全 文 ：结合叶绿体和核 DNA序列变异可提高云杉属物种的分子鉴别率*
邹嘉宾, 王摇 茜, 李丽丽, 刘建全**
(兰州大学生命科学学院草地农业系统国家重点实验室, 甘肃 兰州摇 730000)
摘要: 松科 (Pinaceae) 云杉属 (Picea) 植物是北半球广泛分布的重要森林树种, 由于频繁的种间杂交渐
渗及近期的辐射分化导致种间形态趋同, 传统的形态学方法很难准确鉴定该属物种。 近期兴起和发展的
DNA条形码技术为云杉属物种的划分和鉴定提供了可参考的方法。 在云杉属青藏高原种质资源收集过程
完成后, 选取 5 个叶绿体 DNA片段 (matK, rbcL, trnH鄄psbA, trnL鄄trnF和 trnS鄄trnG) 以及 3 个核 DNA 片
段 (4CL, Sb29 和 GI), 利用 PWG鄄distance和 Tree鄄Building两种方法对青藏高原以及中国其他地区分布的
19 个云杉属物种 83 个个体进行了物种鉴别分辨率的评价。 研究结果显示单个的叶绿体 DNA 片段
(10. 5% ~ 26. 3% ) 和核 DNA片段 (15. 8% ~ 26. 3% ) 对云杉属物种鉴别的分辨率较低, 组合的叶绿体
DNA片段的分辨能力 (15. 8% ~ 42. 1% ) 虽然高于单个 DNA 片段, 但分辨率最高的 trnH鄄psbA+trnS鄄trnG
和 trnS鄄trnG+trnL鄄trnF两个组合也只能达到 42. 1% ; 组合的核 DNA片段 (26. 3% ~ 36. 8% ) 一样对云杉属
物种鉴别存在困难。 但是叶绿体 DNA片段和核 DNA 片段的组合可以明显提高对云杉属物种鉴定的分辨
率, 尤其是 trnS鄄trnG+trnL鄄trnF+4Cl的组合片段, 其分辨率可达到 57. 9% 。 因此在将来利用 DNA条形码鉴
别物种时, 在常规 DNA条形码片段不起作用的情况下, 可采用这种叶绿体 DNA 片段和核 DNA 片段组合
的方法来鉴定和区分植物物种。
关键词: 云杉属; DNA条形码; 核 DNA片段; 物种鉴别
中图分类号: Q 949; Q 75摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)03-375-11
The Combination of Chloroplast and Nuclear DNA Fragments
Could Improve the Discrimination Power for
Barcoding Spruce (Picea) Species
ZOU Jia鄄Bin, WANG Xi, LI Li鄄Li, LIU Jian鄄Quan**
(State Key Laboratory of Grassland Agro鄄Ecosystem, College of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)
Abstract: Spruces (Picea), a genus of Pinaceae, are important components of the forests in the Northern Hemi鄄
sphere. It is relatively difficult to distinguish species by using traditional morphological method due to frequent inter鄄
specific hybridization and introgression, and radiative diversification. However, the emerging and developing of the
DNA barcoding methods provide an alternative approach. In this study, we tested the discrimination powers between
five chloroplast DNA regions (matK, rbcL, trnH鄄psbA, trnL鄄trnF and trnS鄄trnG), three nuclear DNA regions
(4CL, Sb29 and GI) and the combination of these fragments in spruces. We sampled 83 trees, which represent 19
spruce species mainly from Qinghai鄄Tibetan Plateau and also from other regions of China. We used two methods,
PWG鄄distance and Tree鄄Building, to conduct barcoding analsyes. A single chloroplast DNA fragment (10. 5% -
26. 3% ) or a single nuclear DNA fragment (15. 8% -26. 3% ) always shows low level of species discrimination
rate. Although the combination of the chloroplast DNA fragments had higher discrimination rate than the single one,
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (3): 375 ~ 385
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313083
*
**
基金项目: 科技部科技基础性工作专项重点项目 (2007FY110100) 和国家自然科学基金项目 (30930072)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: liujq@ nwipb. ac. cn
收稿日期: 2013-04-09, 2013-04-12 接受发表
作者简介: 邹嘉宾 (1987-) 男, 博士, 主要从事群体遗传学研究。
the highest rate of discrimination was only 42. 1% for both combinations of trnH鄄psbA+ trnS鄄trnG and trnS鄄trnG+
trnL鄄trnF. And the combination of the nuclear DNA fragments also showed lower rates of discrimination (26. 3% -
36. 8% ). It thus appears that it is difficult to discriminate spruce species using only chloroplast DNA fragments or
nuclear DNA regions. However, the combination of chloroplast and nuclear DNA regions had higher resolution for i鄄
dentifying spruce species, especially for trnS鄄trnG+trnL鄄trnF+4Cl, whose discrimination rate can reach up to 57. 9% .
