全 文 ：第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
陆地棉衣分 QTL 的形态和 RAPD 分子标记筛选Ξ
易成新　张天真ΞΞ　郭旺珍
(南京农业大学遗传育种系, 作物遗传与特异种质创新教育部重点开放实验室, 江苏南京 210095)
提　要　本研究以陆地棉遗传标准系 TM 21 (衣分 31. 4% ) 和 T 586 (衣分 7. 64% ) 为亲本构建衣分
Q TL s 的作图群体。根据 F 2 单株衣分表现, 以BSA 法筛选获得 4 个与控制陆地棉衣分Q TL s 连锁的
RA PD 分子标记。其中, O PD 13947, O PAD 02500, O PAO 16947 3 个标记位于同一连锁群, 且与茸毛基因
(T 1) 连锁, 位于棉花的第 6 染色体上。该衣分Q TL 来自 T 586, 标记位点可解释 6. 6% 的表型变异。
O PA K05940与另一衣分Q TL 连锁, 其供体基因来自TM 21, 可解释 7. 6% 的表型变异。此外鉴定出影响
衣分表达的 3 个形态标记, 植株被茸毛 (T 1) 对衣分具有增益作用, 可解释表型变异的 3. 57% ; 棕色纤
维 (L C1) 对衣分具有减效作用, 可解释表型变异的 3. 85% ; 光籽 (N 1) 对衣分具有巨大的负作用, 该 F 2
群体约 43. 26% 的衣分损失是由于该基因的抑制作用引起的。
关键词　陆地棉; 衣分; 分子标记; RA PD
M orpholog ica l and M olecular Tagg ing of L in t Percen t QTL s in
Upland Cotton
Y I Cheng2X in　ZHAN G T ian2Zhen3 　GUO W ang2Zhen
(D ep artm en t of Genetics & B reed ing , N anj ing A g ricu ltu ra l U niversity ; K ey L abora tory of Genetics & C rop Germp lasm
Innova tion, M inistry of E d uca tion; K ey L abora tory of C rop Germp lasm & B reed ing , M inistry of A g ricu ltu re, N anj ing
210095, Ch ina)
Abstract　　Fou r RA PD m o lecu lar m arkers linked to lin t percen t Q TL s in U p land Co tton
w ere iden t if ied u sing Bu lked Segregan t A nalysis in the F 2 popu la t ion s cro ssed betw een
genet ic standard, TM 21 ( its lin t percen t is 31. 4% ) and T 586 ( lin t percen t is 7. 64% ).
Am ong them , O PD 13947, O PAD 02500, and O PAO 16947 w ere m apped to the sam e linkage
group , the six th ch rom o som e, and linked to the h irsu te gene T 1. T he iden t if ied Q TL w as
suppo sed to from T 586 and can exp la in the pheno typ ic varia t ion by 6. 6%. O PA K05940 w as
linked to ano ther lin t percen t locu s con tribu ted by TM 21 and can exp la in the pheno typ ic
varia t ion by 7. 6%. A ddit iona lly, th ree m o rpho log ica l m arkers associa ted w ith varia t ion in
