全 文 ：滇产与日产松茸的 IGS1-RFLP 比较分析
?
沙 涛1 , 钱 勇2 , 张汉波1 ,2 , 丁骅孙2 , 程立忠2 , 赵之伟1
(1 云南大学 , 生物资源保护与利用国家重点实验室培育基地 , 云南 昆明 650091;
2 云南大学 , 生物学系 , 云南 昆明 650091)
摘要 : 应用 Cfr13 I 限制性内切酶对采自于云南省 16 个市县的 127 个松茸子实体进行了 IGS1-RFLP 比较分
析 , 发现 126 个松茸子实体属于 A 类型 , 来自大理白族自治州剑川县的 1 例 (TF89) 为 C 类型。通过对 A
类型的 IGS1 序列分析发现产自云南的松茸有一个 CTTT 的简单重复 , 滇产松茸 IGS1 序列差异不明显。滇
产松茸的 IGS1-RFLP 与日产松茸的主要类型十分相似 , 两地松茸可能是同源的。
关键词 : 松茸 ; 云南 ; IGS1-RFLP 酶切类型 ; IGS1 序列
中图分类号 : Q 75 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 02 - 243 - 04
IGS1-RFLP Comparative Analysis of Tricholoma matsutake
(Tricholomataceae) from Yunnan and Japan
SHA Tao1 , QIANG Yong2 , ZHANG Han-Bo1 , 2 , DING Hua-Sun2 ,
CHENG Li-Zhong
2
, ZHAO Zhi-Wei
1
(1 Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources, Yunnan University, Kunming 650091 , China;
2 Department of Biology, Yunnan University, Kunming 650091 , China)
Abstract : IGS1 geneswere obtained by PCR amplification fromgenome DNA of Tricholoma matsutake fruit bodies collect-
ed from16 counties in Yunnan . These gene fragments were digested by restriction endonuclease Cfr13Ⅰ . Two distinct
IGS1 rDNA types were identified, namely A and C . Among the 127 fruit bodies investigated, 126 belongto type A while
onefromJianchuan (T89) belongsto typeC . Our results also showedthat thereareno significant heterogeneity in theIGS1
genes of thesefruit bodies, except double CTTTs found in representative IGS1 gene of type A . The primary IGS1 RFLP
patterns of Tricholoma matsutake fromYunnan are very similar to thosefromJapanese, implying that Tricholoma matsutake
of these two areas are likely to be homologous .
Key words: Tricholoma matsutake; Yunnan; IGS1-RFLP types; IGS1 sequence
松茸 [ Tricholoma matsutake (S . Ito et Imai )
Sing.] 是 和 植 物 共 生 的 真 菌 ( Masui , 1972;
Ogawa, 1975) , 属国家二级濒危保护物种 , 经济
价值较高 , 目前还不能实现人工栽培。云南省是
中国松茸的主产地 , 日本每年进口中国产松茸达
1 200 至 1 500 吨 , 其中云南省产松茸达 700 至
900 吨左右 , 占中国产松茸的 60%到 70% , 全国
范围全年松茸出口金额达 5 000 万美元 (周宏 ,
2003)。
18S～25S rDNA IGS ( Intergenic Spacer) 是指
位于 18S 基因和 25S 基因之间的间隔区 , 是 rD-
NA 中基因进化速度最快的区域 ; 其中 IGS1 区是
一个高变区 , IGS2 区较 IGS1 区保守些 , 它们常
用于属内种间比较或种内群体比较。相对而言 ,
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (2) : 243～246
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : “十五”国家科技攻关计划“生物资源与生物安全技术研究开发”项目 ( No . 2001BA707B01) ; 云南省应用基础研究
基金 ( 2005C0003M)
收稿日期 : 2006 - 06 - 13 , 2006 - 09 - 12 接受发表
作者简介 : 沙涛 ( 1965 - ) 男 , 高级实验师 , 主要从事食用菌及分子生物学的研究。 E-mail : shataocn@ yahoo. com. cn
ITS ( Internal Transcribed Spacers) 区域比 IGS1 区域
序列变化少。因此 , IGS1 常被选来做种内群体比
较 ( James 等 , 2001 )。限制性片段长度多态性
( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP )
是指用限制性内切酶消化不同个体的同源 DNA 分
子 , 经电泳分离后表现的限制性片段长度的差异。
这种差异主要来源于基因突变和 DNA 分子结构重
排所引起的限制性内切酶识别位点的改变 (宋敦
伦等 , 2002)。限制性片段长度多态性有利用对
较大样品量进行比较分析。日本食用菌学者应用
IGS1-RFLP 方法比较分析了日本和部分中国东北
的松茸情况 (Guerin-Laguette等 , 2002; Matsushi-
ta等 , 2005) , 本研究参照此方法来比较产自云
南省的松茸与日本的松茸的差异。
1 材料及方法
1 .1 材料
1 .1 .1 样品来源 (表 1)
1 .1 .2 IGS1 PCR 引物 5SA-Anderson: CAGAGTCCTATG-
GCCGTGGAT ; CNL12 : CTGAACGCCTCTAAGTCAG (Guerin-
Laguette等 , 2002) 由上海博亚生物技术有限公司合成。
1 .1 .3 RFLP (限制性内切酶 ) Cfr 13 Ⅰ (Asu Ⅰ ) 由
