全 文 ：盐胁迫下盐桦生理响应的变化分析
?
张海波 , 曾幼玲 ** , 兰海燕?? , 张富春
(新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室 , 新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要 : 对组织培养获得的盐桦 ( Belula halophila) 苗在盐胁迫下的生理指标和解剖结构进行了分析 , 结果
显示 , 随着盐浓度的增加 , 植物叶片相对含水量逐渐降低 ; 脯氨酸 ( Pro) 含量逐渐增加 ; 叶片丙二醛
(MDA) 含量和过氧化氢酶 ( CAT) 活性大小存在相关性 , 在 50～200 mmol?L 盐胁迫下 , 植物的 CAT活性是
递增的 , 200 mmol?L NaCl 处理时达到最高 , 同时叶片 MDA 含量在 50～200 mmol?L 盐处理时变化不明显 ;
CAT 活性在 300 mmol?L NaCl 处理时突然降低 , 此时叶片 MDA 含量大 ; 植物叶片和根的离子含量测定表明 ,
在盐胁迫下 K +?Na+ 比值逐渐降低 , 叶片中 K + 含量始终高于 Na+ 含量 ; 石蜡切片和扫描电镜发现盐桦茎、
叶中有晶体状物质存在 , 通过 X-ray分析表明这种晶体含有 C , O, Ca元素 , 相关的细胞成分化学实验进
一步确定其结晶体的成分。
关键词 : 盐桦 ; 脯氨酸 ; 丙二醛 ; 过氧化氢酶
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 03 - 260 - 05
Physiological Responses of Betula halophila (Betulaceae) to Salt Stress
ZHANG Hai-Bo, ZENG You-Ling
* *
, LAN Hai-Yan
* *
, ZHANG Fu-Chun
( Xinjiang KeyLaboratory of Biological Resources andGenetic Engineering, Collegeof Life
Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046 , China)
Abstract: The physiological responses and the relevant anatomical structure of Betula halophila under salt stresswere as-
sayed . Results showed that therelativewater and prolinecontentsof the leaf weregradually declined, while theMDA cont-
ent was correlated with theCAT activity in the leaf under salt stress . TheCAT activitywas ascended respondingto the sta-
bilityof MDA content at 50 - 200 mmol?L NaCl , but it was decreased at 300 mmol?L NaCl , which caused the elevation of
the MDA . The K
+?Na+ ratios in the leaf and rootwere declined under salt stress, while the K + contentwas always higher
than Na+ content in leaf .Crystalsof Betula halophila containingtheC , O andCa elementwere discovered in the stemand
leaf , but not in root, and will befurther confirmed by chemical experiment related to cell components .
Key words: Betula halophila; Proline; MDA ; CAT
植物耐盐性是一个十分复杂的数量性状 , 其
耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直
至分子的各个水平。不同植物由于其耐盐方式和
耐盐机理的不同 , 其组织或细胞的生理代谢和生
化变化也不同 , 所以对植物耐盐性的研究 , 应该
是综合多项指标。当植物受到盐胁迫时 , 细胞内
主动积累一些小分子有机化合物和蛋白类保护剂
来维持渗透平衡和体内水分 , 一般称之为渗透调
节剂 (Osmoprotectant) , 如脯氨酸 (Proline) 和甜
菜碱 (Betaine) , 它们可以作为渗调剂、酶的构型
保护剂 , 保护质膜的完整性 , 是无毒的细胞质调
渗物质 , 对代谢无抑制作用。植物的膜系统主要
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (3) : 260～264
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.08221
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : zengyouling@ xju. edu. cn; lanhaiyan@ xju. edu. cn; Tel : 0991 - 8583259
收稿日期 : 2008 - 12 - 10 , 2009 - 03 - 25 接受发表
作者简介 : 张海波 (1982 - ) 男 , 汉族 , 硕士 , 生物化学与分子生物学专业。 E-mail : zhbneble@ 163 . com ?