lin t percen t w ere iden t if ied. T he a llele a t T 1 increased the lin t percen t w h ile the a llele a t
b row n co lo r fiber (L C1) decreased the lin t percen t, and can exp la in the pheno typ ic varia t ion
by 3. 57% , and 3. 85% , respect ively. N aked seed (N 1) had a huge negat ive effect on the lin t
percen t and cau sed abou t 43. 26% lin t percen t lo ss.ΞΞΞ 论文联系人
易成新, 男, 博士研究生; 研究方向: 作物分子育种
收稿日期: 2000207211, 接受日期: 2001201203
Received on: 2000207211, A ccep ted on: 2001201203国家自然科学基金 (39830240)、国家转基因植物研究专项 (J992A 2023) , 教育部跨世纪人才基金资助项目

Key words　　U p land Co tton; L in t percen t; M o lecu lar tagg ing; RA PD
周有耀[ 1 ]总结了 1988 年以前的研究结果后指出, 衣分的显性度为 0. 49 (8 份资料统计) ,
就平均而言, 衣分的加性成分远大于显性成分, 其性状遗传的基因作用以加性效应为主; 他
统计了 48 份研究衣分遗传力的原始文献, 其变幅从 9. 10%～ 96. 64% , 平均为 60. 90% , 进
一步说明衣分的加性成分大。杜雄明 (1998) 以纤维突变体N n (无绒有絮) 与 TM 21 正反交及
其相应的 F 1, F 2, BC 1, BC2 为材料, 对衣分性状进行的遗传分析表明, 衣分的遗传符合一对
主基因+ 多基因混合遗传模型, 其主基因加性和显性效应均较大, 且有较高的多基因遗传
力[ 2 ]。应用DNA 分子多态性进行作物重要农艺性状的标记是继形态标记、生化标记之后又
一重要的标记系统。最早用于棉花上的分子标记是R FL P 标记[ 3 ] , 已初步构建棉花的分子标
记遗传图谱。先后筛选出棉花胞质雄性不育恢复基因[ 4 ] , 叶片、茎杆上茸毛的Q TL s[ 5, 6 ] , 叶
片气孔导度 ( stom ata l conductance) [ 7 ] , 优质纤维Q TL s[ 8 ]等分子标记多个, 所用的标记有
R FL P、RA PD、SSR 等。Shapp ley et a l. [ 9 ] (1998) 通过 R FL P 遗传图谱分析检测到了 5 个衣
分Q TL s。本试验以衣分相差较大的陆地棉遗传标准系 TM 21 (衣分为 31. 4% ) 和陆地棉多显
性标记基因系 T 586 (衣分为 7. 64% ) 为亲本材料, 对 F 2 进行RA PD、SSR 分析, 旨在获得与
衣分有关的分子标记, 并定位到相应染色体上。
1　材料与方法
1. 1　材料
1997 年于南京配制 TM 21×T 586 组合, 1998 年种植 F 1 并自交, 1999 年于南京种植 240
株 F 2。TM 21 是美国农业部南方遗传研究室以“岱字棉 14”为基础培育的遗传标准系[ 10 ] ,
T 586 是以 TM 21 为遗传背景培育的具有 8 个显性遗传的形态标记基因系, 8 个标记性状分别
为: 植株红色 (R 1)、鸡爪叶 (L 02)、植株密生茸毛 (T 1)、黄花瓣 (Y 1)、黄花粉 (P )、花瓣有红心
(R 2)、棕色纤维 (L c)、光籽 (N 1) [ 11, 12 ]。逐株调查 F 2 各形态标记并分别提取叶片总DNA。
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA 的提取　　棉花叶片总DNA 的提取以 Paterson et a l. [ 13 ]的方法为基础, 并略
作改进。我们将提取、裂解缓冲液中的致癌物D IECA 去除, 并根据叶片的不同情况调整
PV P 及 Β2巯基乙醇的具体用量, 而不拘泥与原方法的用量。
1. 2. 2　近等基因的构建　　按照M ichelm o re et a l. [ 14 ]提出的方法, 分别选取衣分最高和最
