全 文 ：普洱熟茶后发酵优势菌臭曲霉的生物学特性
朱宏涛1 , 2 , 陈可可1 , 王 东1 , 杨崇仁1 , 李 元2 , 张颖君1
?
(1 中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室 , 云南 昆明 650204;
2 云南农业大学资源与环境学院 , 云南 昆明 650201 )
摘要 : 为了开发普洱熟茶生产的规范技术 , 本文对普洱茶后发酵优势菌之一的臭曲霉的生物学特性进行了
研究。结果表明 , 该菌株对酸碱度有广幅的适应性 ; 在以硫酸铵或豆饼粉为氮源 , 玉米粉或果糖为碳源的
培养基中生长迅速 ; 培养温度以 30℃最为适宜。同时 , 对菌落的生长规律及形态特征进行了观察与分析。
研究结果为该菌株的大量培养 , 以及普洱茶的规范化生产技术提供了基础。
关键词 : 臭曲霉 ; 生长温度 ; 碳源 ; 氮源 ; 培养基
中图分类号 : Q 934 , Q 935 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 04 - 510 - 05
The Biological Characteristics of Aspergillus foetidus
( Moniliaceae) , a Preponderant Microbe during the
Post Fermentative Process of Pu-Er Tea
ZHU Hong-Tao1 , 2 , CHEN Ke-Ke1 , WANG Dong1 , YANG Chong-Ren1 ,
LI Yuan
2
, ZHANG Ying-Jun
1 *
( 1 State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China , Kunming Instituteof Botany,
Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204 , China; 2 College of Resources and Environment,
Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 , China)
Abstract: To exploit a standardized fermentative technique for producing Pu-Er tea, the biological characteristics of As-
pergillus foetidus, one of the dominant strains obtained from the post-fermentative process of Pu-Er tea, was investigated .
The result indicated that this fungus adapted well to a wide pH rangeand its optimal temperaturefor cultivation was about
30℃ . It grew well in mediumwith either ammonium sulfate or soybean powder as the nitrogen source and D-fructose or
corn powder as thecarbon source . Moreover, themorphologic characters and thegrowth curveof A. foetiduswere studied .
This study will provide scientific guidefor not only themassive cultureof thismicrobe, but also the standardized producing
process of Pu-Er tea .
Key words: Aspergillus foetidus; Growth temperature; Carbon source; Nitrogen source; Culturemedium
普洱熟茶是以云南特产大叶茶的晒青毛茶为
原料经后发酵再加工生产的茶类 , 以特有的风味
和历史文化内涵引起注视 , 逐渐成为脍炙人口的
新兴茶饮品 , 有着巨大的发展潜力。普洱熟茶的
生产以渥堆的方式 , 依靠环境微生物的自然感
染 , 在多种微生物的参与下进行。微生物在普洱
熟茶的生产及品质和特殊内含物的形成中起着十
分重要的 作用 ( 折改梅等 , 2005; 周志宏等 ,
2005)。陈宗道等 ( 1988 ) 曾报道从普洱茶中分
离到黑曲霉 , 并认为黑曲霉约占微生物总数的
80%左右 , 周红杰等 ( 2004) 亦认为黑曲霉是普
洱茶渥堆中始终存在的主要菌种。我们曾对云南
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (4) : 510～514
