全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 11 期 2016 年 6 月

• 1935 •
• 药材与资源 •
太子参 3 个肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析
丁 铃，李 军，周 涛*，郑 伟，龙登凯，江维克，肖承鸿
贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002
摘 要：目的 克隆太子参肌动蛋白（Actin）基因片段并进行序列分析。方法 利用植物 Actin 基因的保守序列设计简并引
物，通过 RT-PCR 和抑制 PCR 扩增太子参 Actin 基因核心片段。利用半定量 RT-PCR 分析太子参 Actin 基因在不同种源、不
同器官、不同生长发育时期的表达情况。结果 通过 RT-PCR 获得 3 条太子参 Actin 基因的核心片段，长度均为 760 bp，依
次命名为 PhACT1、PhACT2、PhACT3。通过抑制 PCR 及序列拼接后 3 条核心片段依次延长至 1 008、1 008、975 bp，分别
编码 336、336、325 个氨基酸残基。半定量 RT-PCR 分析表明 PhACT2 和 PhACT3 基因在不同种源、不同器官、不同生长发
育时期的表达量基本恒定，PhACT1 基因存在一定的差异。结论 首次从太子参中克隆得到 3 条太子参 Actin 基因序列，并
确定 PhACT2 基因适合作为太子参功能基因表达分析的内参基因。
关键词：太子参；肌动蛋白；基因克隆；序列分析；RT-PCR
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)11 - 1935 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.11.021
Cloning and sequence analysis of three Actin gene fragments from Pseudostellaria
heterophylla
DING Ling, LI Jun, ZHOU Tao, ZHENG Wei, LONG Deng-kai, JIANG Wei-ke, XIAO Cheng-hong
Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China
Abstract: Objective Cloning and sequence analysis of the cDNA fragments encoding Actin gene from Pseudostellaria heterophylla.
Methods Degenerate primers were designed based on the conservated sequences of the cloned Actin gene from other plant species. The core
fragments of Actin gene were obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and the flanking fragments were cloned
by using suppression PCR. The expression profiles of Actin gene in different cultivated provenances, organs, and development stages were
analyzed by semiquantitative PCR. Results The three Actin genes obtained were designated PhACT1, PhACT2, and PhACT3, which were
extended to 1 008, 1 008, and 975 bp through suppression PCR, encoding 336, 336, and 325 amino acids, respecifively. The semiquantitative
PCR analysis showed that PhACT2 and PhACT3 had a stable expression except PhACT1. Conclusion Three Actin genes are cloned and the
PhACT2 could be used as an internal standard gene for the expression analysis of the functional genes in P. heterophylla.
Key words: Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax; Actin; gene cloning; sequence analysis; RT-PCR

基因表达分析是了解植物功能基因的表达规
律，解析植物复杂代谢网络并对其进行表达调控的
重要手段之一[1]。通过实时荧光定量 PCR 获得目的
基因的相对表达量是目前最为常用的基因表达检测
方法。因此，从植物中筛选出在不同器官、不同发
育时期表达基本恒定的管家基因作为研究的内参基
因是获得准确基因表达分析结果的关键[2]。肌动蛋
白（Actin）基因是广泛存在于植物中的管家基因，
其编码的肌动蛋白是细胞骨架中微丝的主要组分，
参与细胞内许多重要的生理活动，如细胞形状的维
持、胞质环流、细胞运动、细胞分裂、细胞分化、
细胞内的物质运输、急性建成以及信号转导等，具
有高度保守、表达量高且稳定的特点，常被用作基
因表达分析的内参基因[3-4]。

收稿日期：2015-11-16
基金项目：国家自然科学基金项目（81460579）；贵州省普通高等学校特色重点实验室建设项目（黔教合 KY 字 [2013] 108 号）；施秉中药材