低的各 10 个 F 2 单株, 分成高、低两组, 分别将每个单株的DNA 等量混合, 组成一对近等基
因池。
1. 2. 3　RA PD 分析　　本试验采用的随机引物为美国O PERON 公司开发的 10bp 寡核苷酸
序列, PCR 反应在 PE29600 热循环仪中进行。PCR 反应体积为 20 ΛL , 其中 10×buffer (含
25 mm o löL M gC l2 ) 2. 0ΛL , 2mm o löL dN T P s 1. 0ΛL , 10Λm o löL P rim er 1ΛL , 5mm o löL
TM A C I 和 10 m gömL BSA 各 0. 2 ΛL , T aq 酶 (5un itöΛL ) 0. 2 ΛL , 模板 DNA 20 ng, 加
ddH 2O 至 20 ΛL。PCR 反应热循环程序为: 94℃ 2 m in 预变性后, 接着 94℃ 30s, 36℃ 30s,
72℃ 70s, 10 个循环, 再 89℃ 20s, 36℃ 20s, 72℃ 60s, 35 个循环, 再 72℃ 7 m in。PCR 扩
增产物在 1. 4% 琼脂糖凝胶中电泳, 然后在紫外透射仪上照相, 记录实验结果。
1. 2. 4　SSR 分析　　SSR 反应体系 10 ΛL , 内含 67 mm o löL T ris2HC l(pH 8. 8) , 16 mm o löL
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(N H 4) 2SO 4, 0. 002% 明胶, 0. 2 mm o löL dN T P s, 2. 5 mm o löL M gC l2, 正向引物和反向引物
(M apPairsTM 产品) 各 0. 6 um o löL , 0. 25 ΛL T aqDNA 聚合酶 (上海 Sangon 公司产品) , 模板
DNA 20ng。PCR 反应程序为: 95℃变性 2 m in; 94℃变性 40s、57℃退火 45s、72℃延伸 60s,
共 30 个循环; 72℃延伸 7 m in。扩增产物的 PA GEö银染检测: 扩增产物经非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳, 凝胶浓度 10% , 凝胶大小为 180 mm ×120 mm ×1 mm , 电泳缓冲液为 1×TBE,
恒压电泳。电泳结束后, 凝胶用蒸馏水稍微冲洗。银染方法参考张军等[ 15 ]介绍的方法。
1. 2. 5　资料分析　　利用 F 测验和简单线性回归分析法[ 16 ] , 根据 F 2 单株的衣分和分子标记
与形态标记计算差异显著性及其回归关系 (表 1) , 以确定各单标记对衣分的影响程度。有显
著性差异的分子标记和形态标记利用M apm akeröEXP (3. 0b) 软件分析连锁关系, 构建遗传
连锁图。此外还运用区间作图法在M apm akeröQ TL (1. 1b)软件包上完成 F 2 单株衣分的Q TL
分析。
表 1　　RAPD 分子标记及形态标记与衣分的相关分析
Table 1　　Correlation s between l in t percen t-morpholog ica l and RAPD molecular markers
R 1 L 0 T 1 R 2 P Y 1 L C N 1 A K05 D 13 AD 02 A 016
F 值 < 1 < 1 7. 7053 3 2. 506 1. 066 < 1 5. 4403 3 108. 753 3 17. 0233 3 6. 6103 12. 6563 3 4. 5423
R - - 0. 1890 - - - - 0. 1962 - 0. 6577 0. 2763 0. 1755 0. 2395 0. 1462
r2 - - 0. 0357 - - - 0. 0385 0. 4326 0. 0763 0. 0308 0. 0574 0. 0214
　　注: 3 , 3 3 分别代表 0. 05 和 0. 01 的显著水平。
　　N o tes: 3 , 3 3 rep resen t sign ificance at 0. 05 and 0. 01 levels, respectively
图 1　　F2 单株衣分次数分布
F ig. 1　　F requency distribu tion of lin t percen t in F2 p lan ts
