全 文 ：用农杆菌 !诱导蒙古黄芪发根培养的研究!
李雅丽!，张 凯
（! 内蒙古科技大学生命科学学院，内蒙古 包头 #!$#!#； 内蒙古科技大学能源 与环境学院，内蒙古 包头 #!$#!#）
摘要：用蒙古黄芪（!#$%&%’( )*)+$%,%-*( %&’() *+,- ).,&.’/-(（%&’()）./0+1）无菌籽苗的
不同部位作为外植体，用发根农杆菌（!&$.+%-#*$/() $0/1.&*,*）2!3#!进行感染，该品系对不 同外植体诱导毛状根的能力是不同的。由下胚轴成功的诱导出毛状根。在附加 !##!41567乙 酰丁香酮（+8)91/:,0’(1’)）、#-; 4(67 <%=的条件下，诱导率达$->。用硅胶薄层层析法检
测到毛状根中含有冠瘿碱，用硅胶薄层扫描法（?7@A）测定了蒙古黄芪野生根、栽培根及毛
状根中的黄芪甲甙（+/9,+(+51/0B) #-3D$>（EF），#-#G!>（EF）和 #-D;D>（EF）。 关键词：蒙古黄芪；发根农杆菌；20质粒；毛状根 中图分类号：H I$D 文献标识码：= 文章编号：#D; J G##（##D）# J ##$J #G #$%&’( )* $+’ ,-./ !))$ )0 !#$%&%’( )*)+$%,%-*(
1-. -).,&.’/-( 2*&%3’& 4/ !&$.+%-#*$/()
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9’/ :).&(：!#$%&%’( )*)+$%,%-*( *+,-).,&.’/-(；!&$.+%-#*$/() $0/1.&*,*；20 R5+/40B；.+0,: ,119 发根农杆菌（!&$.+%-#*$/()$0/1.&*,*）对植物的侵染是自然界中天然的遗传转化模式。
云 南 植 物 研 究 ##D，;<（）：#$X !# 83$- =)$-*3- >%**-*3- ! 收稿日期：##$ J #3 J #$，##D J #! J$接受发表
作者简介：李雅丽（!IG3 J）女，硕士，讲师，主要从事植物生理与分子生物学研究。
它通过所含有的致根质粒（!）的一部分（#$%&’）在植物基因组中的整合和表达，导致 毛状根的产生。近 ()年来，随着对 !质粒分子生物学研究的不断深入，农杆菌质粒的应 用研究也成为世界范围内的热点研究，显示出极大的应用潜力和广泛的发展前景（周延清 等，*++,）。 黄芪是豆科多年生草本植物，其根为重要的中药材。目前我国可供药用的黄芪品种很 多，但主要以膜荚黄芪和蒙古黄芪为主。药理研究证明黄芪有多方面的药理作用。我国黄 芪野生资源的蕴藏量为 -., / *)0 12而每年的需求量为 , / *), 12。像其它一些珍惜濒危药 用植物一样，黄芪的野生资源逐年减少，用发根农杆菌 !质粒诱导蒙古黄芪建立发根培 养的无性繁殖体系，可以为资源的开发利用研究提供一条可行的新途径。 本实验通过用发根农杆菌 !*,)*侵染蒙古黄芪子叶、叶片、下胚轴、根段等外植体进 行了诱导，结果由下胚轴成功的诱导出了毛状根，除菌后进行离体培养建立了发根培养 系。鉴定发根农杆菌 !质粒的 #$%&’是否整合到宿主植物细胞基因组 %&’中并稳定表达
采用硅胶薄层层析法（刘树楠等，*++(；#34313，*+56）同时提取离体培养的毛状根中黄
芪甲甙（王关林和方宏筠，7))7），用薄层扫描法比较其与野生蒙古黄芪根，栽培黄芪根
中黄芪甲甙的含量。
! 材料与方法
!! 材料
*.*.* 供试植物材料
种子为 *++(年采的栽培蒙古黄芪（!#$%&%’( )*)+$%,%-*( 8942: ;3<. ).,&.’/-(（8942:）=>3?）种子，
由内蒙古农科院提供，野生蒙古黄芪根由内蒙古大学生物系吴庆茹教授提供。
*.*.7 供试菌种