基金项目 : ?教育部春晖计划项目 (Z2004-2-65036); 自治区重点实验室开放课题 (XJDX 0201-2004-04) ; 新疆大学博士启动基金 ( BS05010)
是由膜脂和膜蛋白组成 , 当植物受到盐胁迫时 ,
体内会产生大量的氧自由基 , 即活性氧 , 从而引
起膜脂的氧化伤害。植物体内存在有抗氧化的过
氧化酶系统 , 当受盐胁迫时 , 过氧化酶系统活动
加强 , 以清除过多的活性氧 ( Bowler等 , 1991)。
盐桦 ( Betula halophila) 属桦木科桦木属小
灌木 , 已被列入 《全国重点保护野生植物资源调查
名录》, 属于国家Ⅱ级保护植物。生长于潮湿盐碱地
及盐沼泽附近 , 是西北地区盐碱地及湿地造林的优
良树种。调查发现 , 我国约有 500 余种盐生植物 ,
其中木本植物所占比例稀少 , 盐桦是其中十分耐盐
的树种 , 在改造和利用盐渍土方面 , 将是优良的候
选树种之一 (王健 , 2003)。关于盐桦耐盐的研究未
见报道 , 而且通过组织培养获得盐桦苗是否保持了
野生盐桦的耐盐特性也未研究过 , 本研究通过盐桦
在不同盐浓度下 , 通过耐盐生理指标的测量 , 结合
植物解剖学特征来揭示组织培养盐桦苗的耐盐阈
值及可能的耐盐机理 , 为更加科学合理地应用盐
桦来绿化新疆盐碱地奠定了理论基础。
1 材料与方法
1 .1 植物培养和 NaCl 处理
濒危植物盐桦来自本实验室的组培幼苗 , 组培材料
采自新疆阿勒泰盐沼泽地。通过组织培养获得盐桦苗 ,
移栽到蛭石∶珍珠岩 (3∶1) 的花盆中 , 花盆底部是稍大
的托盘用于盛水 , 用 1?2 Hongland营养液及自然光照下
培养。幼苗长至 20 cm左右时进行 0 , 50 , 100 , 200 , 300 ,
500 mmol?L NaCl 处理 , 盐浓度每 12 h递增 100 mmol?L , 直
至终浓度 , 两星期后收集植物叶片和根。
1 .2 植物叶片相对含水量的测定
叶片相对含水量 ( Wr) 测定 : 取 0 , 100 , 300 , 500
mmol?L NaCl 处理的植物叶片迅速放入已知重量的干燥培
养皿中 , 称重量得原始鲜重 (Wf) , 然后浸入蒸馏水中 6
～8 h, 取出 , 吸水纸吸干叶片表面水分 , 称重后再浸 1
小时 , 吸干水分 , 称重 , 直至样品饱和水重量近似 , 即
得饱和鲜重 (Wt) , 最后置于 105℃ , 杀青 15 min, 80℃
烘至恒重 , 称干重 (Wd) , 重复实验 3 次 , 数据平均得
各浓度盐处理叶片相对含水量。
相对含水量 ( Wr ) = ( 原始鲜重 Wf—干重 Wd) ?
(饱和鲜重 Wt—干重 Wd )×100%。
1 .3 cNa+ 、K+ 、Ca2+ , 脯氨酸 (Pro) 和丙二醛 (MDA)
含量的测定及过氧化氢酶活性 (CAT ) 测定
植物叶片中 Na+ 、K+ 、Ca2 + 含量的测定采用原子吸
收光谱法 ; 脯氨酸和丙二醛含量的测定分别采用酸性茚
三酮法和硫代巴比妥酸法 (郝再彬等 , 2004) ; 过氧化氢
酶活性的测定采用紫外吸收法 (邹琦 , 2000)。
1 .4 数据分析
实验均重复 3 次 , 所测数据平均得各浓度盐处理相
对含水量 , Na+ 、K + 、Ca2 + , Pro 和 MDA 含量。采用
SPSS 13 .0 统计分析软件对数据进行差异显著性检验 , P
< 0 .05 为差异显著 , P < 0 .01 为差异极显著。采用 Tukey
检验进行多重比较 , 确定处理项两两之间的差异显著水
平。采用 Excel 2000 软件制图。
1 .5 植物显微结构的观察
选取长势一致的盐桦苗 , 高度大约为 20 cm, 进行
200 mmol?L 的 NaCl 胁迫 , 蒸馏水作为对照 , 胁迫 10 d后
分别取胁迫和未胁迫的盐桦苗根、茎、叶 , 按常规步骤
制作石蜡切片。同 时取盐桦叶片和 茎 , 经 过 70%、
80%、100%的乙醇脱水后 , 液氮骤冷 , 刀片横切样品后
用扫描电镜 (SEM) 观察 , 检索到叶片及茎中的结晶状
物质后 , 通过 X-Ray能谱仪测定晶体成分。
2 结果与分析
