏木精染色观测, 花生耐铝品种 99-1507
根尖在 0.4 mmol L–1 Al3+胁迫下, 外加 SNP在中低
浓度时, 颜色由深到浅, 当浓度达到 1.0 mmol L–1时
候, 颜色最浅, 但是随着 SNP 浓度增高, 颜色随着
变深。也表明适当的 SNP可以有效地缓解花生耐铝
品种的铝毒害(图 5)。
通过图 6 可知, 用不同浓度的 Al3+处理 99-1507
根尖时, 外加 1.0 mmol L−1 SNP, 根尖的颜色相对较浅,
但是当 Al3+浓度达 0.4 mmol L−1时, 由于根尖染色较
深, 只能隐约看到根尖着色微小的变化, 当 Al3+浓度
达 1.0 mmol L−1时, 已看不出明显差别。SNP对受到
中低浓度 Al3+毒害的花生耐铝品种有显著缓解效果。
图 3 SNP对 0.1 mmol L−1Al3+胁迫 4 d后中花 2号根尖生长的影响
Fig. 3 Effects of SNP on root elongation in Zhonghua 2 under
0.1 mmol L−1 Al3+ stress for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Root elongation marked with a different capital or small letter are
significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the
basis of LSD test, respectively.
图 4 1.0 mmol L−1SNP对不同 Al3+浓度胁迫 4 d下中花 2号根
尖生长的影响
Fig. 4 Effects of 1.0 mmol L–1 SNP on root elongation in
Zhonghua 2 under Al3+ stress for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Root elongation marked with a different capital or small letter are
significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the
basis of LSD test, respectively.
第 3期 詹 洁等: 硝普钠缓解花生铝毒害作用和影响 AhSAG和 AhBI-1基因表达 463
图 5 0.4 mmol L–1 Al3+加不同浓度 SNP处理 4 d后 99-1507根
尖苏木精染色
Fig. 5 Hematoxylin-strained root tips of 99-1507 treated SNP
in different concentrations and 0.4 mmol L–1 Al3+ for 4 d
A–E: 0, 0.1, 1.0, 2.0, and 5.0 mmol L–1 SNP, respectively.
图 6 1.0 mmol L−1 SNP对不同浓度 Al3+处理 4 d后 99-1507根
尖苏木精染色
Fig. 6 Hematoxylin-strained root tips of 99-1507 treated with
1.0 mmol L–1 SNP under different Al3+ concentrations for 4 d
A~E: 0、0.02、0.1、0.4、1.0 mmol L−1 Al3+; a~e: 分别添加 1.0 mmol
L−1 SNP的 0、0.02、0.1、0.4、1.0 mmol L–1 Al3+ 处理。
A–E: 0, 0.02, 0.1, 0.4, and 1.0 mmol L−1 Al3+, respectively; a–e:
addition of 1.0 mmol L–1 SNP with 0, 0.02, 0.1, 0.4, 1.0 mmol L−1
Al3+, respectively.
中花 2号的根尖苏木精染色结果也表明, 与 0.1
mmol L−1 铝胁迫相比, 添加外源 0.1、0.5 和 1.0
mmol L−1 SNP的根尖着色下降, 明显变浅, 2.0和 5.0
mmol L−1 SNP处理与对照类似。这也表明, SNP可
以有效地缓解铝敏感品种的 Al毒害(图 7)。
图 7 0.1 mmol L–1 Al3+加不同浓度 SNP处理 4 d后中花 2号根
尖苏木精染色
Fig. 7 Hematoxylin-strained root tips of Zhonghua 2 treated
with SNP under different concentrations and 0.1 mmol L–1
Al3+ for 4 d
A–E: 0, 0.1, 1.0, 2.0, and 5.0 mmol L–1 SNP, respectively.
