全 文 ：Vol. 29 , No. 6
pp. 899～902 　Nov. , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 6 期
2003 年 11 月 　899～902 页
核质互作型水稻线粒体不育基因的 RAPD 标记筛选
裴得胜1 ,2 　蔡平钟1 , 3 　李名扬2 　向跃武1 　阎文昭1 　张志雄1 　侯　磊2
张志勇1 　裴　炎2 Ξ
(1四川省农业科学院生物技术核技术研究所 ,四川成都 610066 ; 2 西南农业大学生物技术中心 ,重庆 400716)
摘 　要 　通过单因素的改变对核质互作型水稻线粒体 DNA 的 RAPD 反应条件进行优化 ,并在最佳条件下用 OPERON 公
司 OPA～OPM系列共 260 个随机引物筛选水稻 Ⅱ232 不育系、保持系、杂种一代线粒体 DNA 的差异片段 ,结果共获得 22
个差异带。其中 OPH1921800、OPJ092400、OPJ1821400、OPJ1821000、OPJ202300 这几个特异片段可能与水稻雄性不育相关。
我们正在用分子检测确定这些标记与细胞质雄性不育的关系。
关键词 　水稻雄性不育 ;线粒体 DNA ;RAPD分析 ;RAPD 标记
中图分类号 : S511 　　　文献标识码 : A
Screening of RAPD Markers for Sterility Gene of Nucleo2cytoplasmic Interaction in
Mitochondrial DNA of Rice
PEI De2Sheng1 ,2 　CAI Ping2Zhong1 　LI Ming2Yang2 　XIANG Yue2Wu1 　YAN Wen2Zhao1 　ZHANG Zhi2Xiong1 　HOU Lei2
ZHANG Zhi2Yong1 　PEI Yan2
(1 Institute of Biotechnological & Nuclear Technich , Sichuan Academy of Agricultural Sciences , Chengdou , Sichuan 610066 , 2 Center of Biotechnology , Southwest
Agricultural University , Chongqing 400716 , China)
Abstract 　The reaction conditions of RAPD for mitochondrial DNA of nucleo2cytoplasmic interaction rice were optimized by
changing a single factor. Under the optimum conditions , Ⅱ232 male sterility line , maintainer line and F1 hybrid mitochon2
drial DNA were screened by 260 RAPD primers from OPA to OPM. As a result , 22 differential fragments were found.
Among them , OPH1921800 , OPJ092400 , OPJ1821400 , OPJ1821000 and OPJ202300 might have relation with rice male ste2
rility. For further study , the relationship between the markers and cytoplasmic male sterility would be studied.
Key words 　Rice male sterility ; Mitochondrial DNA ; RAPD analysis ; RAPD marker
　　水稻雄性不育是培育杂交水稻的理论基础。自
1945年 Sears 提出植物雄性不育的“三型学说”以
来 ,探索水稻的雄性不育基因一直成为当前植物遗
传学研究的焦点之一。许多学者认为核质互作型水
稻雄性不育与线粒体基因组紧密相关[1～3 ] ,目前已
从线粒体基因组获得了与不育性相关的特异片段达
30 多个。研究材料的选择多以水稻包台型、野败
型、红莲型为主 ,其中对包台型的研究最深入[4 ,5 ] 。
但是以水稻印水型为材料的研究报道较少。本实验
以水稻印水型 Ⅱ232 不育系、保持系、杂种一代为研
究对象 ,通过利用 RAPD(Randomly Amplified Polymor2 phic DNA)技术筛选其中的差异片段 ,并进一步验证其与不育性的关系。RAPD 是一种有效的分子标记 ,自 1990 年 Williams 创立以来 ,它在生物学研究中得到了广泛应用[6 ] 。以 RAPD 所作的遗传标记符合孟德尔独立分离规律 ,它比 RFLP(Restriction Frag2ment Length Polymorphism)标记多态性高[7 ] ,而且在种质遗传多样性研究上具有同等效率[8 ] ;与 SSR (Sim2ple Sequence Repeats) 相比既能检测重复区 ,又能检测非重复区 ;此外它的检测范围能覆盖整个基因组[9 ] 。RAPD 应用较广 ,可用于构建遗传连锁图谱[10 ] 、基因定位[11 ] 、品种鉴定及亲缘关系研究[12 ] ,Ξ基金项目 :国家 863 计划项目 (2001AA2410112)和四川省十五育种攻关项目资助。
作者简介 :裴得胜 (1974 - ) ,男 ,湖北省黄冈地区英山县人 ,硕士。3 通讯作者 :蔡平钟 , E2mail : caipz44 @hotmail . com
Received(收稿日期) :2002204209 ,Accepted(接受日期) :2002206216.

