全 文 ：毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ基因克隆及表达分析∗
刘　 博ꎬ 沙　 伟∗∗ꎬ 张梅娟ꎬ 宋　 璐ꎬ 安洪雪
(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院ꎬ 黑龙江 齐齐哈尔　 １６１００６)
摘要: 从毛尖紫萼藓干旱 ｃＤＮＡ文库中筛选了一条与抗旱相关的泛素羧基末端水解酶基因的 ＥＳＴ序列ꎬ 采
用 ＲＡＣＥ技术从毛尖紫萼藓中克隆出了该基因的 ｃＤＮＡ全长序列ꎬ 命名为 ＧｐＵＣＨꎮ 对该基因的序列特征、
进化关系和表达谱进行了分析ꎬ 为全面研究其功能奠定了基础ꎮ 该基因 ｃＤＮＡ 全长 ９５１ ｂｐꎬ 开放阅读框
７１１ ｂｐꎬ 共编码 ２３６个氨基酸ꎮ 生物信息学分析显示ꎬ ＧｐＵＣＨ 基因相对分子质量为 ２５􀆰 ７ ｋＤꎬ 等电点为
４􀆰 ６７ꎬ 为不稳定蛋白ꎬ 属于跨膜蛋白但不存在信号肽ꎮ 系统进化树分析表明ꎬ ＧｐＵＣＨ 与小立碗藓 ＵＣＨ 蛋
白一致性较高ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ结果显示ꎬ ＧｐＵＣＨ基因在复水和干旱的条件下均能表达ꎬ 但是在不同
的条件下表达情况差异显著ꎮ 表明该基因可能在毛尖紫萼藓干旱过程中发挥一定的作用ꎮ
关键词: 毛尖紫萼藓ꎻ ＧｐＵＣＨ基因ꎻ 克隆ꎻ 序列分析ꎻ 基因表达
中图分类号: Ｑ ７８　 　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１４)０３－３５８－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧｐＵＣＨ
Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ
ＬＩＵ Ｂｏꎬ ＳＨＡ Ｗｅｉ∗∗ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｍｅｉ￣Ｊｕａｎꎬ ＳＯＮＧ Ｌｕꎬ ＡＮ Ｈｏｎｇ￣Ｘｕｅ
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｅｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｇｒｏｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｑｉｑｉｈａｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｑｉｑｉｈａｒ １６１００６ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｄｒｏｕｇｈｔ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｄｒｏｕｇｈｔ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａꎬ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｄ
ｔｏ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ (ＵＣＨ)ꎬ ｎａｍｅｄ ＧｐＵＣＨ. Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ
ｆｒｏｍ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ (ＲＡＣＥ). Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧｐＵＣＨ
ｇｅｎｅꎬ ｉｔ ｗａｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｄｅｓｃｒｉｂｅ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎬ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｔｈｅ
ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｗａｓ ９５１ ｂｐ ｗｉｔｈ ａｎ ｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ７１１ ｂｐ ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｄ ２３７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ２５􀆰 ７ ｋＤꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｉｓ ４􀆰 ６７. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｕｎｓｔａ￣
ｂｌｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ. Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＧｐＵＣＨ ａｎｄ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ
ｐａｔｅｎｓ ＵＣＨ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ａ ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ. ＱＲＴ￣ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎ￣
ｄｕｃｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ. Ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ｗｅｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｖａｒｉ￣
ｕｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ＧｐＵＣＨ ｇｅｎｅ ｍｉｇｈｔ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａꎻ ＧｐＵＣＨ ｇｅｎｅꎻ Ｃｌｏｎｅꎻ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　 泛素 (Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎꎬ Ｕｂ) 是 Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ (１９７５)
首次发现的广泛存在于真核细胞内并由 ７６ 个氨
基酸组成的高度保守的多肽ꎮ 由于它存在的普遍
性ꎬ 因此又被称为遍在蛋白ꎮ 泛素系统的主要功
能是选择性的降解蛋白质ꎬ 而蛋白降解的一个重
要的、 基本的功能是维持细胞内环境稳定ꎮ
机体内有许多重要的生命过程均由靶蛋白的
泛素化来控制 (Ｈｅｒｓｈｋｏ等ꎬ １９９８ꎻ Ｐｉｃｋａｒｔ和 Ｅｄ￣
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１４ꎬ ３６ (３): ３５８~３６４
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１４１３１６５
∗
∗∗
基金项目: 国家自然科学项目支持项目 (３１０７０１８０ꎬ ３１２７０２５４)
通讯作者: Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｈｗ１１２９＠２６３􀆰 ｎｅｔ
收稿日期: ２０１３－０８－２４ꎬ ２０１３－１２－２１接受发表
作者简介: 刘　 博 (１９８９－) 女ꎬ 在读硕士ꎬ 主要从事苔藓植物分子生物学研究ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｉｕｂｏ６４２５＠１２６􀆰 ｃｏｍ
ｄｉｎｓꎬ ２００４)ꎬ 但同时也有许多酶进行着相反作
用ꎬ 它们将泛素从标记的底物上水解下来并回收
泛素ꎬ 行使着泛素化逆向调节的作用ꎬ 这些酶称
去泛素化酶 (ＤＵＢｓ) (黄浩ꎬ ２００９)ꎮ 目前已知
的去泛素化酶包括 ５个家族: ４ 个半胱氨酸蛋白
酶家族和一个金属蛋白酶家族ꎬ 分别是 ＵＳＰ 家
族、 ＵＣＨ家族、 ＯＵＴ / Ｃｅｚａｎｎｅ 家族、 Ａｔａｘｉｎ３ / Ｊｏ￣
ｓｅｐｈｉｎ 家族和 ＥＭＮ ＋ / ＪＡＭＭ 家族 ( Ａｍｅｒｉｋ 和
Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒꎬ ２００４)ꎮ ＵＣＨ 家族多为含巯基蛋白
酶ꎬ 由 ＵＣＨ￣Ｌ１ꎬ ＵＣＨ￣Ｌ２ꎬ ＵＣＨ￣Ｌ３ꎬ ＵＣＨ￣Ｌ４ꎬ
ＵＣＨ￣Ｌ５ ５个家族成员组成 (Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ 等ꎬ １９８９ꎻ
