全 文 ：Vol. 30 , No. 10
pp. 1056 - 1059 　Oct. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 10 期
2004 年 10 月 　1056～1059 页
试管地黄的不定根膨大过程中 4 种内源激素的消长
薛建平1 ,2 　葛德燕1 　张爱民1 　柳　俊3 　朱艳芳1 Ξ
(1 淮北煤炭师范学院生物系 ,安徽淮北 235000 ; 2 华中农业大学园艺林学学院 ,湖北武汉 430070 ; 3 华中农业大学生命科学技术学院 ,湖北武汉
430070)
摘 　要 　通过分析 4 种内源激素 IAA、GA3 、ABA 和JA 在试管地黄形态建成中的动态变化 ,初步探讨了试管地黄形成的生
理生化机制。在 MS + 62BA 015 mg·L - 1 + NAA 011mg·L - 1 + 5 %蔗糖培养基中诱导地黄无菌苗茎段形成不定根 ,再转入
MS + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 011 mg·L - 1 + 5 %蔗糖继代培养 ,取不同生长时期的根 ,对其内源激素进行分离和纯化 ,经
HPLC法进行测定 ,结果表明在试管地黄形成过程中 IAA、GA3、ABA 和 JA 的含量存在动态变化 ,基本呈上升趋势。
关键词 　地黄 ;试管块根 ;不定根 ;内源激素
中图分类号 : S567
Variation of Endogenous Hormones of Tuberous Root of Rehmannia glutinosa in vit2
ro
XUE Jian2Ping1 ,2 , GE De2Yan1 , ZHANG Ai2Min1 , LIU Jun3 , ZHU Yan2Fang1
(1 Department of Biology , Huaibei Coal Industry Teacher’s College , Huaibei 235000 , Anhui ; 2 College of Horticulture and Forestry , Huazhong Agricultural Univer2
sity , Wuhan 430070 , Hubei ;3 College of Life Sciences and Technology , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , Hubei , China)
Abstract 　Through analysis of variation and function of four endogenous hormones ( IAA ,GA3 , ABA and JA) in the forma2
tion of tuberous roots of Rehmannia glutinosa in vitro to explore the physiological and biochemical mechanism of tuberous
root development1 The endogenous hormones of tuberous roots were isolated in different stages of root expansion when they
were cultured on MS + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 011 mg·L - 1 + sucrose 5 % medium , then purified and detected with High
Performance Liquid Chromatography System1 The results showed that the endogenous hormones varied with tuberous root de2
velopment and thus played an important role in controlling the root formation1
Key words 　Rehmannia glutinosa ; Tuberous root ; Adventitious root ; Endogenous hormones
　　地黄是我国大宗常用中药材之一 ,为玄参科植
物地黄 Rehmannia glutinosa Libosch 的新鲜或干燥块
根[1 ] 。在地黄栽培中由于多年沿用块根无性繁殖的
方法 ,使得地黄易受多种病害侵袭 ,其中病毒病最为
严重 ,通常田间感染率达 100 %。对于病毒病的防
治 ,至今还没有发现特效药物 ,最根本的途径是利用
组织培养技术建立脱毒种苗生产体系。但脱毒苗在
大田生产过程中 ,第一年就有近 50 %再度感染病
毒 ,2～3 年就要更新一次 ,而且移栽成活率低 ,易受
外界气候影响 ,不能实现周年商品供应和长距离运
输。因而降低生产成本 ,建立新型生产体系已成为
脱毒种苗在生产上大面积推广应用的瓶颈[2 ] 。近年
来 ,随着植物生物技术的发展 ,人们先后在试管中诱
导出半夏[3 ] 、洋葱[4 ] 、马铃薯[5 ] 、芋[6 ]等的营养繁殖
器官 ,尝试用以替代脱毒苗 ,其中试管马铃薯、试管
半夏等块茎植物的培养技术已经日趋成熟 ,完全可
以替代试管苗作为商品供应 ,解决了试管苗不易储
