全 文 ：云南美味牛肝菌 ITS 区域结构特点 ?
赵永昌 , 方 琳 , 张 荀 , 左文昊 , 李树红 ,
李 ? , 柴红梅 , 钟明惠
(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 , 云南 昆明 650223)
摘要 : 利用 ITS的通用引物 (ITS5-ITS4) 对云南的美味牛肝菌 ( Boletus edulis) 子实体的 DNA 进行 PCR 扩
增 , 扩增产物回收后直接测序。序列的聚类分析表明 , 在 ITS1-5 .8S rDNA-ITS2 区域 , 云南的美味牛肝菌与
欧洲的夏牛肝菌 ( B. aestivalis) 和铜色牛肝菌 ( B . aereus) 同源性较高 , 但在 ITS2 区域夏牛肝菌和铜色牛
肝菌分别有一段美味牛肝菌没有的大小分别为 73 bp和 26 bp的特征序列。
关键词 : 美味牛肝菌 ; 同源性 ; PCR
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2006)06 - 575 - 06
The Structural Characteristics of ITS Region of
Boletus edulis (Boletoueae) in Yunnan
ZHAO Yong-Chang, FANG Lin, ZHANG Xun, ZUO Wen-Hao, LI Shu-Hong,
LI Ran, CHAI Hong-Mei , ZHONG Ming-Hui
( Instituteof Biotechnology andGermplasm Resource, Yunnan Academy of Agricultural Science, Kunming 650223 , China)
Abstract: A pair of general primer ( ITS5-ITS4) was used to test in amplification of internal transcribed spacer ( ITS) re-
gion of chromosomal DNA of fruitingbodies of Boletusedulis in Yunnan . TheDNA amplification fragmentwas purified with
DNA Gel Extraction Kit and sequenced by CEQ8000 . The result of phylogenetic analyses based on ITS1-5 .8S-ITS2 se-
quences showed that B. edulis in Yunnan had high homologywith B. aestivalis and B. aereus inEurope . 73 bp and26 bp
DNA characteristic fragments differing from all B. eduliswere found in the ITS-region of B. aereus and B. aestivalis re-
spectively .
Key words: Boletus edulis; Homology; PCR
美味牛肝菌 ( Boletus edulis Bull . Fr .) 是世
界性的著名野生菌 , 在欧洲被称为“王者牛肝
菌” ( king bolete) , 中国是美味牛肝菌的主要分
布区域 , 美味牛肝菌在云南有广泛分布 , 其近缘
种夏牛肝菌 ( B. aestivalis (Paulet) Fr .) 和铜色牛
肝菌 ( B. aereus Bull . Fr .) 也有分布 , 但分布区
域小得多。ITS 技术是真菌鉴定和多样性研究较
好的技术手段 , 对云南美味牛肝菌的 ITS 结构进
行分析 , 不仅可以进一步确立中国美味牛肝菌的
生物学分类地位 , 同时还可提供美味牛肝菌及其
近缘种系统演化的分子依据。本文利用 ITS 技
术 , 研究云南美味牛肝菌主产地楚雄和昆明的美
味牛肝菌的 ITS1 和 ITS2 的结构特点。
1 材料与方法
1 .1 材料
研究用的美味牛肝菌采自昆明、楚雄 , 采集的标本
取单个子实体进行分类鉴定 , 样品处理好后单个包装冰
冻保存 , 研究用标本保存于云南省农业科学院生物技术
与种质资源研究所高等真菌研究室。本研究中使用的含
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (6) : 575～580
Acta Botanica Yunnanica

? ?收稿日期 : 2006 - 02 - 24 , 2006 - 07 - 10 接受发表
作者简介 : 赵永昌 (1964 - ) 男 , 副研究员 , 主要从事大型真菌资源研究。E - mail : yaasmushroom@ yahoo. com. cn