发根农杆菌（!&$.+%-#*$/() $0/1.&*,*）!*,)*由北京大学生命科学学院林忠平教授赠送。 *.*.( 试剂与仪器 乙酰丁香酮（’@）、头孢噻肟钠（A:B）、卡那霉素均购自北京鼎国生物工程公司，植物组织培养试剂 均为国产分析纯试剂。薄层扫描仪器采用岛津 A@$+()双波长型扫描仪，@CD$*型自动喷雾器（日本），黄 芪甲甙标准品由内蒙古药品检验所提供。 !# 方法 *.7.* 无菌苗的获得 蒙古黄芪的种子在 0)E乙醇中浸泡 * F4，用无菌水冲洗 7次，然后用 ).*E升汞进行表面消毒 *) F4后，用无菌水浸洗 6次，每次 6 F4。接种在不含激素的 G@（蔗糖 (E、琼脂 ).5E、H= I 6.5）培养 基上进行无菌萌发，种子 , J 5 K后萌发长出无菌苗。 *.7.7 发根农杆菌菌株的活化与培养 发根农杆菌菌株的活化与培养同郑志仁等（*++0），另外用在感染前 - J , L内加入 *))!F?MNO乙酰丁 香酮（以下简称 ’@）培养的菌液作对照。测定菌液的 P%值。 *.7.( 外植体的转化及毛状根的诱导 切取蒙古黄芪无菌苗的子叶、叶片、茎段、下胚轴、根段分别预培养在去除硝酸铵附加 6)) F2NO水 解酪蛋白的固体 G@（)）上预培养 * J 6 K后，放入准备好的 !*,)*菌液中处理 () F4，取出，用灭菌滤纸吸 干外植体表面的菌液后放回原培养基上共培养两天。在加入 ’@的菌液中处理后的外植体仍放在含相同 浓度 ’@的预培养培养基上共培养两天（郑志仁等，*++0）。培养后的组织块取出后用无菌水浸洗 6次， 6)77期 李雅丽等：用农杆菌 !诱导蒙古黄芪发根培养的研究 每次 ! #$，然后转移到含有 !%% &’(头孢霉素（)*+）、!% &’(卡那霉素的 ,-（%）上，./0散射光下诱导
发根，同时用不被菌液感染的外植体作对照。待开始出现发根后，逐步降低抗菌素浓度，及时转移和扩
增在无激素 ,-培养基上，多次继代直至达到完全除菌后再去掉抗菌素继续培养。
12.23 毛状根离体培养体系的建立
将完全除菌后的毛状根从组织块上切下，转移至 ,-（%）液体培养基上，./0黑暗条件下 1.% 4’#$震荡
培养，1% 5后观察。在液体培养基中共培养一个月左右。
12.2! 发根农杆菌转化蒙古黄芪条件的优化
在整个转化培养期间，为了提高转化频率，得到更多的毛状根，分别从以下几个方面优化条件：16
在菌液中和培养基中添加乙酰丁香酮。.6 在用菌液预培养之前，将组织块接入含 !%% &’(水解酪蛋白
（去除硝酸铵）的 ,-无激素培养基上，分别预培养不同时间。76 在共培养基及除菌培养基上添加不同
浓度的 89:（%21 &’( ; %2! &’(）。
12.2/ 毛状根的鉴定
用 <=>!基因对卡那霉素产生抗性来鉴定毛状根中已整合入 ?1/%1所含质粒 =?#:3 @。把未转化的蒙
古黄芪外植体和转化后的毛状根同时放在含一系列浓度卡那霉素的 ,-培养基上，观察它们对卡那霉素
的敏感性。
用硅胶薄层层析法对蒙古黄芪发状根冠瘿碱进行鉴定（刘树楠等，1AAB），称取蒙古黄芪发根、蒙古
黄芪细胞、发根农杆菌各适量，充分研磨呈粉状，加入 B%C乙醇，浸泡过夜，次日离心取上清夜浓缩，
点样于硅胶薄层层析板（D-E型）上，展层剂为丙酮 F乙酸 F水（/ F . F .）。取 %21 G饱和 :&入丙酮稀释至 .% G出现白色沉淀，逐滴加入水，不断搅拌直至沉淀溶解后做显色剂；用乙醇稀释饱
和 干，观察。显色后出现斑点的为阳性反应。
12.2B 毛状根中黄芪甲甙（:KL4I&GJK#5* ）的测定
精密称取毛状根干燥粉 %2AB &，加入 .C氢氧化钾甲醇溶液，回流提取 7次，合并提取液并于 M%0恒
温水浴中加热 A% #$，进行减压蒸馏回收甲醇，残渣加水 7% G溶解并转移至分液漏斗中。氯仿 N正丁醇 （.F1）萃取 7次，合并提取液，用 1C磷酸二氢钾溶液 7% G洗涤，再于 /%0水浴上减压回收氯仿 N正丁 醇层，残渣加甲醇溶解定溶至 3 G。 采用硅胶薄层层析扫描法测定毛状根中黄芪甲甙的含量。薄层扫描时的条件：波长#K O 3%%$，#?