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2008.07241
? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : zhangyj@ mail .kib. ac. cn; Tel : + 86 - 871 - 5223235
收稿日期 : 2007 - 10 - 16 , 2007 - 11 - 29 接受发表
作者简介 : 朱宏涛 (1977 - ) 女 , 在读硕士研究生 , 主要从事微生物培养、生物转化及植物生物技术等研究工作。
省各个普洱熟茶生产地区渥堆过程中的微生物菌
群进行系统的分离和鉴定 , 发现共性的优势菌群
(陈可可等 , 2006)。经菌物学鉴定 , 主要的优势
菌种为曲霉属的真菌 , 但未发现黑曲霉。其中 ,
臭曲霉 ( Aspergillus foetidusThomet Raper) 为主要
的优势菌群之一。我们还发现用含有臭曲霉的
“普洱茶麴”发酵生产的普洱熟茶汤色红润 , 茶
香浓郁 , 滋味独特 , 并能缩短后发酵生产过程 ,
使产品具有稳定的风味与质量。显然 , 优势菌直
接影响普洱茶的生产过程以及产品的品质。为了
揭示微生物在普洱茶后发酵过程中的作用与机
制 , 我们开展了优势菌群的生物学特性及其对茶
多酚等茶叶化合物的转化作用研究 , 以及优势菌
群的次生代谢产物的化学研究。同时 , 从后发酵
生产技术规范和普洱熟茶新品牌构建的角度 , 开
展了“普洱茶麴”在普洱熟茶生产中的应用研究
与开发。本文报道了臭曲霉的生物学特性。
1 材料与方法
1 .1 试验材料
1 .1 .1 试验样品 该实验所用的臭曲霉 ( Aspergillus foe-
tidus Thomet Raper) KZ-5 从云南省产茶区普洱熟茶渥堆过
程中的茶堆中采样分离得到。
1 .1 .2 氮源实验培养基配方 以改良 PDA 培养基为基本
培养基。分别加入蛋白胨 3 g (N1) , 牛肉膏 5 g (N2) , 酵
母浸膏 5 g (N3) , 硝酸钠 2 .2 g (N4) , 硫酸铵 1.7 g (N5) ,
麸皮 11 g (N6) , 豆饼粉 7 g (N7) 等含有机氮或无机氮的
物质。
1 .1 .3 碳源培养基配方 以改良 PDA 培养基为基本培
养基。分别加入蔗糖 8 .6 g ( C1) , 麦芽糖 9 g (C2) , 玉米
粉 7 .2 g ( C3) , d-果糖 9 g (C4) , α-乳糖 8 g ( C5) 等含有
机碳或无机碳的物质。
1 .1 .4 培养温度的设置 将菌种接种在准备好的 PDA
固体培 养基中 , 分别 置于 20℃ , 30℃ , 40℃ , 50℃ ,
60℃的条件下进行培养 , 观察菌丝体的生长状况。
1 .1 .5 酸碱度的设置 将菌种分别接种在 pH = 1 , 2 ,
⋯ , 11 , 13 等的 13 种 PDA 固体培养基中 , 置于 30℃的条
件下进行黑暗培养并观察菌丝体的生长状况。
1 .2 实验方法
在超净工作台内 , 用接种针均匀挑取经转代活化 2 次
的臭曲霉孢子 , 接种于事先准备好的固体培养基中。除温
度因素实验外 , 平板皆于 30℃条件下黑暗培养。接种后分
别以第 2 , 4 和 6 天测量菌落直径和菌落中孢子圈直径 , 并
观察描述菌落形态 , 每项实验设 3 个重复 , 取平均值。
2 观察与结果
2 .1 pH 值对臭曲霉生长与形态的影响
实验结果表明 , 培养基酸碱度对臭曲霉菌株
生长无显著的影响。在 pH = 1 , 2 , ⋯ , 13 的范围
内均能正常生长菌丝和产生孢子。在不同 pH 值
的培养条件下 , 孢子产生的初始时间相似。而孢
子的产生速度则随 pH 值增大逐渐降低 , 在 pH =
4～7 的范围内生长较快。pH = 6 时生长最快。
当 pH 值升至 13 时整个菌落的生长完全受到抑制
(图 1) 。在 pH = 3～8 的范围内 , 培养基中的菌
丝体呈白色 , 疏松 , 生长迅速 , 孢子密集产生于
菌落中部 , 与菌落成同心圆分布。待菌丝布满整
个培养皿后 , 菌丝的顶部亦出现稀疏的孢子 ( 图
5: A) 。pH > 8 则菌丝生长缓慢 , 排列紧密 , 前
期孢子形成的速度慢 , 后期产生孢子的速度远远
大于菌丝的生长速度 , 培养皿表面几乎看不到菌
丝 , 只有稀疏的孢子覆盖于其上 ( 图 5: B)。
图 1 pH 值对臭曲霉生长的影响
a: 第 1 次检测孢子圈 ; b: 第 2 次检测孢子圈 ;
c: 第 3 次检测孢子圈 ; d: 第 1 次检测菌落 ;
e: 第 2 次检测菌落 ; f: 第 3 次检测菌落
Fig . 1 The effect of A . foetidus growth by pH
a: first check of the spore circle; b: second check of the spore cir-