从图 8 可见, 不同铝处理后根尖苏木精染色结
果相比, 加入 1.0 mmol L−1 SNP的中花 2号根尖染
色明显变浅。同样表明, SNP对受到中低浓度 Al毒
害的花生铝敏感品种有显著缓解效果。
2.3 根尖铝含量
与 0.4 mmol L−1铝处理对照相比, 随 SNP处理
浓度增加, 耐铝品种 99-1507 根尖铝含量呈先下降
后上升的趋势, 在 1.0 mmol L−1时, 根尖铝含量降低
10% (图 9)。在 1.0 mmol L−1 SNP条件下, 随着处理
铝浓度增加 , 99-1507 根尖铝含量增加 , 分别为
180.84、364.696、2 260.134、6 613.378和 9 504.414
μg g−1 FW。在低于 0.4 mmol L−1铝时, 根尖铝含量
与对照没有明显差别; 在 1.0 mmol L−1铝时, SNP处
理下根尖铝含量则显著高于对照(图 10)。
从中花 2 号根尖铝含量分析看, 与对照相比,
加入 0.1 mmol L−1和 1.0 mmol L−1 SNP处理的中花 2
号根尖铝含量略有降低, 但不显著; 2.0 mmol L−1和
5.0 mmol L−1 SNP处理后, 铝含量显著增加(图 11)。
在 1.0 mmol L−1 外源 SNP 条件下, 铝处理浓度为
0.02 mmol L−1和 0.10 mmol L−1时, 根尖铝含量低于
对照, 分别降低 59%和 23%, 但 0.4 mmol L−1和 1.0
mmol L−1 铝时, SNP 处理根尖含量则显著增加(图
12), 可能是因为 0.4 mmol L−1和 1.0 mmol L−1铝处
理对铝敏感性品种来说, 是比较严重的胁迫, 通过
添加外源 SNP无法降低其铝含量。
464 作 物 学 报 第 37卷
图 8 不同浓度的 Al3+加 1.0 mmol L–1外源 SNP处理 4 d后中花
2号根尖苏木精染色
Fig. 8 Hematoxylin-strained root tips of Zhonghua 2 treated by
1.0 mmol L–1 SNP and Al3+ with different concentrations for 4 d
A~E: 0、0.02、0.1、0.4、1.0 mmol L–1 Al3+; a~e: 分别添加 1.0 mmol
L–1 SNP的 0、0.02、0.1、0.4、1.0 mmol L–1 Al3+ 处理。
A–E: 0, 0.02, 0.1, 0.4, and 1.0 mmol L–1 Al3+, respectively; a–e:
addition of 1.0 mmol L–1 SNP with 0, 0.02, 0.1, 0.4, and 1.0 mmol
L–1 Al3+, respectively.
图 9 0.4 mmol L–1 Al3+加不同浓度 SNP处理 4 d后 99-1507根
尖的铝含量变化
Fig. 9 Changes of Al3+ contents in 99-1507 root tips treated by
SNP with different concentrations under 0.4 mmol L–1 Al3+
stress for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Al contents in root tips marked with a different capital or small
letter are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability level
on the basis of LSD test, respectively.
图 10 不同浓度的铝加 1.0 mmol L–1 SNP处理 4 d后 99-1507
根尖铝含量的变化
Fig. 10 Changes of Al3+ content in 99-1507 root tips treated
with 1.0 mmol L–1 SNP under different Al3+ concentrations
for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Al3+ contents in root tips with a different capital or small letter are
significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the
basis of LSD test, respectively.
图 11 SNP对 0.1 mmol L–1 Al3+胁迫 4 d下中花 2号根尖铝含量
的变化
Fig. 11 Changes of Al3+ content in Zhonghua 2 root tips
treated with SNP in different concentrations under 0.1 mmol L–1
Al3+ stress for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Al contents in root tips marked with a different capital or small
letter are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability level
on the basis of LSD test, respectively.
2.4 外源 NO对 AhSAG基因表达的影响
与对应铝胁迫下相比, 加入 SNP 处理, 耐铝品
种 99-1507 AhSAG 基因的相对表达量(以相对应的
Al3+为对照, 作为起点 1, 其他同 )呈先升高后降低
的趋势, 在 0和 0.02 mmol L−1 Al3+处理条件下, 其
表达量上升, 分别为 19.48 和 23.53, 在处于中高浓
度 Al3+时 , 其表达量呈剧烈的下降趋势 , 分别为
0.13 和 0.26。而对于铝敏感品种中花 2 号, AhSAG
基因的相对表达量呈缓慢升高趋势, 在 0 和 0.02
mmol L−1 Al3+条件下, 表达量分别是 0.31 和 0.34;
第 3期 詹 洁等: 硝普钠缓解花生铝毒害作用和影响 AhSAG和 AhBI-1基因表达 465
但在处于中高浓度 Al3+时 , 其表达量呈上升趋势 ,
为 1.99和 3.28 (图 13)。
图 12 1.0 mmol L–1外源 SNP对不同浓度铝胁迫 4 d下中花 2
号根尖铝含量的变化
Fig. 12 Changes of Al3+ contents in Zhonghua 2 root tips
treated by 1.0 mmol L–1 SNP and Al3+ with different concentra-
tions for 4 d
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Al content in root tips with a different capital or small letters are
significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the
basis of LSD test, respectively.