ITS1 或 ITS2 的材料见表 1。
1 .2 方法
1 .2 .1 DNA 的提取 选取没有虫蛀和病害的新鲜的子实
体一个 , 取下菌柄用小刀削去外皮 , 用无菌水清洗并用
吸水纸吸干水份 , 处理好的组织用 CTAB 法提取总 DNA。
1 .2 .2 ITS引物和 PCR 扩增 根据已报道的真菌、担子
菌和牛肝菌的 ITS序列 , 当 ITS片段包括部分 18S rDNA、
全部 ITS1、全部 5.8S rDNA、全部 ITS2 和部分 28S rDNA
时 , 设计一对通用引物 ( ITS4: 5′-T CCTCCGCTTATTGA-
TATGC-3′和 ITS5: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)
(White等 , 1990 ) , 引物由 Invitrogen公司合成。25μl 反
应体系包括 : 10×buffer2 .5μl , MgCl2 2μl , dNTP 0 .3μl,
引物 2μl, Taq酶 0 .2μl, DNA 模板 1μl , 无菌去离子水补
足 25μl, 扩增在 MJ 公司的 PTC-200 上进行 , 扩增程序 :
94℃ 5 min; 94℃ 40 s, 52℃ 1 min, 72℃ 1 min, 40 个循
环 , 72℃ 10 min。PCR 产物用 1 .5%的琼脂糖凝胶电泳检
测 , 对预测的电泳带切胶后用 V-gene公司的胶回收试剂
盒纯化回收 , 回收片段在云南省农业生物技术重点实验
室库尔特贝克曼测序室的 CEQ8000 上进行直接测序。
1 .2 .3 序列分析和比较 测定的序列用软件 DNAMAN
的 Maximum Likelihood方法进行聚类分析 , 在 ITS1-5.8S
rDNA-ITS2、ITS1 和 ITS2 序列水平上构建进化树 , 条件
为 : Bootstrap trials= 10000 , bootstrapping value= 90 % , un-
rooted。
表 1 用于 ITS 序列进化关系研究的美味牛肝菌及其近缘种的来源
Table 1 List of B . edulis and its allied species
序列号 拉丁名 产地 序列号 拉丁名 产地 序列号 拉丁名 产地
Accession Latin names Sources Accession Latin names Sources Accession Latin names Sources
AJ 416956 ?B ?. aestivalis 瑞 士 DQ131612 B . aereus 意大利 AY680990 B. edulis 意大利
AY130295 ?B. aestivalis 荷 兰 DQ131613 B . aereus 意大利 AY680991 B. edulis 意大利
AY278769 ?B. aestivalis 意大利 DQ131614 B . aereus 意大利 AY680992 B. edulis 意大利
AY680963 ?B. aestivalis 意大利 DQ131615 B . aereus 意大利 AY680993 B. edulis 意大利
AY680964 ?B. aestivalis 意大利 DQ131616 B . aereus 意大利 AY680994 B. edulis 意大利
AY680965 ?B. aestivalis 意大利 DQ131617 B . aereus 意大利 AY680995 B. edulis 意大利
AY680966 ?B. aestivalis 意大利 DQ131618 B . aereus 意大利 DQ002921 B. edulis 西班牙
AY680967 ?B. aestivalis 意大利 DQ131619 B . aereus 意大利 DQ002922 B. edulis 西班牙
AY680968 ?B. aestivalis 意大利 DQ131620 B . aereus 意大利 DQ002923 B. edulis 西班牙
AY680969 ?B. aestivalis 意大利 AY680981 B . ersonii 意大利 DQ131621 B. edulis 意大利
AY680970 ?B. aestivalis 意大利 AY680986 B . ersonii 意大利 DQ131622 B. edulis 意大利
AY680971 ?B. aestivalis 意大利 AY680989 B . enturii 意大利 DQ131623 B. edulis 瑞 典
DQ131607 ?B. aestivalis 意大利 AF074921 B . edulis 美 国 DQ131624 B. edulis 克罗地亚