产业科技合作专项计划项目 [施中药科合专项（2014）第 6 号]；贵州省研究生工作站建设项目（黔教研合 JYSZ 字 [2014] 016）
作者简介：丁 铃（1990—），女，硕士研究生，研究方向为中药资源鉴定与质量控制。Tel: 15285135826 E-mail: dingling5826@163.com
*通信作者 周 涛（1968—），女，教授。Tel: (0851)85607526 E-mail: taozhou88@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 11 期 2016 年 6 月

• 1936 •
太 子 参 为 石 竹 科 孩 儿 参 Pseudostellaria
heterophylla (Miq.) Pax 的干燥块根，具有益气健脾、生
津润肺的功效[5]。现代研究表明，太子参多糖具有抗应
激、抗疲劳、增强免疫力的功效[6]，与药材益气健脾、
补气生津的传统功效相似；太子参环肽类成分具有酪
氨酸酶抑制活性，有抗黑色素生成作用[7]，与现代将太
子参作为保健品、化妆品进行研制开发的定位理念相
得宜彰。但大量研究显示，各产区栽培太子参的药材
质量参差不齐，特别是药材指标性成分太子参环肽类
的量差异显著[8-9]，其量的比例变化与地区年日照数及
降雨量密切相关[10-11]。近年来，从连作障碍、土壤微
生物方面改善栽培太子参药材品质[12-13]，结合太子参
农艺性状、遗传多样性水平筛选优良种源已有研究报
道[14]，但针对太子参药材品质形成及其产生地理变异
的遗传与生态学机制研究却严重滞后，太子参功能基
因的研究尚处于起步阶段。鉴于此，本研究通过
RT-PCR与抑制PCR技术克隆太子参的Actin基因核心
片段，并进行序列分析，检验Actin 基因在太子参不同
种源、不同器官、不同生长过程中的表达稳定性，为
后续研究太子参其他功能基因的表达分析和调控机制
提供内参基因。
1 材料与方法
1.1 材料
2014 年 9 月 26 日从贵州施秉牛大场太子参种
质资源圃采集不同种源太子参共 7 份，分别为江苏
句容（JJ-1）、江苏句容（JJ-2）、福建柘荣（FZ-1）、
福建柘荣（FZ-2）、贵州施秉（GS-1）、贵州施秉
（GS-2）、贵州施秉（GS-3）；2015 年 3 月 7 日采集
GS-2 的花、茎、叶、块根；2015 年 4 月 21 日采集
GS-2 单株的第 1～4 茎节及对应的叶片。太子参所
有样品经贵阳中医学院周涛教授鉴定为孩儿参
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax 的干燥块根
均经液氮处理后，−80 ℃冰箱中保存，备用。
质粒载体 pMD19-T、反转录酶 M-MLV、限制
性内切酶 Dra I 和 Hae III、RNAiso Plus 试剂盒、
DNase I、DL 500 DNA Marker 及 DL 2000 DNA
Marker 购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖
凝胶回收试剂盒购自 Omega 公司，2×Taq PCR
MasterMix 和大肠杆菌 Escherichia coli 菌株 DH5α
购自天根生化科技（北京）有限公司。其余试剂均
为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取、纯化和 cDNA 的合成 取
−80 ℃保存的太子参材料于预冷的研钵中加液氮
迅速研磨成粉末状。根据 TaKaRa 公司 RNA 抽提试
剂盒说明提取总 RNA；按照 DNase I 试剂盒说明纯
化太子参总 RNA，以除去总 RNA 中残留的微量
DNA。用 30 μL DEPC 水溶解总 RNA，取 3 μL 用
1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用核酸定量仪检测总
RNA 浓度。以总 RNA 为模板，Oligo d (T)11 为引物，
利用 M-MLV 反转录酶合成 cDNA 第一链，−80 ℃
保存，备用。
1.2.2 RT-PCR 扩增 从 NCBI 数据库下载植物
Actin 的核苷酸序列进行同源性比较，找出高度保守
区域，根据同源性高和简并性低的原则，设计简并
引物 Actin-F/Actin-R（表 1），以 cDNA 为模板进行
表 1 引物信息
Table 1 Primers used in this study
引物名称 序列 (5’→3’) 引物名称 序列 (5’→3’)
Actin-F CAACTGGGATGAYATGGARAAG ap7-H GAACGGGGTGCTCTTCTGGTGC
Actin-R CVACCTTDATCTTCATGCTG ap7-D GGCAACATACATAGCTGGAACG
ap8-HD AAGTTCATTGTAGAAAGTATGATG Adaptor1 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGC
GTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT ap9 AGAGACGTCGAAGAGCAGCTC
Adaptor2 PO4-ACCAGCCC-NH2 ap10 AGCTGCAGGCATTCACGAGACTACC
GSP1 GTAATACGACTCACTATAGGG ap11 GATTTGGGTCATTTTCTCCCTG
GSP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT ap12 CTTCGGTAAGTAGAACTGGGTGC
ap1 GCGTGAAATCATCAGAGACATG Actin-1F TCAATCCTAAGGCAAATCGTG
ap2 TCTGTCGAGAAGAGCTATGAGCTG Actin-1R TTCATAGTCAAGGGCAATGTAAG
ap3 CAGCACTATGCCAGTCGTACGAC Actin-2F CTCCATACCGATAAATGAAGGC
ap4 TTGAGAGGTGCTTCAGTCAAGAGG Actin-2R CACTGTTCCAATCTATGAGGGTTA