特别应用于种内聚类分析是其他分子标记所无法比
拟的[13 ] 。但 RAPD 存在着稳定性差、重复性差等特
点。在研究每一特定的材料时 , 我们都应该对
RAPD 条件进行优化 ,以期达到最佳的实验效果。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
　　采用套袋方式获得高纯度的水稻印水型 Ⅱ232
不育系 (简称 Ⅱ232A ,下同) 和保持系 (简称 Ⅱ232B ,
下同) ,在严格隔离条件下获得高纯度的 F1 代 ( Ⅱ2
优 949) 。OPA2OPM共 260 个随机引物购自 OPERON
公司。Taq 酶、dNTPs、MgCl2 等购自华美生物工程公
司 (SABC) 。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　水稻线粒体 DNA 的提取 　　水稻黄化苗的
培育参见 Bring 方法[14 ] ,水稻线粒体的分离与其
DNA 的提取按 Pring 方法[15 ]进行。
1. 2. 2 　水稻线粒体 DNA 的 RAPD 条件优化 　　在
Hybaid PCR Express 扩增仪上以 Williams[6 ] 基本反应
体系为基础 ,其他条件不变而逐渐改变其中单一因
素以探求最佳的参数比例。反应体系总体积 25μL ,
程序参照 Williams[6 ] 略有修改 :预变性 94 ℃5 min ;
94 ℃1 min、36 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min 共 45 个循环 ;
72 ℃5 min ;最后于 4 ℃保存。扩增产物在 1. 4 %琼
脂糖凝胶中电泳 2 h (3 VΠcm) ,经 EB 染色后于 BIO2
RAD 凝胶成像分析系统 ( GEL DOC 1000)观察拍照。
1. 2. 3 　优化效果的检测　　在最佳反应条件下对水
稻效果线粒体DNA 进行 RAPD 研究 ,电泳后观察效果。
1. 2. 4 　引物的筛选及差异片段的标记 　　用 OPA
～OPM对 Ⅱ232A、Ⅱ232B、Ⅱ2优 949 进行引物筛选。
统计其中差异片段数目 ,并对显著的特异片段进行
分析。
2 　结果与分析
2. 1 　水稻线粒体 DNA的检测
　　提取的水稻线粒体 DNA 在 1. 0 % 的琼脂糖凝
胶中电泳 ,经 EB 染色观察。结果带型清晰 ,无拖尾
(图 1) 。在 DU Series 600 (Beckman)紫外可见分光光
度计上测定 A260ΠA280 = 1. 88 , A260ΠA230 = 2. 6 ,DNA 浓
度达到 1. 5μgΠμL。本实验提取纯化的线粒体 DNA
纯度和产量都较高。
2. 2 　RAPD 条件的优化
分别对 Mg2 + 、dNTPs、Taq 酶、模板 DNA、引物等
浓度设立梯度实验 (总体积为 25μL) ,结果表明最佳
的参数值为 :Mg2 + 浓度为 2. 0 mmolΠL (图 2) ;dNTPs
浓度为 200μmolΠL (图 3) ; Taq 酶用量为 1. 5 U (图
4) ;模板 DNA 浓度为 0. 5 ngΠμL (图 5) ;引物浓度为
0. 2μmolΠL (图 6) 。
根据上述优化参数值进行水稻线粒体 DNA 的
RAPD 扩增 ,琼脂糖凝胶电泳后 EB 染色结果扩增条
带清晰 ,无拖尾 (图 7) 。
2. 3 　引物筛选的结果
本实验共用 260 个随机引物 (OPA～OPM) 对 Ⅱ2
32A、Ⅱ232B、Ⅱ2优 949 进行扩增 ,除少数不产生扩
增带外其余扩增效果较好。在分析统计多态性时 ,
我们只考虑强带 ,共获得差异带 22 个。具体情况见
表 1。
表 1 RAPD 扩增水稻线粒体 DNA产生的差异带
Table 1 The result of differential fragments from rice
mitochondrial DNA by RAPD
特异片段
Specific fragment
Ⅱ232A Ⅱ232B Ⅱ2优 949 Ⅱ2you 949
OPA0224270 + - +
OPA042500 + - +
OPA0521000 + - +
OPA1621000 + - -
OPA1621400 + - -
OPA1821000 + - +
OPA1921000 + - +
OPA192831 + - +
OPB0221800 + - +
OPD052831 + + + +
OPE0521000 + - +
OPE1522000 + + + +
OPF1421200 + - -
OPH1921800 + + +
OPI1321000 + - -
OPI142500 + - -
OPI162500 + - -
OPJ092400 + - -
OPJ1821400 + - +
OPJ1821000 + - +
OPJ202300 + - -
OPM022500 - + +
　　注 : + 表示有 , - 表示无 , + + 表示条带亮度较强。
Note : + with , - without , + + strong fragments.