Therefore, in the future, this combination of fragments from chloroplast and nuclear can be widely adopted for the
discrimination of plant species when the normal DNA barcodes fail to work.
Key words: Picea; DNA barcoding; Nuclear DNA fragments; Discrimination
摇 云杉属 (Picea) 是松科 ( Pinaceae) 第三
大属, 按照目前广为接受的 Farj佼n (2001) 对云
杉属的分类, 全世界约有 34 个种, 其中亚洲分
布有 24 个种。 云杉属是广泛分布于北半球的重
要森林树种, 具有非常重要的生态及经济价值。
中国境内云杉属分布有 17 个种, 包括云杉 (Pi鄄
cea asperata), 青海云杉 (P. crassifolia), 红皮
云杉 (P. koraiensis), 白扦 (P. meyeri), 新疆云
杉 (P. obovata), 鳞皮云杉 (P. retroflexa), 紫
果云杉 (P. purpurea), 青扦 (P. wilsonii), 大果
青扦 (P. neoveitchii), 台湾云杉 (P. morrisonico鄄
la), 鱼鳞云杉 (P. jezoensis), 麦吊云杉 ( P.
brachytyla), 缅甸云杉 (P. farreri), 丽江云杉
(P. likiangensis), 长叶云杉 (P. smithiana), 雪
岭云杉 (P. schrenkiana)和西藏云杉 ( P. spinu鄄
losa); 其中丽江云杉 (P. likiangensis) 可根据形
态差异细分为 5 个变种, 其中 3 个变种 ( var.
likiangesis, var. rubescens 和 var. linzhiensis) 有
明显不同的形态特征且广泛分布于西藏东部, 四
川西部及云南西北部地区; 麦吊云杉 ( P.
brachytyla) 可以根据形态差异被细分为 var.