2 .1 NaCl 胁迫对盐桦叶片含水量变化的影响
图 1 所示盐桦幼苗在盐胁迫下 , 随着盐浓度
的提高 , 植物失水越来越多 , 相对含水量逐渐降
低 , 没有盐处理时植物的相对含水量接近 80% ,
在 300 mmol?L 时降低至 50%。除 300 和 500 mmol?L
盐处理之间外 , 其它各浓度盐处理之间的相对含
水量差异显著。
2.2 NaCl 胁迫对盐桦叶片 Pro, CAT , MDA 的影响
如图 2 所示 , 植物在逆境条件下会积累较多
的 Pro, 盐桦在盐胁迫下 , 植物 Pro 的积累逐渐
增多 , 而且各浓度梯度之间 Pro 含量差异显著。
图 3 显示植物体内 CAT 含量的变化为先增高再
降低 , 200 mmol?L NaCl 胁迫时 CAT 活性最高 ,
300 mmol?L NaCl 胁迫时植物 CAT 酶活性突然降
低 , 50 mmol?L 和 300 mmol?L 之间 CAT 活性差异
不显著 , 其它各浓度盐处理之间的 CAT 活性差
异都显著 , 100 mmol?L 和 200 mmol?L 与其它各浓
度之间差异极显著 ; MDA 的值随着盐浓度的升
高而增高 , 在 0～200 mmol?L NaCl 胁迫时变化不
显著 , 300 mmol?L NaCl 胁迫时突然升高 ( 图 4 ) ,
并且与其它各浓度之间的差异显著。
2 .3 植物盐胁迫下 Na、K、Ca 离子含量的测量
植物根和叶中的 Ca2 + 含量较高 , 随着盐浓度
的增加 , Ca2 + 含量逐渐增高 , 叶中可达到 23 mg
1623 期 张海波等 : 盐胁迫下盐桦生理响应的变化分析
图 1 盐胁迫下盐桦叶片相对含水量的变化
Fig . 1 Changes of relative water content in the leaf of
B . halophila under salt stress
图 2 盐胁迫下叶片脯氨酸含量的变化
Fig . 2 Changes of Pro content in the leaf of
B. halophila under salt stress
图 3 盐胁迫下叶片 CAT 活性的变化
Fig . 3 Changes of CAT content in the leaf of
B . halophila under salt stress
图 4 盐胁迫下叶片 MDA 含量的变化
Fig . 4 Changes of MDA content in the leaf of
B. halophila under salt stress
以上 , 叶中除 300 和 500 mmol?L 之间 , 其它浓度
之间 Ca2 + 含 量 差 异 显 著 , 根部可达到 19 mg,
0 mmol?L 和盐处理之间差异显著 , 但是盐处理之
间差异不显著 ; K + 在叶中含量较高 , 100 mmol?L
NaCl 处理下达到峰值为 20 mg, 和其它处理的差
异显著 , 根中 K + 含量偏低 , 0 mmol?L 和盐处理之
间差异显著 , 但是盐处理之间差异不显著; Na+
含量在根中较稳定 , 它们之间差异不显著 , 叶中
Na
+ 含量在盐胁迫下逐渐升高 , 在 300 mmol?L 时
达到峰值为 8 .4 mg, 和其它处理比较差异显著。
从 K+?Na+ 的关系看 , 根和叶中 K+?Na+ 比值均是
随着盐胁迫逐渐降低 (如图 5～7)。
图 5 盐胁迫下叶片离子含量的变化
Fig . 5 Changes of ion content in the leaf of
B . halophila under salt stress
图 6 盐胁迫下根中离子含量的变化
Fig . 6 Changes of ion content in the root of
B. halophila under salt stress
262 云 南 植 物 研 究 31 卷
图 7 NaCl 胁迫下 , 植物根和叶中 K +?Na+ 比值的变化
Fig . 7 Changes of ion ration in the root and leaf of
B. halophila under salt stress