DQ131608 ?B. aestivalis 意大利 AF419182 B . edulis 西班牙 DQ131625 B. edulis 意大利
DQ131609 ?B. aestivalis 意大利 AF438566 B . edulis 韩 国 DQ352861 B. edulis 中 国
DQ131610 ?B. aestivalis 瑞 典 AF438565 B . edulis 德 国 DQ397948 B. edulis 中国 ( 昆明 )
DQ131611 ?B. aestivalis 中 国 AJ416954 B . edulis 瑞 士 DQ397949 B. edulis 中国 ( 楚雄 )
AY680954 ?B. aereus 意大利 AJ416955 B . edulis 中 国 AY680972 B. pinophilus 意大利
AY680955 ?B. aereus 意大利 AY278764 B . edulis 意大利 AY680973 B. pinophilus 意大利
AY680956 ?B. aereus 意大利 AY680982 B . edulis 意大利 AY680974 B. pinophilus 意大利
AY680957 ?B. aereus 意大利 AY680983 B . edulis 意大利 AY680975 B. pinophilus 意大利
AY680958 ?B. aereus 意大利 AY680984 B . edulis 意大利 AY680976 B. pinophilus 意大利
AY680959 ?B. aereus 意大利 AY680985 B . edulis var H. 意大利 AY680977 B. pinophilus 意大利
AY680960 ?B. aereus 意大利 pusteriensis AY680978 B. pinophilus 意大利
AY680961 ?B. aereus 意大利 AY680987 B . edulis 意大利 AY680979 B. pinophilus 意大利
AY680962 ?B. aereus 意大利 AY680988 B . edulis 意大利 AY680980 B. pinophilus 意大利
2 结果
对 50 个采样点 121 个子实体的总 DNA 进行
了 PCR 扩增 , 所有样品都得到预期的片段 , 说
明引物 ITS5 和 ITS4 能较好地得到美味牛肝菌的
ITS 区域。
ITS 片段的测序结果表明 , 云南昆明和楚雄
美味牛肝菌的 ITS 区域大致分为两类 , 结果在
GenBank 上登记 (DQ397948 和 DQ397949 ) , 测序
结果与已知的美味牛肝菌及其近缘种 ( 表 1 ) 的
ITS 序列进行比较 , 考虑到 5 .8S rDNA 具有高度
保守性 , 分别构建 ITS1-5 .8S rDNA- ITS2、ITS1 和
ITS2 水平的进化树 , 聚类结果表明 ( 图 1 ) , 中
国的美味牛肝菌与欧洲夏牛肝菌的距离较近 , 在
ITS1-5 .8S rDNA- ITS2 和 ITS2 水平上的聚类可以将
中国的美味牛肝菌从欧洲的夏牛肝菌中分出 , 但
ITS1 水平的聚类则不能 , 同时发现 ITS1 水平上
韩国 (AF438566) 和德国 (AF438565 ) 的美味牛
肝菌与夏牛肝菌的距离较近。
675 云 南 植 物 研 究 28 卷
图 1 美味牛肝菌及其近缘种基于 ITS1-5 .8S rDNA-ITS2 (1) 、 ITS1 (2 ) 和 ITS2 (3 ) 的 Maximum Likelihood 进化树
Fig . 1 Maximum Likelihood tree obtained fromITS1-5 . 8S-ITS2 (1) , ITS1 (2 ) and ITS2 ( 3) sequences of B. edulis and its allied species
7756 期 赵永昌等 : 云南美味牛肝菌 ITS区域结构特点
Moor等 (2002) 通过测定美味牛肝菌和近缘
种的 ITS1 序列对来自中国的美味牛肝菌食品样
品进行鉴定 , 认为中国的美味牛肝菌与欧洲的美
味牛肝菌不是一个种 , 依据是 ITS1 区域序列同
源 性 和 ITS1 起 始 区 域 61 bp 片 段 ( AGG-
GAAGACGGATGGAGGAGTCAAGG CTGTCGC CG-
GCAACGTGCACGCCCCTTTCTCTTTC) 的缺失 , 在
GenBank上 注册的有 30 个序列 含该片段 , 除
B. edulis 外 B. aestivalis ( AY130295、AJ416956 )、
B. persoonii (AY680986、AY680981) 和 B. pinicola
(AJ419190) 也包含同样的序列。为深入探索云
南美味牛肝菌与欧洲美味牛肝菌及其近缘种的关