brachytyla 和 var. complanata 两个变种 ( Fu 等,
1999)。 上述云杉属植物种的划分都是基于传统
的形态学分类方法, 如针叶形态, 气孔线的条数
及球果大小等。 但由于云杉属植物辐射分化、 具
有大的有效群体、 长的世代时间和风媒传粉的特
征, 导致物种间杂交频繁, 形态趋同严重, 物种
鉴别存在较大困难 (Li 等, 2010; Du 等, 2011;
Zou等, 2012)。 但是, 准确鉴别云杉属物种,
在理论和实践上都具有重要意义。
近年来兴起和发展的 DNA 条形码技术为解
决云杉属内物种的划分和鉴定提供了可参考的方
法。 Hebert等 (2003) 正式提出将 DNA 条形码
用于分类学研究, 即利用一个或多个 DNA 片段
通过系统发育和聚类分析来实现对物种快速准确
的鉴定。 这种方法一经提出便得到广泛应用。 多
个研究发现利用线粒体 CO1 基因 (cytochrome c
oxidase subunit 1 gene, 细胞色素氧化酶亚基 1 基
因) 作为 DNA 条形码可以高效地识别动物物
种, 例如两栖类 ( Vences 等, 2005; Smith 等,
2008), 鸟类 (Hebert 等, 2004; Kerr 等, 2007)
和鱼类 (Ward 等, 2005, 2009)。 但是, 由于在
植物中线粒体基因的突变速率较低 ( Cho 等,
2004) 且存在频繁的结构重排现象 (Palmer 和
Herbon, 1988), 使得 CO1 这样的线粒体基因不
能成为普遍通用的植物 DNA 条形码 ( Fazekas
等, 2008)。 因此, 现在多选择进化速率较快的
叶绿体基因片段和核基因组的核糖体 DNA 转录
间隔区 (ITS) 作为鉴别植物物种的 DNA条形码
(Kress 等, 2005; Cowan 等, 2006; Pennisi 等,
2007; CBOL Plant Working Group, 2009; Li 等,
2011; Hollingsworth, 2011)。 在综合考虑了通用
性, 序列质量和物种鉴定水平等方面的因素后,
生命条形码联盟植物工作组 (CBOL Plant Work鄄
ing Group, 2009) 建议使用 matK+rbcL的组合片
段作为鉴定陆地植物的核心 DNA 条形码, 并建
议将叶绿体基因 trnH鄄psbA 片段和核 ITS 片段作
为补充的 DNA条形码 (Hollingsworth等, 2011)。
尽管上述叶绿体 DNA 片段和核 ITS 片段在
多数被子植物属中具有较高的物种鉴别率
(Fazekas等, 2008; Li等, 2011), 但这些片段对
裸子植物的物种鉴别率非常低, 不足以对物种进
行准确的鉴定 (Ran 等, 2010; Hollingsworth 等,
2011)。 ITS片段只在裸子植物中长度变异大,
在部分属内致同进化还不完全 (Kan 等, 2007),
且序列扩增困难, 使其不能在裸子植物中作为通
用的 DNA条形码。 Ran 等 (2010) 利用 7 个叶
绿体 DNA 片段对云杉属的 DNA 条形码研究发
673摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
现, 由于种间的不完全谱系筛选, 近期辐射分
化, 以及频繁的种间渐渗, 无论是单个片段还是
多个组合片段都不能有效的分辨中国分布的云杉
属物种。 因此, 他们建议除了利用单亲遗传的叶
绿体 DNA片段, 还应选取合适的核 DNA片段作
为鉴定云杉属植物的 DNA补充条形码。
为验证这一可能性, 本研究在我们长期采集
青藏高原云杉属种质资源基础上, 收集了中国其
他地区分布的云杉属物种, 进行系统的比较研
究。 共收集中国云杉属的所有 19 个种, 包括丽
江云杉 3 个变种和麦吊云杉 2 个变种。 对于每个
物种, 均采用 Li 等 (2011) 的建议, 至少采集
2 个样本。 我们研究了 3 个常用的叶绿体 DNA
条形码片段 (matK, rbcL和 trnH鄄psbA)、 2 个候
选的叶绿体 DNA 片段 ( trnL鄄trnF 和 trnS鄄trnG)
以及 3 个核 DNA片段 (4CL, Sb29 和 GI); 通过
构建系统树和聚类分析对这些片度及其组合对中
国云杉属物种的分子鉴别率进行评估, 并尝试筛
选出适合用于该属物种鉴别的 DNA 条形码片段
或片段组合, 为将来该属植物的鉴定及分类提供
