全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月

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·专 论·
药用植物 DNA 条形码研究进展
杨慧洁 1，杨世海 2*，张淑丽 2，路 放 2
1. 吉林农业大学 教育技术中心，吉林 长春 130118
2. 吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118
摘 要：近 10 年来，DNA 条形码（DNA barcoding）技术飞速发展，已经成为国际上生物学研究的热点之一。该技术在鉴
别动物物种上已经得到了广泛的认同和应用，但是在药用植物领域存在极大的挑战，至今还没能得出一个通用的候选序列。
候选序列主要有单序列如 matK、rbcL 等，复合序列如 rbcL＋trnH-psbA 等。现综述 DNA 条形码在药用植物鉴定中的应用研
究，并对常用单序列和复合序列的鉴定应用展开了讨论；同时针对近期提出的以叶绿体全基因组作为“超级条形码”的可行
性进行了分析讨论和展望，以期为中药药用植物的快速准确鉴定提供新的研究思路。
关键词：药用植物；DNA 条形码；候选序列；单位点序列；超级条形码
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)18 - 2581 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.18.001
Research progress on DNA barcoding in medicinal plants
YANG Hui-jie1, YANG Shi-hai2, ZHANG Shu-li2, LU Fang2
1. Center of Education Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
2. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: DNA barcoding, widely used and applied in identifying animal species, has become one of the hot topics in the study of
biology over the past decade; However, it is encountered bottlenecks because none of the available loci work across all plant species.
The most candidate DNA barcodes include single-locus barcodes (matK, rbcL, etc.) and multi-locus barcodes (rbcL + trnH-psbA, etc.).
Here, we review the development of candidate barcodes and the application in the identification of medicinal plants. We also discuss
the feasibility of using the complete chloroplast genome as “super-barcode” and expect to provide a new approach for fast and accurate
identifications of traditional Chinese medicinal plants.
Key words: medicinal plants; DNA barcoding; candidate DNA barcode; single-locus barcode; super-barcode

中药是中国劳动人民在长期的生活实践中积
累的宝贵财富。自《神农本草经》至今，经过几千
年的发展，在中药知识日益完善的同时，也暴露出
一些不可避免的问题。中药药用植物的准确分类和
鉴别是研究中药品质以及制定中药质量标准的重
要前提。中药传统的鉴定方法主要包括基原鉴定、