存运输和移栽成活率低等制约生产上大面积推广的
难题。但像甘薯、地黄等块根植物 ,离体条件下形成
微型块根的技术在国内外一直未获重大突破。薛建
平等[7 ,8 ]在离体条件下首次成功诱导形成了试管地
黄 ,但试管地黄的形成机理尚不清楚 ,导致生产效率
不高 ,应用困难。本文旨在通过对不同生长时期试
管地黄的内源激素进行分离、纯化和检测 ,分析其在
试管地黄形态建成中的动态变化和作用 ,为试管地
黄的高频诱导和阐明块根形成机理提供依据。Ξ基金项目 : 国家经贸委项目 (2002215) 。
作者简介 : 薛建平 (1966 - ) ,男 ,博士 ,副教授。
Received(收稿日期) : 2003208204 ,Accepted(接受日期) :20032122031

1 　材料和方法
111 　材料
　　栽培品种“8525”采自焦作市温县农科所 ,经鉴
定为地黄 R1 glutinosa Libosch。以 MS 为基本培养
基获得无菌苗[8 ] ,转入 MS + 62BA 015 mg·L - 1 + NAA
011 mg·L - 1 + 5 %蔗糖培养基 ,诱导出不定根后 ,从
基部剪断斜插入 MS + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 011
mg·L - 1 + 5 %蔗糖中培养形成微型块根[7 ] 。
112 　内源激素的分离、纯化和检测
IAA、GA3、ABA 和 JA 的分离、纯化和检测参见
Liu 等[9 ]的方法。取约 1 g 处于不同生长期和膨大
状态的地黄块根、茎和叶在预冷的研钵中迅速研磨
成匀浆 ,用 4 ℃预冷的 80 %甲醇于 4 ℃冰浴条件下提
取 10 h ,8 000 r/ min 离心 ,残渣再提取一次 ,40 ℃旋
转减压蒸发至水相 ,用 012 mol·L - 1 Na2HPO4 调整
pH至 810 ,用等体积石油醚萃取 2 次 ,至上层近无
色 ,弃去上层液。40 ℃旋转减压蒸发除去残留石油
醚 ,用 012 mol·L - 1柠檬酸调至 pH 218 ,用相同体积
乙酸乙酯萃取 3 次 ,取上层液 40 ℃旋转减压蒸发至
干 ,用 1 mL 95 %乙醇溶解残留物 ,倒入离心管密封 ,
于 - 20 ℃下冻藏。
用 Waters 公司 2010 型高效液相色谱系统 ( High
Performance Liquid Chromatography ,HPLC) 测定内源激
素含量。工作系统组成为 510 型双泵 ,717 型自动进
样器 ,2487 型紫外检测器 ,2010 色谱工作站。色谱
柱为 Nova2pak C18柱 (Waters 319 mm ID1 ×150 mm ,10
μm P1S1) 。经 200～300 nm 全波长扫描 ,分别用 280
nm、240 nm、210 nm 检测 IAA、GA3、ABA 及 JA 等内源
激素 ,取 210 nm 显示检测灵敏度为 0～015 AUFS。
用 15 %230 %215 %色谱纯甲醇与 0105 mol·L - 1 pH
710 磷酸缓冲液混合梯度洗脱 ,以 Milli2Q 超纯水制
备 ,超声脱气 30 s ,流速 018 mL/ min。样品经 8 000
r/ min 离心后取上清液进样 ,进样量为 10μL ,每个生
长期实验重复 3 次。样品内源生长物质含量以内标
法定性 ,外标法峰面积定量。用 95 %乙醇配制标样
溶剂 ,标样 IAA、GA3 及ABA 分别购于 Sigma 公司 ,JA
购于 Fluka Chemie AG。
2 　实验结果
211 　试管地黄不定根膨大过程的形态学观察
　　无菌苗在MS + 62BA 015 mg·L - 1 + NAA 011 mg·
L - 1 + 5 %蔗糖培养基中培养 20 d 左右 ,植株茎段上
形成白色短粗的不定根 (图版 Ⅰ2A) ,从基部剪下茎
段斜插入 MS + 62BA 110 mg·L - 1 + IBA 011 mg·L - 1
+ 5 %蔗糖的培养基中 ,第 5 天时接触培养基的不定
根稍有加粗 ,到第 10 天时 ,膨大状况较为明显 ,这时
开始取样 ,20 d 以后生长迅速 (图版 Ⅰ2B) ,35 d 后出
现衰老现象 (图版 Ⅰ2C) 。试验中发现只有当不定根
接触培养基后才开始膨大 ,没有接触培养基的不定
根继续伸长但不膨大 (图版 Ⅰ2D) 。
212 　试管地黄不定根膨大过程中内源激素含量的
变化
　　由图 1 可见 ,在不定根膨大初期生长素含量呈
下降趋势 ,至 20 d 开始缓慢上升。由图 2 可见 , GA3
含量在转苗初期呈现较平稳的趋势 ,25～30 d 迅速
增长 ,而后下降 ,但依然处于较高水平 , 其总变化情
况基本上呈现倒 S 形。由图 3 可见 ,ABA 的含量在
10～20 d 呈缓慢上升趋势 ,20～30 d 迅速增长 ,30 d
以后保持平稳态势。由图 4 可见 ,JA 含量在不定根
图 1 试管地黄不定根膨大过程中 IAA含量的变化
Fig11 The change of content of IAA during the
swell of adventitious root
图 2 试管地黄不定根膨大过程中 GA3 含量的变化
Fig12 The change of content of GA3 during the
swell of adventitious root
膨大初期处于较低水平 ,以后则一直呈缓慢的上升