O B%% $，狭缝：12. P 12. ，扫描方式：反射锯齿扫描。线性参数：-Q O 7，R*GL O %21%。漂移线 O %2%7，最小峰面积 O 1%，扫描速度：%2. ’K。精密称取黄芪甲甙标准品，配成 1 &’G的甲醇溶液即为 标准对照品溶液。 计算黄芪甲甙含量的公式为： 16 :S标准 O标准品所测峰面积’标准品点样体积 .6 :S：1 O :S样品：Q（Q为样品中黄芪甲甙的浓度） 76 T O样品干重’定容体积 36 样品中黄芪甲甙的含量 O Q’T P 1%%C（RU） ! 实验结果 !# 蒙古黄芪发状根转化体系的建立 .2121 毛状根的诱导 经发根农杆菌 ?1/%1感染的蒙古黄芪外植体培养 7 ; 3 5左右，在下胚轴、根段上有毛 状根的产生，其它外植体无反应。根段虽然可诱导出毛状根，但诱导率很低，只有 !C ; /%. 云 南 植 物 研 究 .B卷 !，下胚轴经农杆菌诱导后，首先在外植体的形态学下端切口处出现毛状根，初生发状 根呈乳白色，多根毛，无向地性（图 #），有少数外植体两端形成致密平滑的绿色愈伤组 织，不产生毛状根。未经菌液感染的对照材料没有毛状根产生，有的外植体也有膨大现 象，但在无激素培养基上进一步培养过程中逐渐死亡。将诱导产生的毛状根切下后进行除 菌继代培养，表现出具有激素自主性生长能力，并且形成多分枝侧根（图$），侧根在生
长一段时间后，也形成很多分枝，将毛状根移到不含激素的液体 %&培养基中进行大量培
养。毛状根接入培养瓶后漂浮于培养液上，生长早期，毛状根形态变粗，颜色暗黄，有 $’ ( )的适应期，( )后长出大量白色毛状根并逐渐分支（图 (）。添加 *&可以使蒙古黄芪 下胚轴诱导发根率由 #+,!提高到$-,.（表 #）。
图 # 初生毛状根
/012 # 3405647 86047 499:
图 $次生毛状根 /012$ &;<9=)647 86047 499:
图 ( 液体培养基中大量生长的毛状根
/012 ( >8; 56?? <@A:@4; 9B 86047 499:? 0= A0C@0) 5;)0@5
$,#,$ 外植体预培养对毛状根诱导率的影响
将蒙古黄芪下胚轴放在去除 DEFDG(，
附加 +HH 51IJ水解酪蛋白的无激素 %&培养
基上进行不同时间的预培养。由于 DEFDG(
中含无机氮对黄芪毛状根生长具有抑制作
用，为促进生长而被加以去除，添加水解酪
蛋白提供氮源。然后再用 K#.H#菌液感染共
培养，发现发状根因预培养时间的不同而不
同，从图 F可见预培养 ( )的转化效果最好。
$,#,( 不同浓度外源 LM*对发根诱导的影响 外源植物激素的加入对毛状根的诱导生 长均会产生影响，把感染后的外植体分别共 培养在 %&（H）、%& N LM* H,# 51IJ、%& N LM* H,( 51IJ和 %& N LM* H,+ 51IJ的培养基上。其 结果如表$。在 %& N LM* H,( 51IJ上，毛状根的诱导率最高，达到 F$,$，这说明在适当
的植物激素作用下，蒙古黄芪组织块可以启动细胞分裂，而处于 OD*合成和细胞分裂高
峰期的外植体较易进行外源 OD*的导入与整合，从而促进根的诱导。