性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统的基原鉴定
和性状鉴定需要工作者丰富的理论知识和多年的
实践经验，同时受到药用植物表型及遗传变异等多
种变量的影响[1]，相对于目前已知的药用植物物种
而言，明显需要大量的分类学人才才能完全建立中
药的识别分类体系，这显然是很大的挑战。中药饮
片、粉末以及含有原型生药的传统中成药采用性状
鉴定显然不可取，而显微鉴定与理化鉴定对仪器和
操作技术要求较高、可重复性较低、操作相对复杂，
且近缘物种差异不显著、单一鉴定方法效率较低。
因此，迫切需要发展方便、快捷、高效以及易于标
准化的物种分析鉴定方法。
DNA 条形码（DNA barcoding）在中药药用植
物分类上具有明显的优势：1）不受植物样本个体

收稿日期：2014-05-12
基金项目：中国博士后科学基金项目（20090461042）
作者简介：杨慧洁（1963—），女，吉林长春人，工程师，主要从事教育技术研究。Tel: (0431)84533371 E-mail: yanghuijie63@163.com
*通信作者 杨世海 Tel: (0431)84533358 E-mail: jlyangs@163.com
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发育的影响。一些植物在生长发育过程中，形态上
差异变化会比较大，但 DNA 序列却不会发生变化。
2）相比于传统分类学，DNA 条形码分类鉴定技术
能够更好地区分形态相似的物种，避免了传统形态
分类学易犯的错误。3）依托于逐渐成熟的 PCR 和
更加先进的分子标记技术，DNA 条形码能够快速、
准确、方便地进行物种的鉴别鉴定。4）DNA 条形
码技术上手快、操作简单，能够快速建立物种鉴定
人才的学科网络，有效缓解现今分类学家紧缺、新
的分类学人才较少的现状。
DNA 条形码技术的出现为药用植物的快速准
确鉴定开辟了一条新的道路。由于不同药用植物的
DNA 特异性，DNA 条形码可以弥补传统分析鉴定
方法鉴别过程中存在的多种难题，是林奈发明双名
法之后分类学方面最大的进步，被认为是生命研究
领域的“大科学计划”[2]。本文综述了 DNA 条形码
在药用植物鉴定中的应用研究，并对常用单位点序
列和复合序列的鉴定应用展开了讨论。同时针对近
期提出的以叶绿体全基因组作为“超级条形码”的
可行性进行了分析讨论和展望，以期为中药药用植
物的快速准确鉴定提供新的研究思路。
1 DNA 条形码的概念
DNA 条形码（DNA barcoding）是指通过测定
DNA 序列信息以鉴别物种或其变异类型的一种新
型分子生物学技术。近些年来，随着生物技术的发
展，以 DNA 指纹（DNA fingerprinting）技术为代
表的分子水平的标记技术纷纷出现，并被广泛地应
用于物种鉴别或其遗传变异方向，成为 DNA 条形
码技术的前身。然而，常用的植物 DNA 分子标记
技术（如 RFLP、RAPD、SSR、ISSR 等）虽然可以
弥补传统形态鉴定学上的一些难点和缺陷，但是却
各自存在自身难以克服的缺点，如通用性较低、可
重复性差、难以标准化等。
2003 年，加拿大学者 Hebert 在文章中首先提出
将 DNA 条形码技术应用到物种鉴别中[1]。线粒体细
胞色素氧化酶亚基 1（cytochrome C oxidase subunit
1，CO1）在动物任何分类水平上都具有良好的鉴别
能力，进而提出以一段 650 bp 长的 CO1 序列作为鉴
别动物物种的条形码候选序列。近些年来，国内外
学者所得出大量的 CO1 实验结果表明，CO1 具有很
高的通用性，能够有效并且高效地鉴别动物物种。
然而对于植物界的分类研究进展相对比较缓
慢，主要由于在线粒体基因组方面。植物线粒体基
因组因杂交和基因渗入而导致变异较少，进化速率
较动物慢，遗传分化较小，所以适用于动物物种鉴
别的 CO1 片段就不适用于植物，同时由于核基因通
常具有多拷贝的特性，且种内变异较大，所以很难
设计通用引物，并且在扩增时对模板 DNA 的纯度
要求很高。随着对叶绿体基因组的研究不断深入，
科学家发现叶绿体基因组序列相对保守且同时具有
一定的变异，容易设计通用引物，满足植物条形码
的初步要求。此后，植物 DNA 条形码技术得到进
一步的发展[3-7]。
生物条形码联盟（CBOL）最初推荐作为植物