图 13 SNP对不同浓度 Al处理下 AhSAG基因表达的影响
Fig. 13 Effects of SNP on AhSAG expression under different
Al3+ treatments
图中不同的大写和小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Relative expressions of AhSAG gene with a different capital or
small letter are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability
levels on the basis of LSD test, respectively.
2.5 外源 NO对 AhBI-1基因表达的影响
与对应铝胁迫下相比, 加入 SNP 处理, 耐铝品
种 99-1507 AhBI-1基因的相对表达量呈先升高后降
低的趋势, 在 0 和 0.02 mmol L−1 Al3+处理条件下,
表达量分别为 0.67和 0.73。但在处于中高浓度 Al3+
处理时, 其表达量呈剧烈的上升趋势, 分别上升了
6.59 倍和 3.89 倍。而对于铝敏感品种中花 2 号,
AhBI-1 基因的相对表达量呈先下降后升高的趋势。
在 0、0.02和 0.10 mmol L−1 Al3+处理条件下, 其表达
量呈下降趋势, 分别为 0.80、0.73和 0.68, 但在处于
高浓度 0.40 mmol L−1 Al3+处理时, 其表达量上升,
达 1.69 (图 14)。
图 14 SNP对不同浓度 Al3+处理下 AhBI-1基因表达的影响
Fig. 14 Effects of SNP on AhBI-1 expression under different
Al3+ treatments
图中不同的大写和小写母分别表示在 0.01和 0.05水平上
差异显著。
Relative expressions of AhBI-1 gene with a different capital or
small letter are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability
levels on the basis of LSD test, respectively.
3 讨论
3.1 外源 NO对铝毒害的缓解作用
根被认为是对铝最敏感的器官, 铝毒害最明显
的症状就是抑制植物根的伸长[1,17-18,29]。NO 是否能
够缓解铝对花生的毒害作用还未见报告。SNP是 NO
的供体, 1 mmol L−1 SNP 能够产生 2 μmol L−1的
NO[30], 因此可以用 SNP处理释放 NO来研究 NO的
作用。通过根生长、铝含量和苏木精染色等测定, 表
明外源 NO 能够缓解一定浓度范围内铝对花生根生
长的抑制作用, 这与 SNP 能有效缓解盐胁迫引起的
氧化损伤, 提高抗盐性[23-24]、减轻铝对决明、小麦
和黑麦等根伸长生长的抑制[10-11]的结果是一致的。
同时, 还表明 SNP 浓度过低或过高都不理想, 过低
时缓解作用不明显, 过高时抑制作用更严重, 这与
外源 SNP低于 0.01 mmol L−1时无法缓解铝胁迫对芙
蓉葵的毒害作用, 0.1 mmol L−1时显著缓解芙蓉葵根
尖生长受到的铝毒害作用[8]的结果是一致的。这一
结果也说明 NO 对生物体具有保护和毒害的双重效
应, 其作用具有浓度依赖性的特点[31]。适当浓度时,
能够迅速消除脂质自由基, 阻断因 O2·–转变成过氧
亚硝酸离子而引发的 PCD[32-33], 而且能调节不同类
466 作 物 学 报 第 37卷
型基因, 包括抗氧化酶基因, 如 CAT、SOD、交替氧
化酶等的表达[34], 从而影响众多生理过程, 具有保
护作用 ; 过高浓度时 , 则与 O2·–相互作用生成
–OONO, 后者质子化再形成具有强氧化性的过氧亚
硝酸, 破坏生物大分子的结构与功能 [31,34], 从而使
根尖的毒害作用加重。
图 12 中, 在中高浓度铝处理敏感品种后, 加入
SNP 处理使根尖铝含量显著增加, 可能是因为 0.4
mmol L–1和 1.0 mmol L–1铝处理对铝敏感性品种来