Fermentas公司提供 , 酶切位点为 :
5′ . . . G ↓G N C C . . . 3′
3′ . . . C C N G ↑G . . . 5′
1 .2 DNA 提取方法
子实体 总 DNA 的提 取为 CTAB 法 ( 曾东 方等 ,
2001)。
1 .3 PCR 及 RFLP 反应
rDNA 的 IGS1 区域 (IGS1 位于 rDNA 25S及 5S的部位
上) 通过 5SA?CNL12 这对引物得到扩增。50μL PCR 反应
体系包括 10×buffer 5μL , dNTP 2μL ( 25 mM) , 引物 2
μL , Taq酶 0.25μL (大连宝生物工程有限公司 ) , DNA 模
板 1μL , 无菌去离子水补足 50μL , Mineral oil 覆盖。扩增
程序 : 94℃ 5 min; 94℃ 40 s, 63℃ 1 min, 72℃ 3 min, 35
个循环 ; 72℃ 10 min。
1 .4 限制性内切酶反应
10μL 酶切反应体系 : 2μL PCR 产物 , 1μL 10×buff-
er, Cfr13Ⅰ酶 0.2μL , 6 . 8μL 无菌去离子水。反应时间 :
37℃ , 2 h。
限制性内切酶产物用 3%琼脂糖凝胶电泳检测 , 4 V?
cm 2～4 h, EB 染色观察。
1 .5 测序
ITS通用引物扩增的目的片段用 WATSON 胶回收试
剂盒回收 , 并纯化 DNA , 用 ABI DNA3700 分析仪测序。
获得的序列用 NCBI 的 BLAST 进行序列搜索 , 用 DNAStar
软件进行序列比较。从 GENBANK 获得日本松茸 IGS1-
RFLP A 类型的 IGS1 序列号 AF280439。
表 1 松茸样品来源
Table 1 Samples of Tricholoma matsutake
IGS1 Z酶
采集地 Locality 凭证标本 Voucher 切类型
IGS1 ?pattern
云南嵩明 Songming, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF4 , TF6 ( YUKU) A
云南禄劝 Luquan, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF91 , TF92 , TF93 , TF94 , TF95 , TF96 , TF97 , TF98 , TF99 ( YUKU) A
云南陆良 Luliang, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF176 , TF177 (YUKU) A
云南易门 Yimen, Yunnan 丁骅孙 ( H F. S ?.Ding) TF140 , TF143 , TF144 , TF145, TF146 , TF147 , TF173 , TF174 , TF175 (YUKU) A
云南龙陵 Longlin, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF121 , TF122 , TF123 , TF124, TF125 , TF126 , TF127 , TF128 , TF129 ( YUKU) A
云南丽江 Lijiang, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF15, TF28, TF51, TF52, TF53, TF54, TF55, TF56, TF57, TF58, TF59, TF60 (YUKU) A
云南临沧 Lincang, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF131 , TF134 , TF135 , TF136 , TF137 , TF138 , TF139 ( YUKU) A
云南兰坪 Lanping, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF110, TF112, TF113, TF114, TF116 , TF117, TF118, TF119, IF185, IF186 (YUKU) A
云南中甸 Zhongdian, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF41 , TF43 , TF44 , TF45 , TF46 , TF47 , TF48 , TF49 , TF50 ( YUKU) A
云南德钦 Deqin, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF100 , TF101 , TF102 , TF103 , TF104 , TF105 , TF106 , TF107 ( YUKU ) A
云南维西 Weixi , Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF29, TF31 , TF32, TF33, TF34, TF35 , TF36 , TF37 , TF38 , TF39 , TF40 ( YUKU) A
云南永平 Yongping, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF61 , TF62 , TF63 , TF64 , TF65 , TF66 , TF68 , TF69 , TF70 ( YUKU) A
云南剑川 Jianchuan, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF82 , TF83 , TF84 , TF86 , TF87 , TF88 , TF90 ( YUKU) A
云南剑川 Jianchuan, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF89 ( YUKU) C
云南南华 Nanhua, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF27 , TF72 , TF74 , TF75 , TF76 , TF77 , TF78 , TF79 , TF80 ( YUKU) A
云南禄丰 Lufeng, Yunnan 丁骅孙 ( H G. S ?.Ding) TF25, TF26, TF150, TF151, TF152, TF153, TF154, TF156, TF157, TF158, TF159 (YUKU) A
云南楚雄 Chuxiong, Yunnan 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF172 ( YUKU) A
云南 , 具体地点不详 丁骅孙 ( H E. S ?.Ding) TF11 ( YUKU) A
Without precise locality, Yunnan
注 : 表中 A、C 为 RFLP 酶切类型。Note: A and C represent RFLP pattern .
