全 文 ：Vol. 30 , No. 1
pp. 786～81 　Jan. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 1 期
2004 年 1 月 　78～81 页
换培养液和秋水仙碱处理对白菜型油菜小孢子胚胎发生的影响
顾宏辉1 ,2 　张冬青2 　周伟军1 , 3
(1 浙江大学农业与生物技术学院农学系 ,浙江杭州 310029 ;2 浙江省农业科学院作物研究所 ,浙江杭州 310021)
摘 　要 　选用对小孢子培养反应较好的白菜型油菜地方品种 (茅山种) 为供体材料 ,研究了换培养液和秋水仙碱直接处
理分离小孢子对胚产量的影响 ,并分析了秋水仙碱直接处理小孢子所获再生植株的染色体倍性水平。结果表明 ,分离小
孢子在 10 %蔗糖浓度的 NLN210 培养基上培养 2 d 后换成新鲜培养液 ,能显著提高出胚产量 ,比不换培养液的胚产量高
115 倍。更换培养液还能明显改善胚状体质量。用 018 mgΠL 秋水仙碱处理刚分离的小孢子 2 d ,能显著提高出胚产量 ,并
能提高再生植株二倍体率。而过高秋水仙碱浓度 (4 ～ 20 mgΠL)未能提高出胚产量 ,且对胚状体萌发和小植株再生产生
不利影响。Ξ
关键词 　白菜型油菜 ( Brassica rapa ssp1 chinensis) ;小孢子培养 ;胚胎发生 ;双单倍体 ;秋水仙碱
中图分类号 : S565
Effects of Medium Renovation and Colchicine Treatment on Embryogenesis of Iso2
lated Microspores in Brassica rapa ssp1 chinensis
GU Hong2Hui 1 ,2 , ZHANG Dong2Qing 2 , ZHOU Wei2Jun 1 , 3
(1 College of Agriculture and Biotechnology , Zhejiang University , Hangzhou 310029 , Zhejiang ; 2 Institute of Crop Sciences , Zhejiang Academy of Agricultural Sci2
ences , Hangzhou 310021 , Zhejiang , China)
Abstract 　　Using Brassica rapa syn1 B1 campestris ssp1 chinensis cv1 Maoshan (a local variety) which had good re2
sponse to microspore culture as donor plant , the experiment was carried out to evaluate the effects of medium renovation and
direct colchicine application on the embryogenesis of isolated microspores1 The chromosome ploidy level in regenerated
plants derived from direct colchicine treatment of microspores was also analyzed in the present experiment1 The results indi2
cated that the change of liquid NLN210 medium with 10 % sucrose after 2 d initiation showed a significant increase in em2
bryogenesis (by a 115 fold) , compared to non2medium renovation control1 In addition , the quality of embryos was greatly
improved through medium change1 Direct colchicine treatment of isolated microspores with the concentration of 018 mgΠL for
2 d produced the most embryos , and the highest doubling efficiency of 7413 % was obtained1 Whereas higher colchicine