说是比较严重的胁迫, 通过添加外源 SNP 无法降低
其铝含量。高浓度铝处理后影响了中花 2 号的膜稳
定性和透性, 故外源 NO 对其没有缓解作用, 相反
加深了毒害作用; 而对耐铝品种加入 SNP后, 在中、
高浓度处理后铝含量仍低于不加 SNP 的处理, 但对
于敏感品种在中浓度铝处理前已高于单独铝处理的,
这说明不同耐性品种膜稳定性差异很大, 敏感品种
膜的稳定性差, 更易受铝毒害的影响。
3.2 外源 NO对 AhSAG基因表达量的影响
AhSAG 基因属于衰老诱导增强型基因[35], 前期
试验证实在中、高 Al3+浓度下诱导 AhSAG等衰老基
因超表达, 促进植物早衰, 诱导花生根尖发生 PCD
(资料待发表)。本试验结果表明 SNP影响 AhSAG基
因的表达。耐铝品种 99-1507的 AhSAG基因的相对
表达量先升高后降低, 在中高浓度 Al3+处理时呈剧
烈的下降趋势; 而铝敏感品种中花 2号, AhSAG基因
的相对表达量呈缓慢升高的趋势, 在中高浓度 Al3+
处理时显著上升。这既证实了 NO调节 AhSAG基因
的表达, 也说明可能通过降低 AhSAG基因的表达减
缓衰老, 起到缓解铝毒害的作用。0.10 mmol L–1和
0.02 mmol L–1 Al3+分别处理 99-1507和中花 2号时,
两者的根伸长程度均为对照的 60%~70%, 根尖铝含
量均为 200~300 μg g–1 FW, 此时 2个品种的铝毒害
程度相似 [19], 在低浓度铝处理时 , 加入 SNP 后 ,
99-1507 中 AhSAG 的含量显著升高, 可推测低浓度
的 SNP诱导 AhSAG基因的表达, 但在中、高浓度铝
时其含量极显著下降, 均低于对应的单独铝处理。
说明 SNP 抑制了此基因的表达, 延缓了 PCD 的发
生[36], 这与 1.0 mmol L–1 SNP处理下, 分别在 Al3+
浓度为 0.1 mmol L–1和 0.4 mmol L–1时缓解作用最明
显一致, 可推测 NO可能作为 PCD的内源调节因子[6],
延缓 PCD的发生[9]。
但这一推测在敏感型品种中花 2 号中却相反。
在 0.1 mmol L–1Al3+胁迫时, 中花 2号发生 PCD, 随
着处理浓度的升高, 衰老基因的相对表达量相对于
单独铝处理时显著升高, 说明 SNP 促进了此基因的
表达, 可推测在敏感型品种中 NO 可作为内源调节
因子, 促进 PCD 的发生[37]。NO 对生物体具有双重
作用, 在不同的抗性品种中发挥着相反的作用, 这
可能与植物耐铝性有关, 还有待进一步研究。
3.3 外源 NO对 AhBI-1基因表达量的影响
耐铝品种 99-1507 的AhBI-1基因的相对表达量
呈先升高后降低的趋势, 而铝敏感品种中花 2 号中
呈先下降后升高的趋势。99-1507在 0和 0.02 mmol
L−1 Al3+处理时, 中花 2号在 0、0.02和 0.10 mmol L−1
Al3+处理时, SNP 处理后的 AhBI-1 基因表达量均低
于对应的单独铝处理, 说明 NO 抑制了 AhBI-1 基因
的表达, BI-1 基因功能为抑制 Bax促凋亡基因表达,
间接抑制 PCD的发生[38-41]。用 2,6-二氯异烟酸(相当
与水杨酸)处理大麦诱导抗病性时, 也出现BI-1表达
量降低的现象 [42], 推测 BI-1 下游调控作用降低了
PCD的门槛, 而 AhBI-1基因在铝敏感性品种中的表
达极显著低于耐铝性品种, 抑制 Bax 基因的能力低,
Bax 基因表达量高, 诱使 PCD 的早发生, 这与铝敏
感品种中花 2 号更容易发生 PCD 的结论是一致的,
说明 NO 能够抑制 AhBI-1 基因表达, 而在铝诱导
PCD中的发挥负调控作用。
4 结论
适当浓度 SNP能够缓解一定浓度铝对花生根生
长的毒害作用, 1.0 mmol L−1 SNP的缓解作用最明显,
与对照相比, 根变长, 苏木精染色变浅, 根尖Al3+含
量降低。NO影响 AhSAG基因和 AhBI-1基因的表达,
NO 对花生铝毒害缓解作用机制可能与影响细胞程
序性死亡基因表达而调控细胞程序性死亡有关。
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