叶绿体 DNA 条形码候选序列有 matK、rpoC1、rpoB、
accD、nhdJ 和 YCF5 等，但是由于后 3 种在一些主
要植物中缺失，所以不适合作为通用的植物 DNA
条形码候选序列[8]。2009 年 11 月，在墨西哥召开的
第三届 DNA 条形码国际学术大会上，与会学者达
成共识，一致建议在 matK 和 rbcL 这 2 种目前常用
的 DNA 条形码序列之外，应对 ITS 和 trnH-psbA 这
2 种新的候选序列进行进一步的分析评估。
2 单位点序列
2.1 MatK
MatK 与其他基因序列相比，进化速率相对较快、
长度适中，具有种间差异度较高和碱基转换/颠换数
较低等特点[9-10]，缺点在于不同分支类群间很难使用
通用引物进行扩增和测序，不同的类群往往需要不同
的引物来扩增[11-12]。Lahaye 等[13]应用特定的 matK 基
因引物对 1 667 个植物材料进行扩增[14]，成功率达到
100%，单独使用 matK 对这几种植物物种的鉴别成功
率均在 90%以上。但是 96%的样本是兰科植物[15]，而
且并没有对种间的姊妹种进行鉴定识别，如果加上姊
妹种，可能会降低 matK 的识别率。
与之相反的是，Fazekas 等[3]在其研究中对 32
个种的 92 个物种应用 matK 进行鉴定，成功率仅有
56%。Newmaster 等[16]在研究中发现 matK 对肉豆蔻
科鉴别成功率只有 48.6%。虽然 CBOL 规定 matK
为植物DNA条形码序列的几个标准候选序列之一，
近些年在寻找该片段的通用引物方面，大量的学者
也进行了相关的工作，但是至今仍没能取得理想的
结果。因此，matK 难以成为通用条形码。
2.2 TrnH-psbA
TrnH-psbA 是叶绿体中的一段基因间隔区，在
植物中进化速率较快。其平均长度大多数在 450 bp
左右，长度适宜，由于两端存在保守序列，所以很
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容易设计通用引物，且该片段的引物具有高通用性、
高扩增成功率的特点[17]。但是该片段不同物种间间隔
区的长度或拷贝的变异性较大，序列长度变化区间为
296～1 120 bp，另外该序列存在较高比率的插入/缺
失现象，较难在大范围取样时进行序列比对[11]，导致
鉴别非同属的植物物种非常困难[15,18]。Kress 等[19]
认为 trnH-psbA 所分析鉴定的植物物种中有 92%具
有独特的间隔区序列，符合理想的条形码序列标准，
能够进行准确鉴定。同时，该基因片段在内毛楠属
植物的鉴别上有 70%的识别率[16]，对兰科植物的识
别率更高达 90%[13]，但在伞形科独活属和禾本科甜
茅属的鉴别中，因变异较小而无法成功鉴别[8,20]。
尽管如此，作为 CBOL 推荐的植物 DNA 条形码
候选序列之一，trnH-psbA 还是具有很大潜力。如果
能够找到合适的数据分析方法，该片段的主要缺点
（拥有过多的插入/缺失片段）将可能起到良好的作
用，可以增加物种鉴别的信息量，同时提升准确率。
2.3 RbcL
RbcL 在 Genbank 中有多达 50 000 条数据，其具
有种间通用、容易扩增、容易比对等特点，被 CBOL
推荐为植物 DNA 条形码候选序列之一。Newmaster
等[21]通过比对发现其能够鉴别同属 85%左右的物
种，因此认为 rbcL不但可以作为苔藓类植物的DNA
条形码候选序列，在其他植物类群中也具有较好的
鉴定效率。
但是Kress等[19]认为 rbcL序列在有花植物中进
化较慢，不适合作为种间水平上的鉴定标记；Lahaye
等[13]和 Fazekas 等[3]发现该片段的物种区分度要小
于 matK 和 trnH-psbA，虽然具有较高的扩增率，但
是物种鉴别的正确率仅为 48%。其主要原因是 rbcL
的全长较长，为 1 400 bp 左右，实验中需要 4 对引
物才能获得其全长，但是理想的 DNA 条形码序列
要求的片段长度都较短，所以导致在物种鉴定过程
中易扩增但是鉴别率较低。许多研究结果也同样得
出 rbcL 在种间水平的差异并不大，因此不适于用作
单独的 DNA 条形码候选序列，但是可以与其他的
序列片段相组合进行鉴定。
2.4 ITS 序列
ITS 序列是核糖体中的一段 DNA 片段，包括