concentrations of 4～20 mgΠL were unable to improve embryogenesis , and the adverse effects on embryo germination and
plant regeneration were also observed1
Key words 　　Brassica rapa ssp1 chinensis ; Microspore culture ; Embryogenesis ; Doubled haploid ; Colchicine
　　白菜型油菜 ( Brassica rapa ssp1 chinensis 或 B1
campestris ssp1 chinensis) 是我国南方重要的油蔬兼
用作物 ,其高芥、黄籽等特异性状对油菜育种具有重
要利用价值。由于白菜型油菜自交不亲和 ,许多优
良性状从导入到纯合难以用常规育种方法达到目
的 ,多代自交选择工作量极大 ,选育时间长、效率低。
运用小孢子培养技术能快速纯合目标性状 ,增加选
择机率 ,加快育种进程 ,从而大大节省育种工作量和
时间[1 ] 。此外 ,小孢子培养也是开展远缘杂交、诱变
育种和转基因研究的良好途径[2 ] ,对白菜型油菜育
种具有重要意义。自小孢子培养首次在甘蓝型油菜
获得成功后 ,其技术和应用研究发展较快[3～7 ] ,在白Ξ基金项目 :教育部留学回国人员科研启动基金、中瑞政府间合作项目 (C08)和浙江省重点科技项目 (021102109)资助。
作者简介 :顾宏辉 (1969 - ) ,男 ,浙江宁波人 ,在职博士生 ,助理研究员 ,主要从事作物遗传育种和栽培生理研究。3 通讯作者 :周伟军 ,E2mail : wjzhou @zju1edu1cn
Received(收稿日期) :2002207212 , Accepted (接受日期) : 20022112241

菜型油菜芜菁亚种 ( B1 rapa ssp1 oleifera) 中小孢子
培养研究已有报道[8～11 ] ,而白菜亚种 ( B1 rapa ssp1
chinensis)只作蔬菜有零星报道[12 ,13 ] 。由于白菜型油
菜小孢子培养胚胎发生频率低 ,继代技术难度大 ,难
以有效获得双单倍体 (DH) 再生植株 ,给育种和转基
因研究等应用造成困难。本试验研究了分离小孢子
换培养液和秋水仙碱直接处理分离小孢子对胚产量
及再生植株加倍频率的影响 ,并获得大量 DH 再生
植株 ,为白菜型油菜小孢子培养应用研究提供科学
依据。
1 　材料与方法
111 　供试材料
　　选用对小孢子培养反应较好的冬性白菜型油菜
浙江地方种 720 (宁波茅山种) 作供体材料。供体植
株盆栽生长在光周期 16 h、营养丰富的温室条件下。
植株 3～4 叶期时在 4 ℃、弱光、光周期 8 h 条件下进
行春化处理 8 周。在抽薹开花前 ,将植株移入 12 ℃Π
10 ℃(昼Π夜)的人工气候室作小孢子培养备用。共 8
株作供体植株。
112 　小孢子培养和植株再生
小孢子分离和培养方法参照 Ballie 等[8 ] 和
Fletcher 等[14 ]方法进行。在花序接近开花时 ,每次从
主花序或分枝花序上随机选取处于单核晚期和双核
早期的花蕾 (2～3 cm 长) 12 个。经次氯酸钠 (有效
成分 5 %) 表面消毒 15 min 后 ,用无菌水洗涤 3 次。
在 10 mL 的 B5213 培养液 (含 B5 大量、微量、铁盐和
有机成分 ,13 %蔗糖 ,pH 610) 中轻轻捣碎 ,并经 40
μm 尼龙筛网过滤 ,滤液用 750 rΠmin 离心 5 min ,去上
清液后加 48 mL NLN217 培养液 (NLN 含大量、微量、
铁盐和有机成分 ,17 %蔗糖 ,pH 610) ,并加活性炭 12
滴 ,密封后置于 32 ℃的恒温箱中黑暗培养 2 d。2 d
后用同上方法离心 ,加入等量的 NLN210 培养液 ,取
4 mL 小孢子悬浮液于 12 个 6 cm ×115 cm 培养皿
中 ,之后移至 24 ℃黑暗条件下培养。在小孢子分离
25 d 后 ,转移至 24 ℃、16 h 光照、45 rΠmin 条件下振
荡培养至胚体转绿。
把已转绿的子叶期胚状体 ,移入 B522 固体培养
基 (含 B5 大量、微量、铁盐和有机成分 ,2 %蔗糖 ,1 %