系 , 利用 ClustalX 1 .8 对美味牛肝菌及其近缘种的
ITS1-5 .8S rDNA-ITS2 序列进行比对研究 , 在 ITS1
区域没有发现种的特异性结构域 , 在 ITS2 区域存
在种的特征结构 (图 2) , 中国美味牛肝菌的 ITS2
区域结构与欧洲的美味牛肝菌相似 , 而与欧洲的
B. aestivalis和 B. aereus 差别较大 , 即 B. aestivalis
和 B. aereus 在 ITS2 区 域 有 26 bp ( TTGGTC-
CTTTTCACTTTGAAAGGGAT ) 和 73 bp (CATCGAGAAA
TAGACTCGAACCCTAAGCCTCAGTTACTAGTCACCGAC
GAACGCGAGGCCCCAAGT TCGAAAT ) 的特征序列 ,
B. aestivalis已注册的含 ITS2 区域的序列 16 个 , 除
DQ131611 (中国 ) 和 AY130295 (荷兰 ) 外 , 其余的
均包含特征序列 , B. aereus已注册含 ITS2 区域的序
列 18 个 , 全部包含特征序列 , B. edulis (包括 B. e-
dulisvar. pusteriensis) 已注册的含 ITS2 区域的序列没
有一个包含 B. aestivalis和 B. aereus的特征序列 ,
同样 B. personii、 B. verturii 和 B. pinophilus 也不
含特征序列。由此可以看出 , 在 ITS 区域美味牛
肝菌及其近缘种由于生物地理因素 , 种内差异可
能大于种间差异 , 乳牛肝菌 ( Suillus) 的研究结
果也支持这一结论 ( Wu等 , 2000)。
3 讨论
真菌分类学是按一定的原则将鉴定的真菌种
归类和命名的过程 , 这种分类的含义和指标一般
符合系统发育的原则 , 因为系统发育的亲缘关系
是生物进化过程的实际反映。不同真菌分类学家
对分类特征的认识和理解不同 , 提出的真菌分类
系统就有所不同。为了建立更能真实反映真菌系
统进化的分类系统 , 在传统的形态学基础上不断
发展新的分类性状 , 例如利用组织化学、营养不
亲和性、菌丝的交互不育等遗传学特性 ; 寄主或
基质、生物地理学等生物学特性 ; 蛋白质的序列
分析、同工酶分 析、血清学 等生化 性状 ; 以
DNA 为特征的 RFLP、RAPD 和核酸序列分析等
分子性状。
Wu等 (2000) 利用 ITS序列研究东亚和东北
美乳牛肝菌属 ( Suillus) 的多样性与生物地理关
系 , 结果表明中国的 S. spraguei 与美国的 S. deli-
cipiens亲缘关系近于美国的 S. spraguei , 中国的
S. sibiricus与美国的 S. americanus亲缘关系近于美
国的 S. sibiricus; Leonardi 等 ( 2005) 利用 ITS 技
术对美味 牛肝菌 种内和 种间变 化进 行评估 ,
ITS1-5 .8S- ITS2 聚类分析表明 , 在 ITS1 区域 B. e-
dulis 与 B. pinophilus 相似 , B. aestivalis 与 B. ae-
reus相似 , 在此区域变化小于 0 .5% , 但 ITS2 区
域显示较好的多样性 , 可以作为分离菌株和商品
食用菌鉴定的信息 ; Mello 等 ( 2006 ) 根据 ITS 的
通用引物扩增出 ITS 序列并测序 , 序列分析后设
计出鉴别市场上不同牛肝菌的 ITS 引物 , 但是只
通过扩增而不测定序列还是无法将美味牛肝菌
( B. edulis) 及其近缘种 B. aereus、 B. aestivalis、
B. pinophilus分开。本研究通过 ITS2 区域的结构分
析 , 只用 PCR 扩增就可把 B. aereus 和 B. aestivalis
从 B. edulis中分出 , 如以 ITS5 为 5′端引物 , 特征序
列 上 设 计 3′端 引 物 Paes ( 5′-TCCCTTTCAAAGT-
GAAAAGGACC-3′) 和 Paer ( 5′-AGCGCAAGCAGC-
CACTGATCAT TGA-3′) , 进行 PCR 扩增 , 产物大小
为 500 bp 左右 , 有扩增产物即为 B. aestivalis 和
B. aereus, 而不用进行测序。当然要利用 ITS 区
域设计美味牛肝菌的 PCR 特异引物需要更多研
究工作。
DNA 作为遗传物质能客观和真实地反映物
种之间的亲缘关系 , 对于丝状真菌菌株、大型真
菌标本鉴定和系统分类则是一种更有力的依据和
补充。近年利用 PCR 扩增真菌核糖体 ITS 基因片
段进行真菌鉴定技术得到了发展 , 由于这种技术
快速、准确和简便 , 可以结合传统分类方法建立
大型真菌的 ITS 分子指纹图谱 , 国内外许多学者
利用 ITS 区域的序列来研究真菌的种间系统发育
和分子分类 , 在种间亲缘关系的研究和疑难种的