!H $$期 李雅丽等：用农杆菌 K0诱导蒙古黄芪发根培养的研究 表 ! 乙酰丁香酮（#）对诱导生根能力的影响 !#$% & ’((%)* +( )%*+,-./01+0%（&22!3+$45）+0 .++*/01 #/$/*/%, +( 6-7+)+*-$, %87$0*, 菌株 菌液处理 外植体数 生根外植体数 诱导率（9） :)*%./;3 :)*%./;3, 7+,$ =;3#%. +( %87$0*, =;3#%. +( .++*/01 %87$0*, 0<;)%3%0* (.%?;%0)- )+0*.+$ @ AB C2 2 2 D AB C2 2 2 E&F2& @ AB &G C &HIJ D AB HF &F KLIF 图 M 不同预培养时间对诱导频率的影响 N/1O M ’((%)* +( ((%.%0* 7.%);$*;.% */3% +0 (.%?;%0)- +( 6/.- .++* /0<;)%3%0*<br表 $ 不同浓度 %&对诱导生根能力的影响 !#$% K ’((%)* +( ((%.%0* )+0)%0*.*/+0 :A +0 .++*/01 #/$/*/%, +( 6-7+)+*-$, %87$0*, 培养基（均含 AB）P;$*;.% 3%;3（)+0*/0 AB） QB（2） QB（2）D :A 2I& QB（2）D >:A 2IC QB（2）D >:A 2IH 外植体数 =;3#%. +( %87$0*, HF HF MH HF 生根外植体数 =;3#%. +( .++*/01 %87$0*, &F &G &G K& 诱导率 >0<;)%3%0* (.%?;%0)-（9） KLIF CCIG MKIK CJIH 图 H 冠瘿碱的检测结果（A：菌液；:：野生根； P：毛状根） N/1O H R%*%*/+0 +( +7/0%（A：#)*%./;3,；<br:：S/$< .++*,；P：6/.- .++*,） $’$ 发状根的鉴定 发根农杆菌 E&F2& 具有质粒 T./AM# 的 U/0<片端 K&上整合有 =7!#基因，=7!# 是一种报告基因，是植物遗传转化中运用最 广泛的选择标记。它是从细菌的转座子 !0H 中分离得到的，所编码的新霉素磷酸转移酶 通过磷酸化使氨基糖苷类抗生素失活，因此 转化的毛状根应有抗卡那霉素的特性。将未 转化的蒙古黄芪外植体培养在含有一系列浓 度卡那霉素的 QB培养基上，结果在卡那霉 素达到 M22 3145时，外植体开始死亡，而毛 状根在这样的培养基上仍然能生长，初步证 明了毛状根已被转化。用硅胶薄层层析鉴定 冠瘿碱的方法进一步分析，当发根农杆菌 E/质粒的 !VR=A部分整合到宿主植物细胞 R=A 中后，在转化的细胞中就能合成特异的冠瘿碱，因此，冠瘿碱的有无可作为转化的指标之 L2K 云 南 植 物 研 究 KJ卷 一。如果蒙古黄芪毛状根为 !质粒所转化，那么它们细胞中就会有冠瘿碱的合成，硅胶 层析显色结果应为阳性，而黄芪细胞未经发根农杆菌的转化，其中不含冠瘿碱，在硅胶层 析板上不会有斑点出现。发根农杆菌本身虽有冠瘿碱合成酶基因，但该基因只在真核生物 中表达，其自身不能合成冠瘿碱。因此，在硅胶层析板上也无斑点出现（图 #）。从图中 我们可以看出实验结果和理论分析一致，因此可以认为，我们所获得的蒙古黄芪毛状根为 发根农杆菌 !质粒转化的毛状根。 !# 毛状根中黄芪甲甙含量测定 $%&%’ 样品测定结果 吸取从野生根、栽培根及毛状根提取出的黄芪甲甙待测样品各 (%)!*分别点于同一硅 胶 +薄层板上，同时用标准品作对照。展开，显色，扫描测定峰面积，结果见图 ,。 图 , 野生根、栽培根与毛状根中黄芪甲甙含量的比较（标准品做对照） -./ , 012345617 18 41954.4*16:; <= >179;796 7 ?