　　从表 1 中可看出 OPA1621000、OPA1621400、
OPF1421200、OPI1321000、OPI142500、OPI162500、
OPJ092400、OPJ202300 共 8 个在不育系中有的条带 ,
而在 F1 代缺失。按细胞质母性遗传规律 ,不育系线
粒体 DNA 中 RAPD 扩增出的条带 ,F1 代对应也能扩
增出。上述 8 个差异片段说明其 F1 代细胞质发生
分离。我们准备对杂种后代进行跟踪分析 ,通过建
立 BSA(Bulked Segregant Analysis)池分析后代中可育
池与不育池间的差异来研究其分离率。OPJ1821400
和 OPJ1821000 (图 8) 为不育系 A 与 F1 共有的特异
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带 ,它们在保持系 B 中的缺失可能引起育性的“缺
陷性”恢复。我们已把它们作为特异分子标记用于
辅助育种和分子标记检测种子的纯度。OPJ092400
(图 9)和 OPJ202300 (图 10)是不育系 A 的特有带 ,实
践中可用于鉴定 Ⅱ232A 的特异分子标记。另外值
得注意的条带 OPH1921800 (图 11) 存在于 Ⅱ232A、Ⅱ
优 949 中 ,但在 Ⅱ232B 中相应位置以两条带形式出
现。上表 1 中列出的 22 条特异带是否涉及到“缺陷
性不育”或“附加型不育”,而造成分子间或分子内重
排而影响不育性的表达有待进一步的研究。目前我
们正在进行斑点杂交 ,用与不育性相关的 8 个线粒
体基因探针 ( atpA、atp6、atp9、cox Ⅰ、cox Ⅱ、cob、
26S rrn、5S218S rrn) 与差异片段杂交 ,分析它们与探
针间的同源性 :并将作 Southern、Northern 杂交分析 ,
从转录水平及拷贝数的差异进一步研究它们与不育
性的关系。
图版说明 　Explanation of Plate
图 1 Ⅱ232A、Ⅱ232B、Ⅱ2优 949 线粒体 DNA 的提取　　Fig. 1 Extraction of Ⅱ232A , Ⅱ232B , Ⅱ2you 949 mitochondrial DNA 　　M2λDNA ΠEcoRⅠ
+ HindⅢ, A2Ⅱ232A mtDNA , B2Ⅱ232B mtDNA , C2Ⅱ2you 949 mtDNA 　　图 226 Mg2 + 、dNTPs、Taq 酶、模板 DNA、引物浓度对线粒体 DNA 的 RAPD
影响　　Fig. 226 RAPD of Mitochondrial DNA was affected by Mg2 , dNTPs , Taq enzyme , template DNA , and primer concentration 　　A20. 5 mmolΠL , B2
1. 0 mmolΠL , C21. 5 mmolΠL , D22. 0 mmolΠL , E22. 5 mmolΠL , M2λDNA ΠEcoRⅠ+ HindⅢ( Fig. 2) 　　A250μmolΠL , B2100μmolΠL , C2150μmolΠL , D2200
μmolΠL , M2λDNA ΠEcoRⅠ+ HindⅢ(Fig. 3) 　　A21. 0 U , B21. 5 U , C22. 0 U , D22. 5 U , E23. 0 U , M2λDNA ΠEcoRⅠ+ HindⅢ(Fig. 4) 　　A20. 1 ngΠμL ,
B20. 2 ngΠμL , C20. 3 ngΠμL , D20. 4 ngΠμL , E20. 5 ngΠμL , F20. 6 ngΠμL , M2λDNA ΠEcoRⅠ+ HindⅢ(Fig. 5) 　　A20. 1μmolΠL , B2 0. 2μmolΠL ,C20. 3μmolΠ
L , M2λDNA ΠEcoRⅠ+ HindⅢ(Fig. 6) 　　图 7 在优化条件下线粒体DNA 的 RAPD 扩增　　Fig. 7 Mitochondrial DNA was amplified by RAPD un2
der the optimum conditions 　　A2Ⅱ232A mtDNA , B2Ⅱ232B mtDNA , C2Ⅱ2you 949 mtDNA ; primer2OPI11 　　图 8211 用引物OPJ18、OPJ09、OPJ20、OPH19