琼脂 ,pH 518)中 ,在 22 ℃、16 h 光周期下光照培养。
3 周后切取试管苗在 B521 固体培养基 (含 B5 大量、
微量、铁盐和有机成分 , 1 %蔗糖 , 018 %琼脂 , pH
518)进行发根继代培养。待生长容器中的小植株有
4～6 张叶片 ,并有根系形成后 ,移至含基质的培养
钵中。刚移到基质中的小植株置于 24 ℃、16 h 光周
期、弱光及高湿的生长条件下 ,并定期浇水、炼苗 ,待
小植株成活后移至温室。
113 　秋水仙碱处理和倍性检测
对刚分离的小孢子直接进行秋水仙碱处理。设
0、018、4 和 20 mgΠL 共 4 种秋水仙碱浓度 ,在小孢子
分离后的 NLN217 培养液中直接加入不同浓度的秋
水仙碱处理液 ,并加入活性炭 ,经 32 ℃、2 d 处理后 ,
换入不含秋水仙碱的 NLN210 培养液后继续黑暗培
养。
对秋水仙碱不同处理所获得的再生小植株 ,移
入基质 1～2 周后取新叶 ,用德国产 Partec GmbH 流
式细胞分析仪进行倍性检测[15 ] ,以区分是单倍体、
双单倍体及四倍体等。二倍体率为二倍体数与所测
再生植株的比率。
2 　结果与分析
211 　换培养液对胚产量的影响
　　分离小孢子在不同蔗糖浓度 NLN 培养液下热
击培养 ,2 d 后更换为新鲜 NLN210 培养液 ,并转入常
温继续培养。含 10 %蔗糖的 NLN210 起始培养液 ,2
d 后换入相同蔗糖浓度培养液 ,其胚产量显著高于
相同蔗糖浓度下培养但不换培养液处理 ,提高达
115 倍。但以 17 %蔗糖浓度为起始培养液 ,2 d 后蔗
糖浓度降至 10 % ,其胚产量并没有提高 ,与不换培
养液处理无显著差异 (表 1) 。表明白菜型油菜小孢
表 1 换培养液对白菜型油菜胚产量的影响
Table 1 The effect of medium renovation of isolated microspores on embryo production in Brassica rapa ssp1 chinensis
起始培养液
Initiation medium
2 d 后换培养液
Medium renovation after 2 d
胚产量 3
No1 of embryosΠbud ±S E
NLN217 NLN210 1810 ±119 b 3 3
NLN210 NLN210 4611 ±218 a
NLN210 不换 Non2change 1816 ±114 b
　　注 : 3 胚产量为大于 015 mm的子叶期胚体 ,下同。3 3 不同小写字母表示在 0105 水平下差异显著 ,下同。
Notes : 3 Embryo production is defined as those embryos larger than 015 mm in length at cotyledonary stage1 The same is true for others1 3 3 Within columns ,
the different letters expressed significant difference at the 0105 level of probability1 The same is true for others1
97　6 期 顾宏辉等 : 换培养液和秋水仙碱处理对白菜型油菜小孢子胚胎发生的影响 　　　

子培养的液蔗糖浓度较适宜的培养液低 ,在低糖浓
度下更换培养液能显著提高出胚产量。另外在试验
中可看到 ,热击诱导后更换培养液能明显改善胚状
体质量 ,提高正常胚体比例。
212 　秋水仙碱直接处理小孢子对胚产量和再生植
株倍性的影响
21211 　对胚产量的影响 　　对刚分离的小孢子直
接用不同浓度的秋水仙碱处理 2 d ,观察秋水仙碱处
理对诱导小孢子出胚产量的影响。结果表明 (表 2) ,
表 2 秋水仙碱直接处理小孢子
对胚产量的影响
Table 2 The effect of colchicine treatment of isolated
microspores on embryo production in
Brassica rapa ssp1 chinensis
处理浓度
Treatment
(mgΠL) 处理时间Duration(d) 胚产量 3No1 of embryosΠbud ±S E
0 2 2814 ±210 b
018 2 3719 ±215 a
4 2 2716 ±212 b
20 2 2911 ±212 b