Ｍａｙｅｒ和 Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎꎬ １９８９ꎻ Ｏｓａｗａ 等ꎬ ２００１)ꎮ 它
们分子量大小不等ꎬ 能特异性识别泛素羧基末端
区域ꎬ 促进泛素再循环ꎬ 在许多生化过程中起到
重要的作用ꎬ 如 ＤＮＡ损伤修复 (Ｕｌｉｒｃｈꎬ ２００２)、
重要蛋白质翻译后修饰和改造 (Ａｚｚｏ 等ꎬ ２００５)、
细胞周期调控、 激酶信号通路 ( Ｇｌｉｃｋｍａｎ 和
Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒꎬ ２００２ ) 等ꎬ 主要参与泛素羧基末端
所连接的小肽或酯类分子的降解途径ꎬ 所以对泛
素系统的正常运行很重要 (Ｃｈｕｎｇ和 Ｂａｃｋꎬ １９９９)ꎮ
毛尖紫萼藓 (Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ) 为紫萼藓科
(Ｇｒｉｍｍｉａｃｅａｅ) 紫萼藓属 (Ｇｒｉｍｍｉａ) 植物ꎬ 可
以生存在其他陆生植物难以生存的极端环境中ꎬ
是典型的旱生藓类ꎬ 同时又是很好的抗逆基因资
源ꎮ 为了深入了解泛素在毛尖紫萼藓植株耐旱过
程中的功能ꎬ 利用同源克隆技术获得了 ＧｐＵＣＨ
基因的 ｃＤＮＡ全长序列ꎬ 采用生物信息学软件对
其进行分析ꎬ 并运用实时荧光定量 ＰＣＲ 技术对
该基因在植株干旱和复水条件下的表达情况进行
初步分析ꎬ 为全面研究毛尖紫萼藓的抗逆性提供
了依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
毛尖紫萼藓采自黑龙江省五大连池市ꎬ 选择野外生
长茁壮的植株置封口袋中带回实验室备用ꎬ 将植物进
行晾干处理后分别复水处理 １ ｈ、 ３ ｈ、 ６ ｈ、 １２ ｈ、 １ ｄ、
２ ｄ、 ３ ｄ、 ４ ｄ、 ５ ｄ、 ６ ｄꎬ 选择恢复正常生长 ６ ｄ 的材料
作为对照ꎬ 停止浇水后用硅胶快速脱水处理ꎬ 处理时间
分别为 １０ ｍｉｎ、 ２０ ｍｉｎ、 ３０ ｍｉｎ 和 １ ｈꎮ 取材后用液氮迅
速冷冻后放入－８０ ℃冰箱中保存备用ꎮ
１􀆰 ２　 试剂和酶
反转录酶、 ＯＬｉｇｏ (ｄＴ) １５、 琼脂糖购自 ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公
司ꎻ 胶回收试剂盒购自北京三博远志生物技术有限责任
公司ꎻ 克隆载体 ＰＭＤ１８￣Ｔ Ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ、 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ 购
自 ＴａＫａＲａ公司ꎻ 质粒小量抽提试剂盒、 Ｔａｑ酶购自上海
生工生物工程公司ꎻ 大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＤＨ５α 由本实验室
保存ꎻ 纯化酶、 限制性内切酶购于 ｐｒｏｍｅｇａ 公司ꎻ Ｓｓｏ
Ｆａｓｔ ＴＭ Ｅｖａｇｒｅｅｎ® Ｓｕｐｅｒｍｉｘ购于伯乐公司ꎻ 其他常规试
剂采用进口分装或国产分析纯ꎻ 引物合成由上海生工生
物工程公司完成ꎬ 测序由北京华大基因科技股份有限公
司完成ꎮ
１􀆰 ３　 方法
１􀆰 ３􀆰 １　 ＧｐＵＣＨ 基因的克隆 　 从毛尖紫萼藓 ｃＤＮＡ 文库
中筛选出一条与抗旱相关的泛素羧基末端水解酶基因
ＥＳＴ序列ꎬ 获得的 ＧｐＵＣＨ 基因长为 ６６６ ｂｐꎮ 经 ＮＣＢＩ
Ｂｌａｓｔ验证有完整的 ５′端ꎬ 无 ３′端ꎬ 因此设计 ３′￣ＲＡＣＥ
引物 ＧＳＰ 和 ＮＧＳＰ (表 １)ꎬ 分别与通用引物 ＵＭＰ 进行 ２
轮 ＰＣＲꎬ 扩增获得全长序列ꎬ 操作步骤按 ＳＭＡＲＴ￣ＥＲＴＭ
ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (Ｃｌｏｎｔｅｃｈ) 试剂盒说明书
进行ꎮ
采用改良的 ＳＤＳ法 (张梅娟等ꎬ ２００９) 提取毛尖紫
萼藓的总 ＲＮＡꎬ 用琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测其
质量ꎬ 利用高质量的 ＲＮＡ 进行下一步实验ꎮ 以 ＲＮＡ 为
模板ꎬ 按照 Ｐｒｏｍｅｇａ公司 Ｍ￣ＭＬＶ反转录酶说明书对 ２ μｇ
总 ＲＮＡ进行逆转录ꎬ 合成 ｃＤＮＡ第一链ꎮ 所得的特异性
片段经回收、 纯化后与 ＰＭＤ１８￣Ｔ Ｓｉｍｐｌｅ Ｖｅｃｔｏｒ连接ꎬ 转
化后随机挑选阳性克隆送至北京华大公司进行测序ꎮ 所
得序列与原序列进行拼接ꎬ 获得 ｃＤＮＡ 全长序列ꎮ 经