参考依据。
1摇 材料和方法
1. 1摇 研究材料
本研究选取了云杉属 19 个物种的 83 个个体作为研
究材料, 每个物种包括 2 ~ 5 个个体, 详细材料信息见表
1。 所选实验材料均为野外采集的针叶, 采集后经硅胶
快速干燥以备 DNA的提取。 凭证标本存兰州大学生命科
学学院 (LZU)。
1. 2摇 DNA提取, 聚合酶链式反应 (PCR) 及测序
采用 CTAB 法 (Doyle和 Doyle, 1987) 从大约 20 mg
经硅胶干燥的针叶里提取全基因组 DNA, 溶解于 TE 溶
液中的 DNA终浓度为 50 ng·滋L-1。 PCR扩增反应在 ABI
9700 型 PCR 仪上进行, PCR 反应体系 (25 滋L): DNA
模板 10 ~ 40 ng; 50 mM Tris鄄HCl, 1. 5 mM MgCl2, 0. 5
mM dNTPs, 以及各 2 滋M 的正反引物, 0. 75 单位的 Taq
DNA 聚合酶。 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,
合格产物纯化后在 ABI3130 xl Genetic Analyzer (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) 型测序仪上进行测
序。 本研究中所有 DNA 片段使用的 PCR 扩增和测序的
引物相同, 详细信息见表 2。 为了保证序列的准确性,
经过重复测序排查了序列中的单碱基突变。 所有序列用
MEGA 4. 0 (Kumar等, 2008) 进行拼接, 然后利用 Clust鄄
al X (Thompson等, 1997) 进行序列的比对和人工校正。
7733 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 邹嘉宾等: 结合叶绿体和核 DNA序列变异可提高云杉属物种的分子鉴别率摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
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表 2摇 用于 “条形码分类冶 的 8 个片段的引物信息表
Table 2摇 Primer pairs used for amplification and sequencing for DNA barcoding
片段 Region 引物 Primers 序列 Sequences (5爷-3爷) 来源 Reference
matK matK F GAACTCGTCGGATGGAGTG This study
matK R TAAACGATCCTCTCATTCACGA This study
rbcL rbcL 1F ATGTCACCACAAACAGAAAC Ivanova等, 2008
724R TCGCATGTACCTGCAGTAGC Ivanova等, 2008
trnH鄄psbA trnH2 CGCGCATGGTGGATTCACAATCC Tate和 Simpson, 2003
psbAF GTTATGCATGAACGTAATGCTC Sang等, 1997
trnL鄄trnF trnL CGAAATCGGTAGACGCTACG Taberlet等, 1991
trnF ATTTGAACTGGTGACACGAG Taberlet等, 1991
trnS鄄trnG trnS GCCGCTTTAGTCCACTCAGC Hamilton, 1999
trnG GAACGAATCACACTTTTACCAC Hamilton, 1999
4CL MontF GCCAATCCTTTTTACAAGC Syring等, 2005
4clRStrob CTGCTTCTGTCATGCCGTA Syring等, 2005
Sb29 Sb29 F AGCGGCATTGAACAGAGTAAC Perry和 Bousquet, 1998
Sb29 R AATGGAAATGAAGGCAGACTC Perry和 Bousquet, 1998
GI GI560U CAGGCAAGGCAATGGCAGAAGGGC Heuertz等, 2006
GI2235L ATACAAGTCCCGCATGGCTGTTAT Heuertz等, 2006
1. 3摇 数据分析
利用 DnaSP 5. 0 软件 (Librado和 Rozas, 2009) 统计