对线粒体 DNA 进行 RAPD 获得的差异片段　　Fig. 82Fig. 11 The differential fragments from mitochondrial DNA amplified by primers OPH19 , OPJ09 ,
OPJ20 and OPJ18 　　A2Ⅱ232A mtDNA , B2Ⅱ232B mtDNA , C2Ⅱ2you 949 mtDNA , M2λDNA ΠEcoRⅠ+ HindⅢ　　! —表示差异片段的位置 It indicates the
location of differential fragment
109　6 期 裴得胜等 : 核质互作型水稻线粒体不育基因的 RAPD 标记筛选 　　　

3 　讨论
水稻线粒体 DNA 的 RAPD 反应涉及参数较多 ,
不恰当的参数设置将导致大量非特异的扩增 ,从而
影响 RAPD 反应的精确性。在 RAPD 反应中加入适
量浓度 (6 %～10 %) 二甲基亚砜 (DMSO) 有助于提高
其特异性[16 ] ;2. 5 %的甲醛或 50μmolΠL 氯化四甲胺
(TMAC)同样可起到提高其特异性的目的[17 ] 。也可
用 4 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳代替琼脂糖凝胶电泳
提高 RAPD 的稳定性[18 ] 。Lowe (1996) 认为在条件不
变的情况下 RAPD 可以得到重复的结果[19 ] 。Ried
(1994)认为对模板 DNA 用限制性内切酶消化可提
高 RAPD 的多态性[20 ] 。实际应用中我们可以将
RAPD 标记转化为特殊系列扩增 (SCAR) 而变成常规
的 PCR 标记[21 ] 。
对于水稻线粒体上的细胞质雄性不育 ,许多学
者认为是由于线粒体 DNA 分子突变和重组造成
的[22 ] ;线粒体 DNA 上的重复顺序可引起其异质
性[23 ] ,有些线粒体DNA 基因重排形成嵌合基因导致
雄性不育的形成[24 ] 。我们实验中优化后的 RAPD 很
好地揭示了 Ⅱ232A、Ⅱ232B、Ⅱ优 949 线粒体 DNA 的
多态性。它们中的特异片段是否涉及到基因的编码
序列和调控区域 ,或引起 RNA 的不同加工和编辑使
基因表达产物上产生差异 ,从而导致育性的改变 ?
我们将对特异片段进行 Southern、Northern 杂交分析 ,
从更深层次探讨水稻印水型雄性不育机理。另外核
质互作型水稻雄性不育还涉及核基因及叶绿体基
因 ,我们只有从形态学、生理学、DNA 水平和蛋白质
水平等方面进行综合分析才能真正揭示水稻雄性不
育的本质。
致 　谢 　本研究得到武汉大学朱英国教授的悉心指
导 ,在此深表感谢。
References
[1 ] 　Kadowaki K, Harada K. Differential organization of mitochondrial genes
in rice with normal and male sterile cytoplasm. Jpn J Breed , 1989 ,
30 :179 —186
[2 ] 　Iwashi M , Kyozuka J ,Shimamoto K . Processing followed by complete
editing of an altered mitochondrial atp6 RNA restores fertility of cyto2
plasmic male sterile rice. EMBO J , 1993 ,12 (4) : 1437 —1446
[3 ] 　Akagi H , Sakamoto M , Shinjyo C , Shimada H , Fujimura T. A unique
sequence located downstream from the rice mitochondrial atp6 may
cause male sterility. Curr Genet , 1994 ,25 (1) : 52 —58
[4 ] 　Akagi H , Nakamura A , Sawada R , Oka M , Fujimura T. Genetic diag2
nosis of cytoplasmic male sterile hybrid plants of rice. Theor Appl Gen2
et , 1995 ,90 :948 —951
[5 ] 　Iwashi M , ,Nakazono M , Kamo A , Sugino K, Ishibashi T , Hirai A.