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０软件设计该基因的特异性引物 ＧｐＵ￣
ＣＨ￣Ａ 和 ＧｐＵＣＨ￣Ｂ (表 １)ꎬ 以毛尖紫萼藓 ｃＤＮＡ 为模版
进行 ＰＣＲ扩增ꎮ
表 １　 ＧｐＵＣＨ基因克隆及表达分析所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧｐＵＣＨ
引物名称 　 　 　 　 　 　 引物序列
ＧＳＰ ５′￣ＣＣＣＣＡＴＴＡＣＣＡＡＡＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧ￣３′
ＮＧＳＰ ５′￣ＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＣＧＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧ￣３′
ＧｐＵＣＨ￣Ａ ５′￣ＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣ￣３′
ＧｐＵＣＨ￣Ｂ ５′￣ＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＡＣＧＡＡＡＣＡＡＡＧ￣３′
ＧｐＵＣＨ￣Ｆ ５′￣ＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＣＡＡＡ￣３′
ＧｐＵＣＨ￣Ｒ ５′￣ＣＴＴＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＴＣＡＡＴ￣３′
１８ｓ￣Ｆ ５′￣ＴＴＧＡＣＧＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡ￣３′
１８ｓ￣Ｒ ５′￣ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＴＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＡ￣３′
１􀆰 ４　 ＧｐＵＣＨ基因生物信息学分析
在 ＮＣＢＩ中运用 Ｂｌａｓｔ Ｘ 程序进行同源性比较ꎻ ＯＲＦ
Ｆｉｎｄｅｒ程序寻找合适的开放阅读框ꎻ 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔ￣
ｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰 ｅｘｐａｓｙ􀆰 ｃｈ / ｔｏｏｌｓ / ｐｒｏｔｐａ ｒａｍ􀆰 ｈｔｍｌ) 预测此蛋白
的基本理化性质ꎻ 用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ􀆰 ｅｘｐａｓｙ􀆰 ｏｒｇ /
９５３３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘　 博等: 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ基因克隆及表达分析　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / ) 预测该蛋白亲疏水性ꎻ 用 Ｔｍｐｒｅｄ ( ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ􀆰 ｃｈ􀆰 ｅｍｂｎｅｔ􀆰 ｏｒｇ / ｓｏｆｔｗａｒｅ / ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ􀆰 ｈｔｍｌ) 预测该
蛋白跨膜区域ꎻ 用 ＳｉｇｎａｌＰ￣４􀆰 ０ (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰 ｃｂｓ􀆰 ｄｔｕ􀆰 ｄｋ /
ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＳｉｇｎａｌＰ / ) 对该蛋白的信号肽进行预测ꎻ 用 ＳＷＩＳＳ￣
ＭＯＤＥＬ (ｈｔｔｐ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ􀆰 ｅｘｐａｓｙ􀆰 ｏｒｇ / ) 预测蛋白质的
三维结构图ꎻ 用 ＭＥＧＡ５􀆰 ０软件进行系统进化树分析ꎮ
１􀆰 ５　 ＧｐＵＣＨ基因实时荧光定量 ＰＣＲ分析
分别提取毛尖紫萼藓在复水和干旱各个时期的总
ＲＮＡꎬ 并反转录合成 ｃＤＮＡ第一链ꎮ 根据 ＧｐＵＣＨ 基因的
ｃＤＮＡ全长和荧光定量引物设计的原则ꎬ 设计荧光定量
引物 ＧｐＵＣＨ￣Ｆ和 ＧｐＵＣＨ￣Ｒ (表 １)ꎬ 选择毛尖紫萼藓 １８Ｓ