2　结果与分析
2. 1　F 2 单株衣分性状分析
从 210 个 F 2 单株衣分的次数分布图
(图 1) 可以看出, 衣分的变幅从 0. 3% 到
35. 25% (表 2) , 出现明显的超亲分离, 并
在 6. 5% 处有一小峰, 在 21. 5% 处有一大
峰, 且小峰出现在 T 586 的衣分值 7. 64%
附近, 而大峰则处在衣分中亲值 19. 52%
附近, 说明该 F 2 群体的衣分性状表现为加
性效应为主。 (TM 21×T 586) F 2 单株按各
形态标记与RA PD 分子标记 (0, 1) 分组后
衣分平均值之间的 F 测验值和标记与衣分之间的相关系数及决定系数列表 1。形态标记中按
植株被茸毛、棕色纤维、光籽分组的衣分平均值间 F 值均达极显著水平, 表明这三个标记的
有无对各单株衣分的高低存在极显著关系。3 个标记性状与衣分的相关系数分别为 0. 1890,
- 0. 1962, - 0. 6577, 决定系数分别为 0. 0357, 0. 0385, 0. 4326, 说明植株被茸毛对衣分具
有增益作用, 可解释表型变异的 3. 57% ; 棕色纤维对衣分具有减效作用, 可解释表型变异的
3. 85% ; 光籽对衣分具有巨大的负作用, 该 F 2 群体约 43. 26% 的衣分损失是由于该基因的抑
制作用引起的。其它标记性状与衣分相关不显著。F 2 单株中衣分极端类型的相关性状表现列
表 2。可以看出, 极端低衣分单株均表现为无茸毛、棕色纤维和光籽, 而极端高衣分单株均表
3876 期　　　　　　　易成新等: 陆地棉衣分Q TL 的形态和RA PD 分子标记筛选　　　　　　　　　　　

现为有茸毛、白色纤维和毛籽。这说明光籽ö毛籽, 茸毛的有无、棕色ö白色纤维对棉纤维的
发育有很大的影响, 同时也说明控制衣分性状的基因位点不止一个, 不同位点之间的效应大
小不同并且存在明显的相互作用。
表 2　　部分衣分极端类型单株的相关性状
Table 2　　Related tra its of some l in t percen t extreme indiv iduals
株号 Rg20 Rg25 Rg29 Rg34 Rg58 Rg100 Rg114 Rg120 Rg122 Rg173 Rg210 Rg220
T 1 + + - + + - - - + + + + + + + - -
L c - + - + + + + - - - - + +
N - + + - + + + + + + - - - - + + + +
衣分 0. 3183 0. 0125 0. 3099 0. 003 0. 0204 0. 0213 0. 3525 0. 3146 0. 3368 0. 3352 0. 015 0. 0453
2. 2　RAPD、SSR 分子标记的筛选与连锁分析
用 1040 个 10 bp 随机引物和 50 对 SSR 引物对双亲总DNA 进行多态性检测, 用检测到
多态性的引物再对衣分近等基因池进行RA PD、SSR 筛选。在双亲和近等基因池间重复扩增
出多态性的引物进一步扩增 F 2 所有单株的总DNA。结果发现, 双亲中检测到多态性差异的
SSR 引物在衣分近等基因池间无多态。O PA K05940, O PAD 02500, O PD 13947, O PAO 16947四个
RA PD 标记与衣分性状的相关系数均达显著或极显著水平 (表 1) , 表明这 4 个RA PD 标记均
与衣分性状存在连锁关系。其中 O PA K5940 来自亲本 TM 21, 而 O PAD 02500, O PD 13947,
O PAO 16947则来自 T 586。
图 2　　衣分Q TL 与 T 1 和RA PD 标记的连锁图
F ig. 2　　L inkage group of a Q TL of lin t percen t w ith
T 1 and RA PD m arkers
　　运用M apm akeröEXP (3. 0b ) 对 4
个 RA PD 标记和 3 个形态标记进行连
锁分析。连锁测验表明 O PAD 02500,
O PD 13947, O PAO 16947三个分子标记与
茸毛 (T 1) 基因连锁构成一个连锁群 (图
2) , 因此这 3 个分子标记与 T 1 位于第 6
染色体上[ 17 ]。O PA K05940和形态标记以
及各形态标记之间均相互独立。利用