了每个片段的插入缺失 ( indels) 和单核苷酸多态性
(SNPs)。 本研究将 8 个 DNA 片段单独构建矩阵, 从 5
个叶绿体 DNA片段选取其中 2 个、 3 个、 4 个或全部片
段组合并且将 3 个核 DNA片段两两组合或全部组合来构
建矩阵, 此外还将分辨能力达到最高的两两组合的叶绿
体 DNA片段与单个核基因片段或与分辨率达到最高的
核基因组合片段 (4CL+GI) 联合构建矩阵来评估联合的
DNA 条形码对于云杉属物种的鉴别能力。 利用 MEGA
4.0 (Kumar等, 2008) 软件进行 Kimura鄄2鄄parameter遗传距
离分析, 同时构建单独片段以及片段组合的邻接 (NJ)
树。 另外, 利用 PWG 距离法 ( PWG鄄Distance) 和构建
NJ系统聚类树 (Tree鄄Building) 两种不同的方法对物种
的鉴定率进行评估。 生命条形码联盟植物工作组 (CBOL
Plant Working Group) 推荐使用的 PWG 距离法认为, 种
间最小的遗传距离大于种内最大的遗传距离则认为物种
鉴定成功。 而利用构建系统聚类树的方法时, 只有同一
个物种的不同个体在构建的 NJ 系统树上形成单系分支
才认为物种鉴定成功。
2摇 结果
2. 1摇 序列信息
本研究中所采用的 5 个叶绿体 DNA 片段和
3 个核 DNA片段的长度和变异位点信息见表 3。
所有片段的测序成功率均为 100% , 共得到 415
条叶绿体 DNA序列和 249 条核 DNA序列。 比对
表 3摇 用于 “条形码分类冶 的八个片段的长度, 测序成功率和变异位点信息
Table 3摇 Length, sequencing success and variation of each DNA region and the combination of the five plastid regions
片段
Region
比对长度
Aligned length / bp
测序成功率
Sequencing success / %
SNPs位点数
No. of SNPs
插入缺失数
No. of indels
变异位点摇 摇
No. of variable sites / %
matK 945 100 13 0 13 (1. 38) 摇 摇
rbcL 676 100 6 0 6 (0. 888) 摇
trnH鄄psbA 604 100 11 0 11 (1. 82) 摇 摇
trnL鄄trnF 709 100 7 2 9 (1. 27) 摇 摇
trnS鄄trnG 626 100 8 3 11 (1. 76) 摇 摇
4CL 600 100 32 0 32 (5. 33) 摇 摇
Sb29 428 100 25 2 27 (6. 31) 摇 摇
GI 679 100 23 1 24 (3. 53) 摇 摇
Five plastid regions 3 560 — 45 5 50 (1. 40) 摇 摇
9733 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 邹嘉宾等: 结合叶绿体和核 DNA序列变异可提高云杉属物种的分子鉴别率摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
后的 5 个叶绿体 DNA 片段的矩阵长度从 604 bp
( trnH鄄psbA) 到 945 bp (matK) 不等, 联合后的
总长度为 3 560 bp, 总计包含 45 个 SNPs 位点和
5 个 indels (其中 2 个 indels 来自于 trnL鄄trnF 片
段, 3 个 indels 来自 trnS鄄trnG 片段), 变异位点
的比例为 1. 40% 。 比对后的 3 个核 DNA 片段的
矩阵长度从 428 (Sb29) 到 679 (GI) 不等, 但
变异位点的数目明显多于叶绿体 DNA 片段。 其
中 4CL片段的变异位点数最多 (32 个), 占该片
段长度的 5. 33% ; 其次为 Sb29 片段 (27 个),
但占其片段长度的比例为最高 ( 6. 31% ); GI
片段的变异位点数最少 (24 个), 占其片段长度
的 3. 53% 。
2. 2摇 物种分辨率
本研究采用 PWG鄄distance和 Tree鄄Building两
种方法, 比较了每个片段及其相互组合对云杉属
19 个物种的鉴别率 (图 1)。 PWG鄄distance 分析