cle; c: third check of the spore circle; d: first check of the colony;
e: second check of the colony; f: third check of the colony
2 .2 氮源对臭曲霉生长与形态的影响
氮源试验结果表明 , 臭曲霉菌株在以硫酸铵
(N5) 或豆饼粉 (N7) 为氮源的培养基中生长迅
速 , 在以蛋白胨 (N1 ) , 牛肉糕 (N2 ) , 酵母浸
膏 (N3) , 硝酸钠 (N4) 和麸皮 (N6 ) 为氮源的
1154 期 朱宏涛等 : 普洱熟茶后发酵优势菌臭曲霉的生物学特性研究
培养基中生长相对缓慢 ( 图 2 )。同时 , 氮源对
菌落在培养基表面的形态有明显的影响。N1 培
养基中臭曲霉孢子呈黑褐色 , 菌丝乳白色 ( 图
5: C) , 孢子与菌丝排列整齐 , 菌落周围菌丝体
图 2 氮源对臭曲霉生长的影响
a: 第 1 次检测孢子圈 ; b: 第 1 次检测菌落 ;
c: 第 2 次检测孢子圈 ; d: 第 2 次检测菌落
Fig . 2 The effect of A. foetidus growth by nitrogen source
a: first check of the spore circle; b: first check of the colony;
c: second check of the spore circle; d: second check of the colony
疏松。菌落背面乳白色 , 有少量排列整齐的褶
皱 , 在孢子圈与菌丝圈交界处出现金黄色圈 ( 图
5: D) 。N2 培养基中孢子呈黑褐色 , 菌丝体乳白
色 , 菌丝与孢子排列整齐 , 菌落周围的菌丝体致
密且紧贴培养基表面 (图 5: E) , 孢子形成的速
度几乎接近于菌丝体生长的速度。菌落背面乳白
色 , 具整齐细密的辐射沟纹。在 N3 培养基中 ,
孢子呈黑褐色 , 菌丝白色 , 孢子圈排列整齐 , 菌
丝排列疏松且不整齐。菌落背面乳白色 , 具细密
的沟纹。N4 培养基使孢子呈黑褐色 , 菌丝白色 ,
孢子及菌丝排列整齐 , 孢子形成的速度远慢于菌
丝生长速度 , 菌落背面乳白色 , 具细密的沟纹。
N5 培养基中孢子呈黑褐色 , 菌丝白色 , 孢子排
列整齐 , 菌落周围为排列不整齐的棉絮状的菌丝
体 (图 5: F ) , 菌落背面乳白色 , 具细密的沟
纹。N6 培养基的孢子呈黑色 , 菌丝白色 , 菌丝
与孢子排列整齐 , 菌丝排列疏松。菌落背面乳白
色 , 无沟纹。在 N7 培养基中 , 孢子形成速度
快 , 从菌落中可见黑色孢子层 , 孢子排列整齐 ,
无分泌物 ( 图 5: G) , 菌落背面白色、平整、光
滑无沟纹 ( 图 5: H)。
图 3 碳源对臭曲霉生长的影响
a: 第 1 次检测孢子圈 ; b: 第 1 次检测菌落 ;
c: 第 2 次检测孢子圈 ; d: 第 2 次检测菌落 ;
e: 第 3 次检测孢子圈 ; f: 第 3 次检测菌落
Fig . 3 The effect of A . foetidus growth by carbon source
a: first check of the spore circle; b: first check of the colony;
c: second check of the spore circle; d: second check of the colony;
e: third check of the spore circle; f: third check of the colony
图 4 温度对臭曲霉生长的影响
a: 第 1 次检测孢子圈 ; b: 第 1 次检测菌落 ;
c: 第 2 次检测孢子圈 ; d: 第 2 次检测菌落 ;
e: 第 3 次检测孢子圈 ; f: 第 3 次检测菌落
Fig . 4 The effect of A . foetidus growth by temperature
a: first check of the spore circle; b: first check of the colony;
c: second check of the spore circle; d: second check of the colony;
e: third check of the spore circle; f: third check of the colony
215 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 5 pH 值、氮源、碳源实验部分照片
A : pH = 3～8 的实验菌落 ; B : pH = 8～11 的实验菌落 ; C: N1 实验菌落 ; D: N1 实验菌落背面 ; E : N2 实验菌落 ;
F : N5 实验菌落 ; G: N7 实验菌落 ; H: N7 实验菌落背面 ; I : C1 实验菌落 ; J : C4 实验菌落 ; K : C4 实验菌落背面 ;
L : C5 实验菌落背面 ;