M apm akeröQ TL (1. 1b) 对这一连锁群
涉及的标记类型与相应的 F 2 单株的衣
分资料进行区间作图分析, 发现最大
LOD 值 (LOD = 2. 84) 位于O PAD 02500
处 (如图 2) , 表明在我们构建的这一连
锁群中, 该衣分Q TL 位点可暂定位于
O PAD 02500这一标记附近。遗传分析表明该分子标记可解释衣分 6. 6% 的表型变异。随着标记
种类和数量的增加, 将会在O PAD 02500外侧发现新的分子标记, 从而能够更精确地定位该衣
分Q TL 位点。
O PA K05940是来自高值亲本 TM 21 的分子标记, 标记类型与相应 F 2 单株衣分资料进行的
简单线性回归分析表明该衣分位点可解释 7. 6% 的表型变异 (表 1)。
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3　讨论
3. 1　衣分是重要的产量性状, 在陆地棉产量构成因子中, 遗传率最高, 常在早世代选择。它
与皮棉产量显著相关, 可通过衣分间接进行产量选择[ 18 ]。利用 F 2 分离世代及其它 5 个世代
(P 1、P 2、F 1、BC1、BC2) 研究衣分的遗传特性是经典遗传学常用的策略。尽管利用 F 2 单株的
收花结果计算衣分会存在一定的偏差, 除了相对随机的环境因素外, 部分单株的铃数太少引
起的收、轧花易损失, 计量误差较大等方面的原因不容忽视。因此我们选用的 210 个 F 2 单株
均至少有 5 个正常吐絮铃。衣分低于 5% 的单株均为光籽或稀毛籽类型, 我们均是手工剥绒
后称量, 计算衣分。天平精度为 0. 01g。
3. 2　Sim p son [ 19 ] (1947) 曾报道茸毛性状与棉纤维粗而短是一因多效, 并认为茸毛与种子重
量、衣分、衣指和纤维强度无特殊关系。K lo th [ 20 ] 1993 年发现一个陆地棉纯合茸毛材料
( T 1T 1) 与低麦克隆值连锁, 并在其后的研究[ 21 ]中进一步证实茸毛与麦克隆、纤维周长、
2. 5% 跨距长度、纤维强度、细胞壁厚度等品质性状存在连锁, 而不是一因多效。我们筛选到
的与衣分有关的O PAD 02500, O PD 13947, O PAO 16947三个分子标记与 T 586 中茸毛 (T 1)性状连
锁。O PAO 16947与 T 1 的遗传距离虽然大到 36. 3 cM , 但二者之间的连锁关系是可靠的, 虽然
以其作为筛选高衣分的分子标记不适宜, 但可以作为连锁图上的一个位点。区间作图分析表
明, 该衣分位点并不位于茸毛位点处, 而是在距其约 7. 8 cM 的O PAD 02500附近, 说明不是由
于茸毛基因的一因多效引起衣分的变化, 而可能另有一个控制衣分性状的基因位点位于茸毛
基因附近。W righ t et a l. [ 5 ]定位于海岛棉 (P im a27, 无茸毛)第 6 染色体上的茸毛 ( t1)位点相对
于陆地棉 (B 2b6, 有茸毛) 为隐性, 该等位基因决定棉花植株上大多数部位的茸毛表现, 类似
于组成性表达基因, 很可能与我们标记的茸毛基因是同一个位点, 这一点可通过将他们筛选
的R FL P 标记应用到我们的标记群体中而得到证实, 这一研究工作在进一步进行当中。
3. 3　成熟的棉花种子表皮包括长纤维和短绒两部分。棉花长纤维是开花后 24 小时内胚珠上
的表皮细胞伸长发育产生的; 开花后 5～ 10 天胚珠上的第 2 组表皮细胞伸长产生不到 5 mm
长的短绒, 它们紧贴种皮, 轧花后短绒一般仍留在种皮上。T 586 中由于存在显性光籽基因
N 1 的作用, 不仅抑制了棉花种子上短绒的生长, 而且也对其他长纤维基因的表达有很大抑制
作用; 另外, 控制棕色纤维的基因对衣分也存在减效作用, 因此, T 586 的衣分很低。另一方
面, 可能正是由于存在与茸毛性状连锁的衣分位点, 而该位点又不被光籽基因所抑制, 所以
才使 T 586 表现出 7. 64% 的衣分。类似地, X iao et a l. [ 22 ] (1996) 在水稻产量性状分子标记筛
选中, 从水稻野生种中获得了被其它不利基因掩盖的产量增益基因。而这种现象在生物界中
是普遍存在的[ 23 ]。
3. 4　本实验选用的双亲衣分差异很大, 利用BSA 法筛选重要农艺性状的分子标记, 常可筛
选出质量性状基因或效应值较大的Q TL 分子标记。我们发现在T 586 第 6 染色体上有一个高