ｒＲＮＡ基因为内参基因 (表 １)ꎬ 反应在 ＢＩＯ￣ＲＡＤ 公司
ＣＦＸ￣９６实时定量 ＰＣＲ仪上进行ꎮ 采用 ２￣ΔΔＣｔ方法计算出
毛尖紫萼藓在不同处理时间下的表达情况ꎬ 将 ＣＫ 的
表达量设为 １ 个单位ꎮ ２０ μＬ 反应体系中加入: ２ ×
Ｅｖａｇｒｅｅｎ® Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １０ μＬꎬ 去离子水 ５ μＬꎬ 上游引物和
下游引物各 ０􀆰 ５ μＬꎬ ｃＤＮＡ 模板 １ ｎｇꎬ 同时设置阴性对
照ꎬ ＧｐＵＣＨ基因、 １８ｓ ｒＲＮＡ基因、 阴性对照均设 ３次重
复ꎮ 反应程序: ９５ ℃预变性 １０ ｓꎬ ９５ ℃变性 ３０ ｓ ꎬ ５８
℃退火 ３０ ｓ ꎬ ７２ ℃延伸 ３０ ｓꎬ 共 ４０ 个循环ꎬ 在 ６５ ℃ ~
９５ ℃绘制熔解曲线ꎬ 并在 ７２ ℃时搜集荧光信号ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＧｐＵＣＨ基因克隆载体的构建
以 ＧｐＵＣＨ 基因的 ＥＳＴ 序列为基础进行 ３′￣
ＲＡＣＥ扩增ꎬ 获得一条大约 ６６６ ｂｐ的片段ꎬ 经验
证获得了完整的 ３′端ꎬ 结果如图 １ꎮ 将原序列与
该序列进行拼接ꎬ 获得 １ 条 ９５１ ｂｐ 的全长 ｃＤＮＡ
序列ꎬ 该序列的开放阅读框 ７１１ ｂｐꎬ ５′￣ＵＴＲ 为
１０９ ｂｐ 和 ３′￣ＵＴＲ 为 １３１ ｂｐꎮ 根据此序列的开放
阅读框设计特异性引物ꎬ 扩增得到大小约 ８７１ ｂｐ
的片段ꎬ 与预期结果一致 (图 ２)ꎮ 将目的片段
进行回收、 纯化后进行测序ꎬ 测序结果与拼接结
果相同ꎬ 说明拼接正确ꎮ
２􀆰 ２　 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ基因生物信息学分析
２􀆰 ２􀆰 １　 ＧｐＵＣＨ基因序列分析　 该基因序列全长
９５１ ｂｐꎬ 开放阅读框为 ７１１ ｂｐ共编码 ２３６ 个氨基
酸 (图 ３)ꎮ 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 软件预测毛尖紫萼藓
ＧｐＵＣＨ基因的相对分子质量为 ２５􀆰 ７ ｋＤꎬ 理论等
电点为 ４􀆰 ６７ꎬ 为酸性蛋白ꎮ 其中负电荷残基
(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ) 总数为 ３６ꎬ 正电荷残基 (Ａｒｇ＋Ｌｙｓ)
总数为 ２０ꎮ 不稳定系数为 ４７􀆰 ０９ꎬ 为不稳定性蛋
白 (< ４０ 为稳定性蛋白)ꎮ 脂肪系数为 ８９􀆰 ２４ꎬ
总平均亲水数为－０􀆰 １０９ꎮ 用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ软件对该基因
亲疏水性分析得知ꎬ 最低得分 (ＭＩＮ): －２􀆰 ３３３ꎬ
最高得分 (ＭＡＸ): ２􀆰 ９８９ꎬ 由于具有较高正值
的氨基酸有较高的疏水性ꎬ 说明该蛋白疏水性较
强ꎮ 用 Ｔｍｐｒｅｄ软件对该基因编码的氨基酸序列
跨膜区域预测ꎬ 得分大于 ５００分的才被认为是有
意义的跨膜螺旋ꎮ 该预测得到分值为 ２ ５８６ 分和
１ ４９４分的强跨膜区域ꎬ 分别有从外向内跨膜的
区域为 ４４ ~ ６０ ｂｐ、 １６７ ~ １８８ ｂｐ 和 ９７ ~ １１６ ｂｐꎬ
从内向外跨膜区域为 ９７ ~ １１５ ｂｐ 和 ４４ ~ ６１ ｂｐꎬ
表明该蛋白为跨膜蛋白ꎮ ＳｉｇｎａｌＰ￣４􀆰 ０ 软件预测
信号肽ꎬ 该蛋白不存在信号肽ꎬ 为非分泌型蛋
白ꎮ 用 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 预测 ＧｐＵＣＨ 蛋白的三维
结构ꎬ 该蛋白由大量的 α螺旋、 β折叠和无规则
卷曲组成ꎬ 其中 α 螺旋占 １８􀆰 ２％ꎬ β 折叠占
２２％ꎬ 无规则卷曲占 ５９􀆰 ７％ (图 ４)ꎮ
图 １　 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ　 　 　 　 图 ２　 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ
基因 ３′￣ＲＡＣＥ产物　 　 　 　 　 　 　 基因 ＣＤＳ产物琼脂
琼脂糖凝胶电泳　 　 　 　 　 　 　 　 　 糖凝胶电泳　