2 .4 盐桦显微结构的观察
通过石蜡切片观察发现无论在盐胁迫和非盐
胁迫下 , 植物的茎、叶里面都发现有结晶状物质
存在 , 存在于茎的韧皮部以及叶中靠近维管束周
围的组织 , 在根中没有发现结晶状物质 , 扫描电
镜进一步确认茎中晶体主要是存在于韧皮部薄壁
细胞 ( 图 8 ) , 而在木质部中没有发现。通过 X-
ray分析表明这种晶体含有 C、O、Ca元素 , 推
测很可能是草酸钙结晶 , 还需要进一步通过细胞
成分化学实验确定。
3623 期 张海波等 : 盐胁迫下盐桦生理响应的变化分析
3 讨论
盐桦是新疆阿勒泰地区特有盐生植物种类。
野外观察发现在盐桦生长的盐湖周边地面有白色
盐结晶 , 当地生境中仅此一种木本树种 , 其它种
类均为草本植物。在盐胁迫条件下 , 盐桦的生长
受到明显抑制 , 其主要原因是由于外界盐浓度影
响土壤渗透势 , 造成植物吸水困难 , 从而导致盐
桦生长缓慢 , 当盐桦幼苗叶片相对含水量小于
50%时 , 盐桦生长即受到很大伤害。从实验结果
可以看出 , 脯氨酸含量与盐胁迫程度成相关性 ,
随着盐胁迫程度加大 , 植物体内的脯氨酸含量也
逐渐增加 , 表明它可能在帮助植物抵御逆境以及
增强耐盐性方面起到重要作用。
植物的耐盐性主要依赖于膜系统的稳定性 ,
即高盐胁迫下仍能保持膜系统的完整并维持对离
子的选择吸收和其它功能。膜透性是膜受伤害程
度的直接反映 , 丙二醛 (MDA) 可间接表示膜受
损伤状况并兼有反馈作用。本实验中 , MDA 含
量与盐胁迫危害程度相关 , 盐桦苗在高盐 300
mmol?L 处理下膜透性大幅度上升 , 膜系统受到
严重的损伤。实验结果显示 , 在 50～200 mmol?L
NaCl 处理 时 , 植 物 CAT 活 性 是 递增 的 , 300
mmol?L 时植物 CAT 活性却显著降低 , 这时植物
MDA 含量突然增高 , MDA 本身对植物细胞有毒
害作用 , 能降低 CAT 的活性 , 加剧过氧化作用
(陈少裕 , 1991) 。因此 MDA 含量的多少可以作
为盐桦苗盐胁迫下受到伤害的一个指标。
K
+ 对盐生植物碱蓬的耐盐性有重要的作用 ,
盐胁迫下 , K + 可能参与了 V-H+ -ATPase 和 V-
H
+
-Ppase活性调节 ( Li 等 , 2002 )。但在植物受
到盐害时 , K+?Na+ 比值由于 Na+ 含量的增加而
降低 , 这主要是因为 K + 和 Na+ 具有相似的水合
离子半径 , 使得部分运输 K + 的载体亦有运输
Na+ 的功能 ( Blumwald, 2000) 。随着盐浓度的提
高 , 盐桦对 Na+ 的过量吸收 , 导致植株对 K + 的
吸收受到抑制 , 导致了植物体内 K +?Na+ 比值的
降低 , 打破了盐桦植株体内正常的离子平衡 , 使
得正常的生理生化代谢受到干扰 , 这可能是盐胁
迫对盐桦植株造成危害的又一重要原因。
草酸钙的形成是植物的一个基本生理过程 ,
它导致体内大量的钙元素成为不活跃的形式 ( Li
等 , 2003) , 草酸钙广泛分布在微生物、植物和
动物体内 (Mcnair, 1932 ) , 超过 215 科的植物中
发现含有草酸钙的物质 ( Franceschi and Horner,
1998) , 草酸钙功能假说有稳定离子平衡、植物
防御、组织支持物、解毒等功能 ( Arnott and Pa-
utard, 1970)。通过对蒺藜苜蓿 ( Medicago truncat-
ula) 功能突变体的研究发现 , 野生型和不产生
草酸钙结晶的突变体 ( cod 5 ) 在相同的温室环
境下生长并没有任何区别 , 草酸钙晶体的有无对
M. truncatula的正常生长是没有影响的 (Paul and
Michele, 2000 )。在盐桦中发现可能是草酸钙的
晶体 , 推测与野生盐桦的生境有关 , 在盐桦生长
的环境中 , Ca盐的含量远远超出了植物生长的
需要 , 因而植物进化出形成钙盐结晶的途径来降
低 Ca2 + 在植物体内的含量。
〔参 考 文 献〕
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