结果显示, 单个叶绿体 DNA 片段中 trnS鄄trnG 的
物种分辨率最高 (26. 3%), 能区分 19 个物种中
的5个; 其次是matK, 可以区分4个种 (21. 1%);
其余 3个片段 ( rbcL, trnH鄄psbA和 trnL鄄trnF) 的
鉴定能力很低, 只能区分 2个种 (10. 5%)。 单个
核 DNA片段中 4CL的物种分辨率最高 (26. 3%),
明显高于 Sb29 和 GI 的分辨率 (均为 15. 8% )。
叶绿体 DNA两片段组合的物种分辨能力明显高
于单个 DNA 片段的分辨能力。 其中, trnH鄄psbA
+trnS鄄trnG和 trnS鄄trnG+trnL鄄trnF组合的物种分辨
能力最好, 能区分 19个物种中的 8 个 (42. 1%),
与所有 5 个片段一起组合的鉴定能力相当; 而生
命条形码联盟植物工作组推荐的 matK+rbcL组合
只有 26. 3%的鉴定能力; rbcL+trnL鄄trnF和 trnH鄄
psbA+ trnL鄄trnF 这两个组合的鉴定能力很低, 只
能区分 3 个物种 (15. 8% )。 所有 3 个和 4 个叶
绿体 DNA组合片段的分辨能力在 21. 1% ~42. 1%
之间, 最高的分辨率也没有超过两个片段组合的
分辨率 (图 1中未展示有关结果)。 不同组合的核
DNA片段的分辨率在 26. 3% (GI+Sb29) ~ 36. 8%
(4CL+GI) 之间, 分辨能力稍好于单个片段。 进
一步的分析显示, 叶绿体 DNA 片段和核基因片
段联合构建的组合片段对云杉属物种的鉴别能力
图 1摇 云杉属单个和多个 DNA片段的物种分辨率
Fig. 1摇 Species discrimination rate of all tested single鄄 and multi鄄 DNA regions in Picea
M, matK; R, rbcL; H, trnH鄄psbA; S, trnS鄄trnG; L, trnL鄄trnF; C, 4CL; Sb, Sb29; G, GI; NJ, neighbor joining
083摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
较好, 分辨率在 26. 3% ~ 57. 9%之间, 多数联
合片段物种分辨率超过 31. 6% ; 其中和核基因
4CL片段构建的联合片段分辨能力最好 (所有与
之联合的片段组合都超过 42. 1% ), 特别是 trnS鄄
trnG+trnL鄄trnF+4Cl的组合片段能够鉴定 19 个物
种中的 11 个物种, 分辨率可达到 57. 9% 。
3摇 讨论
3. 1摇 叶绿体 DNA片段及单个核 DNA 片段对云
杉属物种的分辨率较低
研究结果显示单个的叶绿体 DNA片段 (10. 5%
~26.3%) 对云杉属物种的分辨率较低。 组合的叶
绿体 DNA片段的分辨能力 (15. 8% ~42. 1%) 虽
然高于单个 DNA片段, 但两两组合的 DNA片段
中分辨率最高的 trnH鄄psbA+trnS鄄trnG和 trnS鄄trnG
+trnL鄄trnF两个组合也只能成功鉴定 19 个种中的
8 个种。 由于使用叶绿体基因鉴定植物类群存在
上限 (Lahaye 等, 2008; Fazekes 等, 2009), 在
两两组合的基础上增加片段组合 (如 3 个或 4 个
叶绿体 DNA片段组合) 都不能进一步提高物种
分辨率。 尽管在裸子植物中, 双亲遗传的核基因
相比单亲遗传的叶绿体基因有更快的突变速率,
能提供更加丰富的遗传信息, 但本研究结果显示
无论是单个的核 DNA片段 (15. 8% ~26. 3%) 还
是不同核 DNA 片段的组合 (26. 3% ~ 36. 8% )
对该属的物种鉴定效率都很低。 DNA 条形码对
云杉属物种较低的鉴定率可能是由多个因素造成
的。 首先, 云杉属内近缘物种之间频繁的杂交渐
渗 (Li等, 2010; Du等, 2011; Zou等, 2012), 种
间存在大量共享基因型, 导致单个或少量 DNA
条形码片段难以分辨。 例如, P. purpurea 被推测
可能是 P. likiangesis 和 P. wilsonii 的杂交物种,
由于反复回交导致 P. purpurea 和 P. wilsonii 共享
大量细胞质基因型 (Li 等, 2010), 使两物种之
间的 DNA 变异界限模糊难以分辨 (图 2)。 其
次, 由于云杉属内物种近期的辐射分化 (Ran