ITS1、ITS2 和 5.8 S 3 个常用的 DNA 序列片段，广
泛存在于真菌和可进行光合作用的真核生物当中，具
有很高的种间差异性[22]。
在早期研究中，ITS1 的识别效果好于 ITS2[15,23]，
具有 81.5%的正确识别率，但在陆生植物中的扩增效
率较差，仅为 60.4%[15]。因此，CBOL 只推荐将 ITS
序列作为辅助 DNA 条形码用于植物物种鉴定[8]。5.8
S 片段相关研究很少。
ITS2 基因序列位置介于 ITS1 和 5.8 S 之间，具
有片段短、易扩增、易测序等特点[24-25]，更有学者
指出，ITS2 对于 DNA 已经降解的药材也有一定效
用[26]。Chen 等[27]基于 6 600 余个药用植物样本对常
用的 7 个条形码候选序列（matK、rbcL、trnH-psbA、
rpoC1、ycf5、ITS1、ITS2）进行对比研究，结果表
明 ITS2 序列的种间准确鉴定率最高，达到 92.7%。
因此正式提出将 ITS2 作为药用植物的 DNA 条形码
候选序列。随后的研究表明 ITS2 能够很好地鉴别芸
香科、蔷薇科、豆科、菊科、大戟科、黄芩属、重
楼属、鼠尾草属等多个科属物种[28-35]。
尽管 ITS2 有着相对较高的测序准确率，但是由
于其存在多拷贝的特性，对同属的物种进行鉴别时，
序列容易发生基因重叠现象，进而造成鉴定效率下
降。因此，作为 ITS 序列的代表，ITS2 基因序列仍
然未能很好地解决药用植物 DNA 条形码通用性的
问题。
2.5 其他
除了以上提到的条形码候选序列，目前也有将
rpoB、rpoC1、atpF-atpH、psbK-psbI、ycf5 以及 trnL
用于植物物种鉴别的报道[36-37]，但是由于没有足够
的种间变异性而无法适用于多个不同的物种。
单位点序列除了变异性、扩增效率受到限制外，
基因的缺失也是单位点序列不能作为通用条形码的
一个重要原因，如藻类因不含 matK 序列而无法应
用单一的 DNA 条形码进行鉴定。DNA 条形码提倡
应用一条简单的序列对所有物种进行鉴定，但是基
于单位点序列自身特点的限制，采用多序列或多位
点进行物种鉴定被越来越多的研究人员所接受。
3 复合序列
植物中单基因位点片段识别率较低[3,11,13,15,19,38-39]，
很难像 CO1 在动物界那样得到广泛应用，尤其难以
区分杂交品种或者有基因渗透的物种。因此，在筛
选基因作为植物 DNA 条形码候选序列时，不应该
只关注单片段序列，还可以考虑多片段组合。2007
年 9 月，在中国台湾举行的第二次国际生命条形码
大会上，与会者经过讨论，提出了多种片段组合，
以期能够弥补单位点序列的不足。
2009 年，CBOL 植物工作组通过对 7 种最常用
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的单位点序列从通用性、序列质量和鉴定效率等方
面进行综合评估，推荐以 matK＋rbcL 组合作为植
物通用条形码复合序列，对 397 个不同科属的样本
鉴定效率为 72%[8]。
不同的植物类群间进化速率差别较大，而多基
因片段组合方案给植物 DNA 条形码鉴定研究指出
了一条新的方向，理想的片段组合应该能够检测出
多重水平的种间差异[16]。近几年各国学者对组合片
段进行了一部分研究，但现有的结果仍不能满足条
形码所规定的标准，仍需要大量的实验结果提供更
加充足的证据证实其物种鉴别能力。
3.1 RpoC1＋ rpoB＋matK 或 RpoC1＋matk＋
trnH-psbA
该组合由 Chase 在 2007 年提出[11]，目的是结
合保守的 rpoC1 和 rpoB 易设计通用引物、扩增效
率高的特点和高度变异的matK或 trnH-psbA的高识
别性、高鉴定成功率。
3.2 RbcL＋trnH-psbA
Kress 等[15]在 2007 年提出此组合片段的设想，
准确地说采用的是 rbcL 中的一小段基因 rbcL-a。通
过实验对比发现，单独采用 rbcL-a 在种水平上的识
别率为 76.3%，trnH-psbA 的识别率为 83%，两者结
合之后可达到 95%，因此推荐其组合片段作为植物
DNA 条形码的候选序列。
3.3 MatK＋ atpF-atpH＋ psbK-psbI 或 MatK＋
atpF-atpH＋trnH-psbA
Pennisi 等[21]同样在 2007 年提出了 matK＋