442 云 南 植 物 研 究 29 卷
图 1 产自云南的部分松茸 IGS1-RFLP 酶切图谱
Fig . 1 Electrophoreses patterns of representative IGS1-RFLP of T. matstake fromYunnan
2 结果
2 .1 IGS1-RFLP
对产自云南省 16 个市县的 127 个松茸子实
体样品进行了 IGS1-RFLP 分析 , 其结果如图 1、
表 1。样品 TF89 的 IGS1-RFLP 酶切图谱在 350-bp
左右处比其它样品多一条带 ( 图 1 , 2) , 其余 126
个样品 IGS1-RFLP 酶切图谱一致。根据日本学者
Guerin-Laguette (2002 ) 的松茸 IGS1-RFLP 酶切图
谱研究 , 可把产自云南省的松茸划分为 A 类型和
C 类型两种 (图 2)。其中 A 类型占 99 .22%。
图 2 产自云南省的部分松茸 IGS1-RFLP 酶切类型
Fig . 2 Electrophoreses patterns of representative
IGS1-RFLP of T. matstake from Yunnan
2 .2 IGS序列分析
经测序获得产自云南省的松茸 IGS1-RFLP 酶
切图谱 A 类型 ( TF46 ) 的 IGS1 序列共 459 bp,
应用 MegAlign软件对产自云南省的松茸与日本
的松茸 IGS1-RFLP 酶切图谱 A 类型的 IGS1 序列
(图 3) 进行比较 , 可以清楚的看出 , 在第 303～
304 bp中产自云南省的松茸在 IGS1 序列中有一
个 CTTT 的简单重复。
300 C T T T - - - - A T T AF280439
300 C T T T C T T T A T T T46
图 3 IGS1-RFLP 酶切图谱 A 类型的 IGS1 序列片段 ,
TF46 为产自云南省的松茸
Fig . 3 Partial IGS1 sequences of type an identified by
Cfr 13 Ⅰ digestion . TF46 sample is fromYunnan
3 讨论
近年来 , 限制性片断长度多态性 ( Restriction
fragment length polymorphism RFLP) 的研究大大地
促进了分子遗传多样性的研究。RFLP 的产生是
由于点突变、DNA 的重排、插入或缺失引起的
(Goodwin等 , 1992)。利用 RFLP 来进行分类鉴定
时的一个重要问题就是根据不同的分类水平
(属、种、株 ) 研究选择不同的 DNA 片断 (Kohn
等 , 1988; Goodwin 等 , 1992 )。笔者对产自云南
省的松茸的子实体及其培养物进行了 ITS 序列分
析 , 发现 ITS 序列一致 , 松茸种内个体间无差异
(沙涛等 , 2004) 。
日本食用菌学者应用 IGS1-RFLP 方法比较分
析了日本的松茸 ( Guerin-Laguette 等 , 2002 ) 得
到了 8 种 IGS1-RFLP 酶切类型 , 我们对云南省 16
市县的 127 个松茸子实体进行了 IGS1-RFLP 研
究 , 发现只有 2 种 IGS1-RFLP 酶切类型 , 说明产
自云南省的松茸酶切类型比较单一。酶切类型 A
占了绝对优势 ( 99 .22% ) , 也是日本是主要类
型。酶切类型 C 仅 1 例 (TF89) , 分布于大理白
5422 期 沙 涛等 : 滇产与日产松茸的 IGS1-RFLP 比较分析
族自治州剑川县。
在对 IGS1-RFLP 酶切 A 类型的 IGS1 序列分
析时 , 发现虽然产自云南省的和日本的 IGS1-
RFLP 酶切类型同是 A 型 , 但 IGS1 序列不完全相
同。说明限制性片断长度多态性在反映分子遗传
多样性方面还有它的局限性。
致谢 本文得到了中国科学院昆明动物研究所张亚平院
士的大力支持与指导 , 实验中还得到了云南大学生物学
系 2000 级生物学基地班李觅同学的协助。
〔参 考 文 献〕
周宏 4, 2003 , 云南省松茸来日“观光”华人进口商与厂家大搞安
全宣传 . 中文导报 , 9 月 1 日
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642 云 南 植 物 研 究 29 卷