等, 2006), 导致种间形态趋同且短时间内没有
积累足够的遗传变异, 物种分辨困难。 例如分布
于青藏高原及其周边地区的 P. likiangesis, 其所
包含的 3 个变种可能是由于近期分化而形成的,
种间遗传差异小, 在进化树上难以形成单系
(图 2, 3)。 此外, 传统的形态学分类存在缺陷,
对云杉属内物种的划分不尽合理, 影响物种鉴定
的成功率。 按照 Farj佼n (2001) 对云杉属物种的
分类, 将云杉复合体 (P. asperata complex, Du
等, 2009) 划分为 5 个种 (P. asperata,P. crassi鄄
folia, P. koraiensis, P. meyeri, P. obovata), 而本
研究的结果显示除核基因 4CL 片段能成功鉴定
P. obovata 外, 其余 4 个种都不能被成功分辨,
物种划分可能有不合理之处; 或这些物种是近期
分化而成, 尚未积累足够的遗传分化。 另外, 由
于裸子植物有较长的世代时间, 不完全的谱系筛
选导致保留大量祖先多态性和低水平的种间分化
(Syring 等, 2007; Willyard 等, 2009; Chen 等,
2010), 阻碍了对云杉属物种的鉴定。 综上原
因, 使用叶绿体 DNA片段及单个核 DNA片段对
云杉属植物进行鉴定存在困难。
3. 2摇 叶绿体 DNA片段和核 DNA 的片段组合对
云杉属物种具有较好的分辨能力
本研究利用核基因 4CL 片段对云杉属物种
的分辨率分析发现, 尽管总体的鉴定能力较低,
但该片段能够成功鉴定叶绿体 DNA 片段不能分
辨的杂交物种 P. purpurea (图 3)。 一些研究发
现在缺少核 DNA 条形码的情况下可能会错误地
鉴定某些具有大量物种的植物类群 (Chase 等,
2005, 2007; Chase和 Fay, 2009; Ford 等, 2009;
Li等, 2011), 因此利用核 DNA片段作为补充的
DNA条形码应该成为一种趋势。 对于云杉属这
种只靠单个或数个叶绿体 DNA 条形码片段很难
鉴定的植物类群, Ran 等 (2010) 建议可用核
DNA片段作为合并的 DNA 条形码来提高对该属
物种的鉴定水平。 本研究发现, 利用两两联合的
叶绿体 DNA片段和核基因片段联合构建的组合
片段对云杉属物种的分辨能力显著提高, 其中和
核基因 4CL片段构建的联合片段分辨能力最好,
特别是 trnS鄄trnG+trnL鄄trnF+4CL 的组合片段, 其
分辨率能达到 57. 9% 。 由此可以看出, 结合不
同来源的基因组片段可提高对云杉属物种的鉴定
能力。 因此, 本研究表明: 在将来利用 DNA 变
异鉴别植物物种的研究分析中, 在常规 DNA 条
形码片段不起作用的情况下, 可采用这种结合常
规 DNA条形码片段和核基因 DNA片段的方法来
鉴别一些属内的植物物种。
1833 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 邹嘉宾等: 结合叶绿体和核 DNA序列变异可提高云杉属物种的分子鉴别率摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 基于 5 个叶绿体 DNA片段联合构建的 NJ树。 三角形代表利用 Tree鄄building方法被成功鉴定的物种
Fig. 2摇 A NJ tree based on the combination of all five chloroplast DNA regions. Species with solid triangles were
successfully delimited using the Tree鄄building method
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图 3摇 基于核基因 4CL构建的 NJ树。 三角形代表利用 Tree鄄building方法被成功鉴定的物种
Fig. 3摇 A NJ tree based on the nuclear 4CL gene. Species with solid triangles were
successfully delimited using the Tree鄄building method
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