atpF-atpH ＋ psbK-psbI 或 matK ＋ atpF-atpH ＋
trnH-psbA 组合片段，采用 UPGMA 聚类法，物种
单系性分辨率分别为 93.1%和 89.3%。
Fazekas 等[3]分析了上述 5 种不同的组合片段，
发现 rpoC1 ＋ rpoB ＋ matK 或 rpoC1 ＋ matk ＋
trnH-psbA 组合的成功识别率仅 61%； rbcL＋
trnH-psbA 组合的成功识别率为 64%；matK＋
atpF-atpH ＋ psbK-psbI 或 matK ＋ atpF-atpH ＋
trnH-psbA 组合单独使用时成功鉴别率仅为 45%和
44%，联用了几个片段之后成功率达到 69%，是上
述 5 种片段组合成功率最高的一种。
复合序列作为替代单基因序列的鉴定序列，有
着更广泛的适用性和更高的鉴别效率。组合片段序
列一般由一段进化速率较快的序列搭配一段进化速
率较慢的序列，但目前多数研究都是直接将几个序
列拼接成一个新的组合，这样可能会严重影响对于
鉴定物种的准确性。基因间区序列变异率较高，有
利于提高鉴定效率，如 trnH-psbA 等，但不同物种
间的基因间区大小差异较大，有些物种甚至会出现
“负间区”，即 2 个待测序列片段重叠而导致间区消
失。另外，因不同科属间基因排序可能不同，甚至
存在基因缺失，很难设计通用引物并扩增到共有序
列。所以在大范围的物种鉴别中，基因间区序列的
获得及比对是影响条形码鉴定的一个重要因素。不
同的植物类群间进化速率差别较大，理想的片段组
合应该能够检测出多重水平的种间差异[16]。由于还
缺少相当的样本进行分析，组合片段的可行性仍然
值得商榷。CBOL 在进行常用 7 个不同单序列组合
评价时也发现，简单的序列组合并不能显著提高物
种鉴定效率[8]。
4 药用植物 DNA 条形码发展趋势探讨
自 DNA 条形码这一概念提出以来，其技术发
展日益成熟，能够更加客观、精确、简便地对物种
进行鉴定，可以一次性进行大量的样本鉴定，综合
成本较低，而且不需要多年的形态学鉴定经验，操
作简便、可重复、易于标准化，形成了对传统形态
鉴定学一个强有力的补充，得到了许多专家学者的
支持。但目前 DNA 条形码也遇到了发展瓶颈，尽
管在科属较集中时鉴别效率较高（约为 90%），但
是在广泛性选择物种时，鉴定成功率显著下降，尤
其是近缘物种的准确鉴定，迄今没能找到通用的
DNA 条形码序列，导致部分专家对于 DNA 条形码
在物种鉴定上的能力持怀疑或反对态度，认为应用
DNA 条形码技术会将传承已久的分类学鉴定方法
还原为类型学鉴定方法，这样是一种倒退[40-41]。
而相比于传统的 DNA 条形码，新近提出的以
叶绿体全基因组作为条形码候选序列的“超级条形
码”具有更高的鉴定效率和准确性，因而受到越来
越多专家学者的关注。
基于 DNA 条形码自身的限制，在植物鉴定领
域可能永远也不可能找到动物中 CO1 这样的鉴定
位点，因此需要用更高效的序列来鉴别突变率较低
的物种[42]。2008 年在加拿大英属哥伦比亚大学召开
的植物无国界（Botany without Borders）会议上，与
会者指出叶绿体全基因组有着能和动物 CO1 序列
相媲美的信息量，同时由于大规模平行测序技术
（MPS）的发展，能够将叶绿体全基因组作为 DNA
条形码序列应用在物种鉴别上，并将其称之为“超
级条形码”[43]，基于叶绿体基因组的物种鉴定受到
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鉴定学家的逐步认可。Sucher 等[44]在近缘药用植物
的鉴别中提出，基于基因组的“指纹”图谱可以在
种及种群的水平上对植物物种的个体进行鉴别，在
相同性质的样本及伪品的检测中具有优势。相比于
其他核糖体DNA序列，叶绿体DNA序列更具有“天
生”的优势：叶绿体全基因组广泛存在于植物当中，
避免了单基因序列带来的个别物种序列缺失的问
题，同时也能够有效地解决普通DNA条形码在PCR
扩增时的诸多问题[45]。其基因序列的平均长度为
1.1×105～1.6×105 bp，远超常用DNA条形码300～
700 bp 的长度，不仅具有很高的保守性，其包含的
物种进化的信息量也远大于常用DNA条形码序列，
能够体现足够的种间差异，因此能够有更好的鉴别
效率和准确度[46-50]。