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　 　 Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ａｇａｒｏｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ｇｅｎｅ ３′￣　 　 　 　 　 ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ｇｅｎｅ
ＲＡＣＥ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ 　 　 　 　 　 　 　 　 ＣＤＳ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ　 　 　 　 　 　 　 　 Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ
２􀆰 ２􀆰 ２　 ＧｐＵＣＨ基因的序列比对及系统进化树分
析　 为了研究 ＧｐＵＣＨ 的进化关系ꎬ 利用 ＤＮＡ￣
ＭＡＮ６􀆰 ０软件进行多重序列比对 (图 ５)ꎮ 结果
发现ꎬ 该序列与小立碗藓 ( Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔ￣
ｅｎｓ)、 江南卷柏 ( Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ)、 大
豆 (Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ)、 黄瓜 (Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ)、 蓖
麻 (Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ)、 番茄 (Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉ￣
ｕｍ)、 拟南芥 (Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ) 等物种的一
致性较高ꎬ 均在 ５５％以上ꎮ 其中ꎬ 与小立碗
藓的一致性最高ꎬ 高达 ８１％ꎮ 利用 ＣｌｕｓｔａｌＸ２􀆰 ０
０６３　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
图 ３　 ＧｐＵＣＨ基因全长及其翻译的氨基酸序列ꎬ ＡＴＧ为起始密码子ꎬ ＴＧＡ为终止密码子
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＧｐＵＣＨꎬ ｔｈｅ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ ｉｓ ＡＴＧꎬ ｔｈｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｉｓ ＴＧＡ
图 ４　 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ蛋白三维结构
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ｉｎ Ｇｒｉｍｍｉａ ｐｉｌｉｆｅｒａ
和 ＭＥＧＡ５􀆰 ０ 软件 (Ｄｅｍｅｋｅｒ 等ꎬ ２００１) 构建系
统发育树 (图 ６)ꎮ 由进化树可知ꎬ 以上植物聚
成了两大支ꎬ 一支为被子植物ꎬ 另一支为蕨类植
物与苔藓植物ꎮ 其中ꎬ 毛尖紫萼藓与苔藓植物中
的小立碗藓处在同一个分支上ꎬ 亲缘关系最近ꎬ
与被子植物蓖麻亲缘关系最远ꎮ
２􀆰 ３　 ＧｐＵＣＨ基因荧光定量表达分析
以 ＧｐＵＣＨ￣Ｆ / ＧｐＵＣＨ￣Ｒ 为引物ꎬ 以不同复水
和干旱处理下的毛尖紫萼藓茎尖的 ｃＤＮＡ为模板
进行实时荧光定量 ＰＣＲ 扩增ꎬ 结果表明 ＧｐＵＣＨ
基因在不同的处理条件下都有所表达 (图 ７)ꎬ
复水 １ ｈ 时表达量较高ꎬ 是对照表达量的 １０􀆰 ６
倍ꎬ 随着复水时间的延长ꎬ 处理 ３ ｈ、 ６ ｈ、 １２ ｈ、
１６３３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘　 博等: 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ基因克隆及表达分析　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
２４ ｈ、 ２ ｄ、 ３ ｄ时表达量趋于稳定ꎬ 当复水 ４ ｄ时
表达量又显著上调随后又下降ꎮ 说明 ＧｐＵＣＨ 基
因在复水时诱导表达很快的适应了复水的环境ꎮ
干旱处理过程中快速脱水 １０ ｍｉｎꎬ ２０ ｍｉｎ 时表达
量不明显ꎬ 当脱水时间延长 ３０ ｍｉｎ 时表达量迅