Fig . 5 Some photos during the experiments of pH value, nitrogen source and carbon source
A : Colony of the pH = 3 - 8 experiment; B : Colony of the pH = 8 - 11 experiment; C: Colony of the N1 experiment; D: Colony the
back of theN1 experiment; E : Colony of the N2 experiment; F : Colony of theN5 experiment; G: Colony of the N7 experiment; H:
Colony theback of theN7 experiment; I : Colony of the C1 experiment; J : Colony of the C4 experiment; K : Colony theback of the C4
experiment; L : Colony the back of the C5 experiment
2 .3 碳源对臭曲霉生长与形态的影响
碳源实验结果表明 , 玉米粉 ( C3 ) 和果糖
( C4) 培养基对臭曲霉菌株的生产最为有利 ( 图
3)。同时 , 不同的碳源培养基对菌株的形态也有
一定的影响。在蔗糖 ( C1 ) 培养基中孢子呈黑
色 , 菌丝呈白色 , 孢子形成速度中等 , 孢子圈排
列整齐 , 菌丝呈丝绒状、疏松 , 排列整齐 ; 菌落
中央的孢子圈少有下陷 , 正面具均匀、规则、细
密的辐射状沟纹 , 背面浅黄色 , 也具均匀、规
则、细 密 的 辐 射状 沟 纹 ( 图 5: I )。麦 芽 糖
(C2) 培养基中菌落的形态特征与在 C1 中相似。
在玉米粉 ( C3 ) 培养基中 , 孢子呈黑色 , 菌丝
3154 期 朱宏涛等 : 普洱熟茶后发酵优势菌臭曲霉的生物学特性研究
为白色 , 孢子形成的速度较慢 , 孢子圈排列整
齐 , 菌丝呈丝绒状 , 疏松 , 排列整齐 ; 菌落具沟
纹 , 背面浅黄色 , 具少量沟纹。在 d-果糖 ( C4)
培养基中 , 菌株的孢子呈黑褐色 , 菌丝为乳白
色 , 孢子形成速度快 , 孢子圈排列整齐 , 菌丝紧
密、排列整齐 (图 5: J ) ; 菌落正面具均匀、规
则、细密且较深的辐射状沟纹 (图 5: K ) , 背面
浅黄色 , 也具细密的辐 射状沟纹。在 α-乳糖
(C5) 培养基中 , 菌株的孢子呈黑色 , 菌丝为白
色 , 孢子形成速度较慢 , 孢子圈排列整齐 , 菌丝
呈丝绒状 , 疏松 , 排列整齐 ; 菌落无辐射状沟
纹 , 背面浅黄色也无辐射状沟纹 ( 图 5: L )。
2 .4 温度对臭曲霉生长的影响
温度实验结果表明 , 在培养温度为 30℃时
菌株生长最好 , 孢子形成速度和菌丝生长速度均
最快。培养温度降低到 20℃时生长最慢 , 升温
至 60℃时菌株死亡。
3 讨论
臭曲霉属半知菌亚门 ( Deuteromycotina) 丝
孢纲 ( Hyphomycetes) 丝 孢目 ( Hyphomycetales)
丛梗孢科 (Moniliaceae) 曲霉属 ( Aspergillus) 真
菌 , 在自然界不多见 , 无毒 , 富含单宁酶等生物
酶 , 具有降解水解单宁 , 产生没食子酸 , 形成深
红色的作用 (Van Diepeningen等 , 2004 )。我们首
次从普洱茶生产过程中分离到的臭曲霉菌株为普
洱茶的优势菌物之一。生物学特性实验结果表
明 , 该菌株在 pH = 2～13 范围内均能正常生长 ,
孢子形成的初始时间相同 , 对酸碱度的适应性较
强 , 符合曲霉属真菌通常对 pH 值的广辐适应特
性 (黄福新等 , 2005 )。该菌株在中性偏酸的培
养条件下生长迅速。菌丝体呈白色 , 产生黑褐色
至黑色孢子 , 孢子圈排列整齐 , 菌丝疏松且排列
整齐 , 偶有排列紧密 , 菌落背面白色或乳白色 ,
一般均有辐射状排列细密的沟纹。在不同碳源培
养基中菌落形态还呈现一定的差异。上述观察结
果与中国真菌志中描述的臭曲霉菌丝体黄色或白
色至黄色 , 菌落背面黄褐至红褐色的菌落形态特
征有所差异 ( 齐祖同 , 1997 )。这可能与菌株来
源与培养基不同有关 ( 靖德兵等 , 2004 )。实验
结果表明 , 该臭曲霉菌株在玉米粉或果糖培养基
中 , 以硫酸铵或豆饼粉为氮源 , pH 值在 6～7 的
范围内 , 培养温度为 30℃时 , 生长最为旺盛。
鉴于该菌株为普洱茶后发酵生产中的主要优
势菌物之一 , 以上的研究结果将为菌株的大量制
备 , “普洱茶麴”的研制提供关键的技术基础。
在普洱茶的规范生产 , 质量稳定和风味品牌的形
成中具有重要的意义。
致谢 云南农业大学刘云龙教授鉴定菌种。
〔参 考 文 献〕
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415 云 南 植 物 研 究 30 卷