衣分的Q TL 位点, 但仅能解释 6. 6% 的表型变异。而 T 586 本身的衣分仅为 7. 64% , 其原因
可能是由于 T 586 中显性光籽基因N 1 的抑制作用使本来效应较大的基因作用难于显现出来。
另外, 在我们的研究中同时筛选到 3 个标记与该Q TL 连锁, 也证明该Q TL 的遗传效应值可
能较大。
综合分析本试验的分子标记和形态标记表明, 陆地棉控制衣分性状的基因位点至少有 4
个, 它们分别与O PA K05940、O PAD 02500 (茸毛)、光籽 (N 1) 和棕色纤维 (L c1) 等连锁, 其相互
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作用很复杂, 不仅存在等位基因间的相互作用, 而且存在着明显的非等位基因间的相互作
用。
参　考　文　献
1　周有耀, 北京农业大学学报, 1988, 14 (2) : 135～ 141
2　杜雄明, 南京农业大学博士论文, 1998, 62～ 79
3　W endel J F, P roc N atl A cad S ci USA , 1989, 86: 4132～ 4136
4　郭旺珍, 张天真, 潘家驹等, 科学通报, 1998, 24: 2645～ 2647
5　W righ t R J , T haxton P M , E l2Zik KM , et al. J H ered , 1999, 90 (1) : 215～ 219
6　Rein isch A J , Dong J , B rubaker CL , et al. Genetics, 1994, 138: 1～ 19
7　U lloa M , R G Cantrell, R G Percy, et al. J Cott S ci, 2000, 4: 10～ 18
8　J iang C X, R J W righ t, K M E l2Zik, et al. P roc N atl A cad S ci USA , 1998, 95: 4419～ 4424
9　Shapp ley Z W , J N Jenk ins, J Zhu, et al. , J Cott S ci, 1998, 2: 153～ 163
10　Kohel R J , R ichmond T R & L ew is C F, C rop S ci, 1970, 10: 670～ 673
11　Kohel R J , L ew is C F & R ichmond TR , C rop S ci, 1965, 5: 582～ 585
12　潘家驹, 南京农学院学报, 1983, 1: 1～ 13
13　Paterson A H , Curt L B &W endel J F, P lan t M ol B io R ep , 1993, 11 (2) : 112～ 127
14　M ichelmo re R W , I Paran & R V Kesseli , P roc N atl A cad S ci USA , 1991, 88: 9828～ 9832
15　张军, 武耀廷, 郭旺珍等, 棉花学报, 2000, 12: 267～ 269
16　徐云碧, 朱立煌主编, 分子数量遗传学, 北京: 中国农业出版社, 1994
17　潘家驹 译, 国外农学 棉花, 1987, 5 (56) : 1～ 42
18　M iller P A , Raw lings J O , C rop S ci, 1967, 7: 637～ 640
19　Simp son D M , J H ered , 1947, 48: 153～ 156
20　Klo th R H , C rop S ci, 1993, 33: 683～ 687
21　Klo th R H , T heor A pp l Genet, 1995, 91: 762～ 768
22　X iao J H , S Grandilio, SN A hn, et al. , N atu re, 1996, 384: 223～ 224
23　T ank sley SD , Grandillo S, Fulton TM , et al. , T heor A pp l Genet, 1996, 92: 213～ 224
687　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