确定上得到了大量有价值的结论 , ITS 技术已在
875 云 南 植 物 研 究 28 卷
图 2 美味牛肝菌及其近缘种 ITS2 区域序列比对 (“ ---”表示相同、“ . . .”表示缺失 )
Fig . 2 Sequence comparison of ITS2-region of B . edulis and its allied species (“ ---”symbolizes the same basepair as AY680957 ,
“ . . .” stands for the lack of a basepair)
9756 期 赵永昌等 : 云南美味牛肝菌 ITS区域结构特点
大型真菌菌株和难辨样品的鉴定中得到广泛应
用。美味牛肝菌及其近缘种在形态上较难识别 ,
DNA水平的识别将成为国家制定标准的依据 ,
欧洲已将分子检测作为打击食品欺诈的一种有力
工具 , 将设计引物检测中国的美味牛肝菌作为重
要的研究课题。
B. edulis、 B. aestivalis 和 B. aereus 在分类和
进化上是亲缘关系较近的种 , 而美味牛肝菌分布
地域较广差别较大 , 中国的美味牛肝菌在 ITS 结
构上与欧洲的美味牛肝菌相同 , 但在同源性又与
欧洲的 B. aestivalis较近 , 单就 ITS 区域看中国牛
肝菌处在一个中间位置 , 其在美味牛肝菌及其近
缘种进化过程中的作用是非常重要的 , 当然仅凭
ITS 的信息就对中国美味牛肝菌和其他美味牛肝
菌作比较还是不够的。因此 , 有必要结合形态特
征及其它的分子生物学方法 , 对中国的美味牛肝
菌及其近缘种作深入的研究 , 一方面可以确立中
国美味牛肝菌在分类学上的地位 , 另一方面也可
以为美味牛肝菌的系统演化提供分子上的依据。
〔参 考 文 献〕
Leon ?ardi M, Paolocci F , Rubini A , et al , 2005 . Assessment of inter-
and intra-specific variability in the main species of Boletus edulis
complex by ITS analysis [ J ] . FEMS Microbiol Lett, 243 ( 2 ) :
411—416
Mell ?o A , Ghignone S, Vizzini A , et al , 2006 . ITS primers for the
identification of marketable boletes [ J ] . J Biotechnol , 121 ( 3 ) :
318—29
Moor ?D, Brodmann P, Nicholas G, et al , 2002 . Polymerase chain re-
action ( PCR) for the detection of king bolete ( Boletus edulis) and
slippery jack ( Suillus luteus) in food samples [ J ] . Eur Food Res
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Whit ?e TJ , Bruns TD, Lee SB , et al , 1990 . Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [ A ] .
In: Innis MA , Gelfand DH , Sninsky JJ ed, PCR Protocols: A
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WuQ ?, Mueller GM, Lutzoni FM, et al , 2000 . Phylogenetic and biogeo-
graphic relationships of easternAsian and easternNorth American dis-
junct Suillus Species ( Fungi) as inferred from nuclear ribosomal RNA
ITS sequences [ J ] . Mol Phylogen Evol , 17 (1) : 37—47
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《云南植物研究》 近三年各项科学评价指标对比表
年份 影响因子 总被引频次 他引率
2003 ~0 =.409 725 A87 `%
2004 ~0 =.370 832 A84 `%
2005 ~0 =.590 897 A87 `%
数据来源 : 中国科学技术信息研究所编 , 中国科技期刊引证报告。
085 云 南 植 物 研 究 28 卷