1986 年，Shinozaki 等[51]完成了烟草和地钱的
叶绿体全基因组序列测定，第一次完成了单一物种
的叶绿体全基因组测序。但是由于当时的技术落后，
叶绿体全基因组测序成本很高，效率很低。因此，
直到 2010 年，NBCI 上的叶绿体全基因组序列的个
数还不足 200，仍不足以作为物种鉴别的数据库进
行使用。
Parks 等[52]对松属的 37 个样本进行叶绿体基因
组测序，除了在低分类水平上检验了叶绿体基因组
的系统发育及种群遗传学研究上的能力，提出叶绿
体基因组可以作为种水平上的植物条形码。Nock
等[53]以总 DNA 为模板进行测序，以近缘同属物种叶
绿体序列为参考拼接，获得了叶绿体基因组全序列，
由此可以在有参考近缘物种序列时降低测序成本，
并可以应用于近缘物种的鉴定。Doorduin 等[54]成功
对菊科植物 Jacobaea vulgaris 的 17 个个体以叶绿体
基因组作为“条形码”进行鉴别分类，这是世界首
次应用一条叶绿体基因序列鉴别一个物种内的多个
不同样本，这证明了以测定全叶绿体基因组序列进
行物种鉴别的“超级条形码”有作为所有植物物种
公用“条形码”的潜力。
Kane 等[55]认为基于叶绿体基因组的“超级条形
码”在种下分类水平可以进行物种的鉴别，尤其是
在近缘物种和不同基因型个体的区分上表现出极强
的判别能力。采用序列差异进行物种的鉴别是生物
鉴定学家最常用的经典方法，但 Hebert 等[56]认为物
种鉴别最简捷的方法是根据一个基因在 2 个物种中
是否存在进行判断。不同物种的质体基因组在基因
种类上是不同的，相对目前常用的条形码序列，这
是叶绿体基因组可以成为通用的植物“超级条形码”
的一个明显优势。另外，不同物种的基因排列顺序
也不尽相同，利用基因排序的差异进行物种鉴定也
引起了研究人员的兴趣[57-58]。
目前，“超级条形码”还具有较多的局限和挑战。
随着第 2 代测序技术（NGS）广泛应用于叶绿体基
因组测序，高纯度的叶绿体 DNA 成为成功测序的必
要前提。虽然 Diekmann 等[59]提出了一套较为标准的
叶绿体 DNA 提取方法，但是对于样本的新鲜程度和
浓度梯度溶液提出了较高的要求。基于目前的条件，
较难获得可用于测序的高纯度叶绿体 DNA。
Roche/454、Illumina 及 Ion Torrent 等测序技术
的发展和成熟直接降低了植物叶绿体基因组的测序
成本，但是全基因组测序成本仍然高于目前传统条
形码技术。较高的成本直接导致叶绿体全基因组数
据库的不健全。截至 2013 年 12 月，只报道了 410
条植物物种的叶绿体基因组序列（图 1）。

图 1 1986—2013 年 Genbank 中叶绿体全基因组总数
Fig. 1 Total number of complete chloroplast genome sequences
submitted to Genbank from 1986 to 2013
尽管如此，相比传统条形码技术的种种不足，对
于“超级条形码”未来良好发展前景仍为开展中药
药用植物鉴定提供了一个新的思路。
5 结语
综合目前研究状况而言，不同于 DNA 条形码
在动物界的出色表现，在整个植物界，找到一个基
因序列或者一段较短的 DNA 片段用以鉴别区分所
有药用植物物种几乎是不可能的。因此寻找相应的
替代方法进行物种鉴定就成为必然。DNA 条形码技
术已经走到了一个十字路口，如果不能尽快找出通
用的条形码序列或寻求到一种完善的解决不同物种
所需条形码候选序列的方式（如与其他学科专业相
结合进行分析研究），那么应用 DNA 条形码作为药
用植物物种鉴定的手段与方法必将在专家学者的争
序
列
数

500
375
250
125
0
1986—2002 2004 2006 2008 2010 2012 2013
年份
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议声中迎来寒冬。随着测序技术的发展以及测序成
本的降低，有关叶绿体全基因组序列测定的报道已
经初见报端，以全叶绿体基因序列进行测序并分析
以寻找适合作为药用植物鉴定的 DNA 条形码候选
序列和以全长叶绿体基因组序列作为“超级条形码”
将成为“后 DNA 条形码时代”的研究重点。
参考文献
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