速升高ꎬ 是对照表达量的 １２􀆰 ９ 倍ꎮ 说明随着干
旱程度的加深ꎬ ＧｐＵＣＨ 基因可能发挥作用ꎬ 通
过对异常蛋白的降解来减缓干旱对植物造成的
伤害ꎮ
３　 讨论与结论
由于泛素存在的普遍性ꎬ 有关泛素的生物学
功能研究越来越引起人们的重视ꎮ 机体内泛素化
过程由多种去泛素化酶介导催化ꎬ 参与信号转
导、 促进底物蛋白的降解和调节泛素化底物的稳
定性等 (Ｈｕａｎｇ 等ꎬ １９９５ꎻ Ｄ′Ａｎｄｒｅａ 和 Ｐｅｌｌｍａｎꎬ
１９９８ꎻ Ｃｈｕｎｇ 和 Ｂａｅｋꎬ １９９９)ꎮ ＵＣＨ 家族的研究
大多集中于神经性疾病或肿瘤等许多细胞生理和
病理过程ꎬ 在植物中进行克隆与功能分析的报道
图 ５　 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ与其它植物泛素羧基末端水解酶氨基酸序列比对
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ
２６３　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
图 ６　 ＧＰＵＣＨ基因编码蛋白的系统进化树
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＧＰＵＣＨ ｇｅｎｅｓ
图 ７　 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ基因复水 (Ａ) 和干旱 (Ｂ) 处理时基因表达
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧｐＵＣＨ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ (Ａ) ｈｙｄｒａｔｉｏｎ (Ｂ)
较少ꎮ 研究发现ꎬ 去泛素化酶种类繁多ꎬ 拟南芥
中至少存在 ６４ 种ꎬ 可以组成不同的亚家族ꎬ 其
中 ＵＣＨ１和 ＵＣＨ２与拟南芥芽的萌发有关 (Ｙａｎｇ
等ꎬ ２００７ꎻ 杜国华等ꎬ ２０１０)ꎮ 秘彩莉等 (２０１０)
对小麦 ＴａＵＣＨ１和 ＴａＵＣＨ２基因进行了克隆、 特
性分析和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交ꎬ 分析结果认为小麦中的
ＵＣＨ基因可能参与了植物胁迫反应中某些受损
伤蛋白或重要调控蛋白的降解ꎮ
本研究以毛尖紫萼藓为材料ꎬ 通过 ＲＡＣＥ技
术获得了一条泛素羧基末端水解酶基因ꎬ 命名为
ＧｐＵＣＨꎮ 对该基因进行了生物信息学分析ꎬ 开放
阅读框 ７１１ ｂｐꎬ 共编码 ２３６个氨基酸ꎬ 分子量为
２５􀆰 ７ ｋＤꎮ 跨膜结构分析表明 ＧｐＵＣＨ编码的蛋白
具有明显的跨膜区ꎬ 属于跨膜蛋白ꎮ 信号肽预测
结果表明该蛋白无信号肽ꎮ 通过进化树分析发现
毛尖紫萼藓与小立碗藓、 江南卷柏的亲缘关系较
近ꎬ 而与蓖麻、 杨树、 大豆等的亲缘关系相对较
远ꎮ 为了进一步了解 ＧｐＵＣＨ 基因在不用干旱胁
迫条件下的表达情况ꎬ 利用荧光定量 ＰＣＲ 方法
对该基因进行表达分析ꎮ Ｏｌｉｖｅｒ 等在耐旱藓类山
墙藓中研究发现ꎬ 复水最初 ２ ｈ 内ꎬ ８０％的蛋白
质合成速率没有明显变化ꎬ 但有些蛋白质的合成
受到明显的影响ꎬ 当复水 ２４ ｈ后所有蛋白质均达
到正常水平 (Ｏｌｉｖｅｒꎬ １９９１ꎻ Ｏｌｉｖｅｒ等ꎬ ２０００ꎻ宋晓宏
等ꎬ ２０１２)ꎮ Ｓｃｏｔｔ和Ｏｌｉｖｅｒ等的研究表明从山墙藓
中配子体中分离得到 １８种 ｃＤＮＡｓꎬ 在复水化时大
量表达ꎬ 并且蛋白质合成模式与无胁迫压力下的
合成模式存在很大程度的不同 (Ｓｃｏｔｔ 和 Ｏｌｉｖｅｒꎬ
１９９４ꎻ Ｏｌｉｖｅｒ 和 Ｂｅｗｌｅｙꎬ １９８４ꎻ 宋晓宏等ꎬ ２０１２)ꎮ
本研究中 ＧｐＵＣＨ基因在不同的处理条件下都有表
达且表达量较高ꎬ 说明毛尖紫萼藓与山墙藓有类
似的特点ꎬ 在干旱和复水条件下都能表达ꎮ
３６３３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘　 博等: 毛尖紫萼藓 ＧｐＵＣＨ基因克隆及表达分析　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
目前ꎬ 尽管已经发现 ＵＣＨ 家族与细胞的许
多生命过程相关ꎬ 但是许多机制还不太清楚ꎬ 而
在植物中的研究大多集中于拟南芥ꎬ 所以对 ＧｐＵ￣
ＣＨ进行克隆有重要的意义ꎮ 该研究结果可为后
续研究奠定基础ꎬ 并最终为毛尖紫萼藓抗旱分子
机理提供科学依据ꎮ
〔参　 考　 文　 献〕
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