用 018 mgΠL 浓度秋水仙碱处理 2 d ,能显著提高出胚
产量 ,比对照未处理胚产量高 3315 %。但当秋水仙
碱处理浓度提高到 4～20 mgΠL 时 ,胚产量无显著差
异。可见 ,相对较长时间和较高浓度的秋水仙碱处
理分离小孢子不利于提高出胚产量。其次 ,经 4、20
mgΠL 浓度秋水仙碱处理过的子叶期胚状体 ,移入固
体培养基中进行诱导萌发 ,其萌发率和再生小植株
率明显下降 ,秋水仙碱处理浓度越高 ,胚萌发受抑程
度越大。低浓度 (018 mgΠL) 秋水仙碱处理胚萌发和
植株再生率与对照无差异。
21212 　对再生植株倍性的影响 　　经秋水仙碱处
理所获得的再生小植株 ,用流式细胞分析仪检测其
倍性分布 ,以分析秋水仙碱直接处理小孢子的加倍
效果。表 3 可以看出 ,秋水仙碱不同处理浓度得到
不等的再生植株 ,二倍体率以 018 mgΠL 秋水仙碱处
理为最高 ,达 7413 %。较高秋水仙碱浓度 (4 mgΠL 和
20 mgΠL)处理 ,二倍体率也明显高于对照。另外也
可发现 ,经秋水仙碱处理的再生小植株 ,其多倍体及
嵌合体数量明显少于对照。经 20 mgΠL 浓度秋水仙
碱处理所得的再生植株 ,没检测到单倍体 ,多倍体中
也全部是四倍体。
表 3 秋水仙碱直接处理小孢子对再生植株倍性的影响
Table 3 The effect of colchicine treatment of isolated microspores on ploidy level in regenerated
plants of Brassica rapa ssp1 chinensis
处理浓度
Treatment
(mgΠL) 检测株数Plants tested 单倍体Haploid 双单倍体Diploid 多倍体及杂合体Polyploid andchimeric 二倍体率Doubling efficiency( %)
0 35 7 21 7 6010
018 35 5 26 4 7413
4 19 4 14 1 7317
20 10 0 7 3 7010
3 　讨论
在本试验条件下 ,白菜型油菜分离小孢子在
NLN 培养液中培养产生了大量的正常胚体 ,这些胚
体在 B5 固体培养基中经历萌发、发根继代培养 ,迅
速有效地获得大量的 DH 再生植株。从小孢子分离
到有效获得 DH再生植株 ,只需约 3 个月时间 ,比常
规多代自交传统方法大大地节省了时间和工作量 ,
是白菜型油菜开展遗传育种及应用研究的理想途
径。
除基因型是影响白菜型油菜小孢子培养出胚产
量和再生能力的最主要因素外 ,供体的生长条件、小
孢子分离和培养方法及继代培养方法等也是影响小
孢子培养的重要因素[1 ,11 ,16 ] 。本试验中 ,通过对热击
2 d 后的小孢子培养液更换新鲜培养液 ,能显著提高
胚产量和明显改善胚状体质量 ,这与在白菜型油菜
芜菁亚种[8～10 ] 、甘蓝型油菜[17 ] 、芥菜型油菜[18 ] 等的
结果一致。但是本试验表明 ,从起始培养高糖浓度
后转入低糖浓度培养并不能提高白菜型油菜小孢子
培养的出胚产量 ,且相对较低糖浓度更有利于出胚 ,
而在白菜型油菜芜菁亚种小孢子培养中 ,从高糖浓
度转入低糖浓度能显著提高出胚产量[9 ,10 ] 。
08 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

秋水仙碱直接处理分离小孢子能诱导出胚 ,提
高出胚产量和染色体加倍频率 ,这在甘蓝型油菜中
已有较多报道[19～23 ] ,但未见有对白菜型油菜上的研
究报道。为降低秋水仙碱残液浓度 ,本试验采取较
低秋水仙碱浓度及较长处理时间的方法 ,对白菜型
油菜分离小孢子进行多种浓度秋水仙碱处理研究。
本试验结果表明 ,用 018 mgΠL 秋水仙碱直接处理 2 d
分离小孢子 ,能显著提高出胚产量 ,增加再生植株的
二倍体发生频率 ,而秋水仙碱浓度过高 ,不能提高出
胚产量 ,并且不利于胚体的萌发 ,这与我们在甘蓝型
油菜的研究结果一致。但 Mo¨ller 等[24 ] 用 10 mgΠL 秋
水仙碱处理甘蓝型油菜 72 h ,取得了较好的结果。
而我们在白菜型油菜的研究中 ,秋水仙碱浓度高于
4 mgΠL 时 ,不能有效提高出胚产量 ,且对后期的胚体
萌发和小植株再生有负面影响。这表明白菜型油菜
分离小孢子对秋水仙碱处理可能更为敏感。
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