Genetic and physical maps and a clone bank of mitochondrial DNA from
rice. Theor Appl Genet , 1992 ,84 :275 —279
[6 ] 　Williams J , Kubelik A K, Livak KJ . DNA polymorphic amplified by
arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research ,
1990 ,18 (22) : 6531 —6535
[7 ] 　Liu Z. Comparison of allozyme , RFLP and RAPD markers for revealing
genetic variation within and between trembling aspen and bigtooth as2
pen. Theor Appl Genet , 1993 ,87 :97 —105
[8 ] 　Ngoran J A K. Comparative genetic diversity studies of Theobroma ca2
cao L. using RFLP and RAPD markers. Heredity 1994 ,73 :589 —597
[9 ] 　Lin J J . Identification of molecular markers in soybean comparing
RFLP , RAPD and AFLP DNA mapping techniques. Plant Molecular
Biology Reporter , 1996 ,14(2) : 156 —169
[10 ] 　Kurata N , Nagnmura Y, Yamammoto K. A 300 kilobase interval ge2
netic map of rice including 833 expressed sequences. Nature Genetics ,
1994 ,8 :365 —372
[11 ] 　Wang B , Xu W , Wang J . Tagging and mapping the themosensitives
genic male sterile gene in rice ( Oryza sativa L. ) with molecular mark2
ers. Theor Appl Genet , 1995 ,91 :1111 —1114
[12 ] 　Welsh J , McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbi2
trary primers. Nucleic Acids Research , 1990 ,8 :7213 —7218
[13 ] 　Gilbert J E , Lewis R V , Wilkinson M J , Caligari P D S. Developing
an appropriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm
collection. Theor Appl Genet , 1999 ,98 :1125 —1131
[14 ] 　Bring G F , Robin J , Christopher J . Variation in mitochondral transla2
tion products associated with male2sterile cytoplasms in maize. Proc
Nalt Acad Sci USA , 1978 ,75(8) : 3841 —3845
[15 ] 　Pring D R , Leavings C S. Heterogeneity of maize cytoplasmic genomes
among male2sterile cytoplasm. Genetics , 1978 ,89 :121 —136
[16 ] 　Hung T , Mak Fong K. A specificity enhancer for polymerase chain re2
action. Nucleic Acids Research ,1990 , 18 :49 —53
[17 ] 　Sarkar G, Kapelner S , Sommer S. Formamide can dramatically im2
prove the specificity of PCR. Nucleic Acids Research ,1990 , 18 :7465
[18 ] 　Penner G A. Identification of RAPD markers linked to a gene govern2
ing Caxmium uptake in durum wheat. Genome ,1995 , 38 :543 —547
[19 ] 　Lowe A J . Identification of genetic marker linked to seedless genes in
grapes using RAPD. Biotechniques , Newsl , 1996 ,107 :50 —54
[20 ] 　Riede C R. Enhancement of RAPD analysis by restriction2endonucle2
ase digestion of template DNA in wheat plant breeding. Wheat Plant
Breeding , 1994 ,113 :254 —257
[21 ] 　Paran I , Michelmore W. Development of reliable PCR2based markers
linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet ,
1993 ,85 :985 —993
[22 ] 　Leavings C S , Dewey R E. Molecular studies of cytoplasmic male ste2
rility in Maize. In : Mitochondrial Biogenesis. Leaver CJ , Lonsdale D
M eds ,1988. 319 :177 —185
[23 ] 　Schardl C J , Pring D R , Lonsdale D M. Mitochondrial DNA rear2
rangements associated with fertile revertants of S2type male2sterile
maize. Cell , 1985 ,43(1) :361 —368
[24 ] 　Hanson M R. Plant mitochondrial mutations and male sterility. Ann
Rev Genet , 1991 ,25 :461 —486
209 　　　作 　　物 　　学 　　报 29 卷