*: 51196，>@*9@5;: 51196 47: A45B 51196（>17951* ?9A 6947:45: 6423*;） 实验结果表明，毛状根中黄芪甲甙的含量（)%$#&#C）与野生根中黄芪甲甙的含量 （)%$,#(C）基本相似，二者均高于栽培根中黄芪甲甙的含量（)%$)D’C）。 $%&%$ 稳定性测定 标准品溶液 (%)!*点于薄板上，展开，显色，每隔半小时扫描两次，取一小时内测定 结果（7 E F），计算变异系数 0=C E )%’(，可以认为一小时内测定结果稳定。 # 讨论 #$ 以蒙古黄芪为材料，利用发根农杆菌 !’,)’菌株感染蒙古黄芪的各种外植体，结果 由下胚轴成功诱导出毛状根，且诱导率也相对较高。并从毛状根培养物中分离出主要药用 成分黄芪甲甙。这就可能为解决蒙古黄芪野生资源缺乏问题提供了一条有效的途径。 G)$$ 期 李雅丽等：用农杆菌 !诱导蒙古黄芪发根培养的研究
!# 该实验中，蒙古黄芪各种外植体对农杆菌的感染存在显著差异。其中下胚轴切断最
为敏感。而利用乙酰丁香酮活化菌液、选择合适的菌液 !值和共培养时间、外植体预培
养一定时间等转化条件的优化，使下胚轴切断的发状根形成能力显著提高。这主要因为乙
酰丁香酮等植物信号分子促使 #$%区基因活化和高效表达是农杆菌 &’()向宿主细胞核转 移所必须的，并能提高农杆菌向宿主的转化率和敏感性（*+,$+，-../）。
!! 在发状根的诱导过程中，适当浓度外源激素的添加对于提高发状根的诱导频率有明
显的促进作用。本研究所使用的菌株为农杆碱型的 0$质粒，具有完整的 &1和 &0区段， &1’()是发状根分化和控制发状根形态的主要决定者，它能够给转化的细胞提供一种对 生长素的反应能力。本研究结果表明，一定浓度的外加生长素对于发状根的产生有正效 应。即 &1区的 %23基因可能对外加生长素也引起反应，并且与 0$质粒上的 +45基因作用
累加，从而提高发状根的诱导频率。
!$毛状根中黄芪甲甙含量的测定结果显示，由发根农杆菌 0-67-诱导蒙古黄芪下胚轴 产生的毛状根经大量培养后提取其中药用成分黄芪甲甙，其含量与野生根中黄芪甲甙的含 量基本相似，均略高于栽培根中的含量，这就表明利用发根培养技术诱导药用植物发根生 产有用的次生代谢产物有重要的理论价值与实践意义。 〔参 考 文 献〕 王关林，方宏筠主编，-..8 9 植物基因工程原理与技术［:］9 北京：科学出版社，;<- 1$4 =(（刘树楠），=4> &?（孙天恩），1$@A（李根保），-..89 &%+>BC2%D+,$2> 2C @$>EF2 G+$%H %22, +>I JB,+3K$BGDJ>,2C$,B B4BLJ>’
B$2> M4K,4%J［N］9 ! #$%& ’&()（(+,4%+K =M$J>MJ ?I$,$2>）（武汉大学学报 O自然科学版），$$（;）：-—-<6<br*+,$+ P，1$LLQ，NJ%J>MJ )A，-../ 9 ?>G+>MJI ,%+>BC2%D+,$2> 2C ,2D+,2 M2’M4K,$R+,JI S$,G *+,-%./0+(#1 /#+&02%.(0&3 T<8T-0$C：：U@=’ V0--6-$> ,GJ L%JBJ>MJ 2C +MJ,2BH%>F+>J［N］9 45%&/ 6055 708，%#：W;;—W;<
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9:+,-%./0+(#1 +$(;,:0&03 DJI$+,JI FJ>J ,%+>BCJ% BHB,JD［N］9 >0+0?(/%3（遗传），%&（W）：W<
7-; 云 南 植 物 研 究 ;Z卷