7501　10 期 薛建平等 :试管地黄的不定根膨大过程中 4 种内源激素的消长 　　　

趋势。
图 3 试管地黄不定根膨大过程中 ABA含量的变化
Fig13 The change of content of ABA during the swell of
adventitious root
图 4 试管地黄不定根膨大过程中 JA含量的变化
Fig14 The change of content of JA during the swell of
adventitious root
表 1 试管地黄迅速膨大时期内源激素的含量(μmol·g - 1DW)
Table 1 The content of the endogenous hormones
during the rapid swell of tuberous root
激素种类
The kind of hormones
根、茎、叶内源激素的含量
The content of endogenous hormones
in root , stem and leaf
根
Root
茎
Stem
叶
Leaf
IAA 010437 011496 011587
GA3 011069 011606 014379
ABA 011454 013275 016406
JA 711086 317299 612222
213 　试管地黄不定根迅速膨大时期各器官内源激
素的含量
　　由表 1 可以看出 ,在地黄不定根迅速膨大时期
(20 d) ,IAA、GA3、ABA 和 JA 在小植株根、茎、叶中的
含量有明显的差别 ,其中 IAA、GA3 和 ABA 在叶中的
含量最高 ,JA 在块根中含量最高。
3 　讨论
生长素可以诱导植物不定根发生 ,不定根根原
基的诱导与局部 IAA 水平的升高同时发生[10 ,11 ] ,但
当根原基一旦形成 ,在进一步发育中 IAA 含量降
低[12 ] 。我们的实验中也观察到相似的结果 ,即试管
地黄诱导的初期 ,由于不定根已形成 , IAA 的含量略
呈下降趋势 ,但当培养至 20 d 时 , IAA 的含量呈增加
趋势。Jarvis[13 ]等证实 IAA 含量的增加可诱导 RNA
合成的增加 ,因此我们设想在地黄不定根膨大时 ,地
黄不定根中 IAA 含量的增加可作为必要的调控因素
之一调节特异的 mRNA 的合成 ,从而翻译特异蛋白
质 ,使不定根迅速膨大形成块根。在地黄不定根迅
速膨大时期 ,茎和叶片中较高浓度的 IAA 有利于延
缓叶片在高渗环境下的衰老 ,从而有更多的光合产
物形成并转运到根部参与块根的形成[14 ] 。
近年来人们在块根等作物中研究发现 ,脱落酸
(ABA)在物质运输过程中也起着重要作用 ,史春余
等[15 ,16 ]发现甘薯块根中较高的 ABA 含量有利于块
根膨大。本试验观察到 ,地黄离体块根 ABA 含量在
块根膨大时就呈升高趋势 ,块根迅速膨大期最高。
较高的内源 ABA 含量促进块根膨大的可能原因是 :
(1) ABA 通过调节块根库中酸性转化酶和 ATP 酶活
性 ,促进了蔗糖的吸收和卸载 ,提高了块根中可溶性
碳水化合物含量[16 ,17 ] 。(2) 在地黄不定根迅速膨大
时期 ,叶片中脱落酸的含量最高 ,有利于光合产物从
叶向根的运输[18 ] 。
茉莉酸类物质对离体马铃薯、薯蓣、菊芋的块茎
形成和甘薯的块根及大蒜、洋葱的鳞茎形成具有显
著的促进效应[19 ] 。高浓度的 JA 能增加细胞中蔗糖
的积累 ,促进微管微丝的增粗 ,从而促进马铃薯块茎
膨大[20 ] ;Nakatani 等[21 ,22 ]发现 JA 能诱导离体培养
的甘薯茎生不定根轻微加粗生长 ,并且使根从白色
变为块根的特征颜色红色。在试管地黄膨大过程
中 ,JA 含量呈明显的上升趋势 ,而且在其迅速膨大
时期 ,JA 在根中的含量最高 ,可见 JA 参与了地黄离
体块根的形成 ,并且有可能起着极为重要的作用。
在地黄离体块根形成的初期 , GA3 含量呈现平
稳趋势 ;而在离体块根快速膨大期 , GA3 含量急剧增
加出现一个明显的峰值 ,接着 GA3 含量快速下降 ,
此时块根呈现衰老迹象。Hussey 等[23 ,24 ]在马铃薯
离体块茎的研究中发现 ,ABA 对块茎的促进作用可
被外源 GA3 抵消。Sporamin 作为一种在甘薯块根中
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特异表达的贮藏蛋白 ,是块根形成的一种生化标志 ,
即在甘薯植株的发育过程中 ,块根一旦发生 ,便在发
生部位伴随着大量 Sporamin 的合成 , Sporamin 基因
的表达还能接受 ABA 信号的诱导而提高水平 , GA3
阻遏其表达[25 ] 。薛建平等[7 ]的研究也发现 ,在培养
基中加入外源 GA3 ,不利于地黄离体块根膨大。因
而我们推测 GA3 在地黄离体块根的形成中并不起
关键作用 ,高浓度的 GA3 可能促进块根成熟 ,使块
根衰老。
当然 ,由于每种器官都存在着数种激素 ,因而决
定生理效应的往往不是某种激素的绝对含量 ,而是
各激素间的相对含量和它们的比值。在实验中 ,我
们发现地黄不定根在转苗初期 ,膨大现象较为明显 ,
而到后期 ,其直径膨大则远远小于根尖后端的伸长 ,
这可能是多种激素共同作用的结果。目前的试验虽
已初步探讨了试管地黄形成过程中内源激素的变化
情况 ,但还有许多工作要做 ,以进一步探明块根形成
的机理。
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