ap5 GGAAGCCGCCAAAAGCAGCTCT Actin-3F CAATGATGGCTGGAAGAGGA
ap6 GTCCCCTGGTATCCATGAGACAAC Actin-3R CCAAGGCTAACAGGGAGAAAA
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• 1937 •
PCR 扩增，25 μL 反应体系包含 1 μL cDNA、1 μL
Actin-F（10 μmol/L）、1 μL Actin-R（10 μmol/L）、
12 μL 2×Taq PCR MasterMix [0.1 U/μL Taq
Polymerase、500 μmol/L dNTP each、20 mmol/L
Tris-HCl（pH 值为 8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L
MgCl2]、12 μL ddH2O。PCR 扩增程序为 94 ℃预变
性 5 min；94 ℃变性 30 s；57 ℃退火 30 s；72 ℃
延伸 1.5 min；40 个循环；72 ℃后延伸 7 min；PCR
产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条
带，Omega 胶回收试剂盒，回收片段重组入
pMD19-T 载体，转化 DH5α 感受态细胞，并接种到
含 60 mg/mL Ampicillin（AMP）的 Luria-Bertanil
（LB）平板上，37 ℃培养过夜，挑取菌斑以 500 μL
含 60 mg/mL AMP 的液态 LB 培养基培养 8 h。取菌
液为模板 PCR 扩增进行克隆检测，选取多个阳性克
隆进行测序分析。
1.2.3 基因组DNA的提取及Actin基因侧翼序列扩
增 改进 CTAB 法提取太子参基因组 DNA。取 1 g
幼嫩叶片于干净的研钵中，加入 0.04 g PVP 和 3 mL
CTAB 提取液（1.4 mol/L NaCl；0.1 mol/L Tris-HCl，
pH 值为 8.0；20 mmol/L EDTA，pH 值为 8.0）研匀，
装入 10 mL EP 管中；加入 60 μL β-巯基乙醇，充分
混匀；65 ℃保温 45 min；加入 1 mL 5 mol/L 醋酸
钾，冰上放置 20 min；加入 4 mL 氯仿-异戊醇（24∶
1）混合液用力混匀，放置 10 min；10 000 r/min 离
心 10 min，取上清；加入 2/3 体积预冷的异丙醇，
用力混匀，常温静置 10 min；12 000 r/min 离心 2
min，弃上清；75%乙醇洗涤 2 次，自然干燥；加入
150 μL ddH2O 溶解；加入 4 μL 10 mg/mL RNase A，
37 ℃保温 1 h；加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25∶
24∶1）充分混匀，放置 5 min；12 000 r/min 离心 5
min，取上清；加入 1/3 体积 3 mol/L 醋酸钠（pH 5.2）
和 2.5 倍体积的无水乙醇，充分混匀，静置 10 min；
12 000 r/min 离心 15 min，弃上清；75%乙醇洗涤 2
次，自然干燥；用适量 ddH2O 溶解。取 3 μL 用于
1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用核酸定量仪检测
DNA 溶度。
分别取 10 μg 基因组 DNA，各加入 Dra I 和
Hae III 3 μL，37 ℃消化 3 h，取适量用 1.5%琼脂
糖凝胶电泳检测酶切效果，酶切产物用乙醇沉淀
法回收，并用适量 ddH2O 溶解。根据已经报道的
接头序列[15]合成 Adaptor1 和 Adaptor2，稀释成
50 μmol/L，等体积混匀，沸水浴保温 5 min，然
后在沸水浴中自然冷却至室温。连接体系包含 8
μL 基因组酶切产物、4 μL 混合接头、10 μL
10×Ligase Buffer、3 μL T4 DNA Ligase，于 PCR
仪上 16 ℃反应 3 h，乙醇沉淀法回收连接产物作
为扩增模板。根据 Adaptor1 设计特异引物 GSP1、
GSP2，获得的 3 条 Actin 基因核心片段设计特异
引物 ap1～ap12（表 1），以 GSP1 与外侧特异引
物形成引物对进行第 1 轮扩增，将扩增产物稀释
2 倍，取 1 μL 作为模板，GSP2 与内侧特异引物
形成引物对进行第 2 轮巢式扩增。用琼脂糖凝胶
电泳分离扩增产物，切下目的条带，Omega 胶回
收试剂盒回收，回收片段重组入 pMD19-T 载体，
转化 DH5α 感受态细胞，筛选出多个阳性克隆进
行测序分析。
1.2.4 序列分析 运用生物信息学软件分析
Actin 氨基酸序列中的保守结构域与活性位点，从
NCBI 数据库下载其他植物 Actin 基因的氨基酸序
列，采用 Muscle 3.6 软件进行多重比对，并将比
对 结 果 通 过 MEGA 4.0 软 件 采 用 邻 接 法
（neighbor-joining method，NJ）构建系统发育树。
1.2.5 基因表达分析 根据获得的 3 条 Actin 基因片
段序列比对结果，设计特异引物 Actin-1F/Actin-1R、
Actin-2F/Actin-2R、Actin-3F/Actin-3R（表 1），以等
量总 RNA 反转录的 cDNA 为模板进行半定量
RT-PCR 扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，
分析太子参 Actin 基因在不同种源、不同器官、不
同生长发育时期的表达情况。
2 结果与分析
2.1 总 RNA 的提取及 Actin 基因核心片段的获得
按照 TaKaRa RNA抽提试剂盒说明书提取的总
RNA，28 S、18 S 条带清晰，无 DNA 污染均可用
于后续实验（图 1）。以总 RNA 反转录得到的 cDNA
为模板，用 Actin 基因的简并引物 Actin-F/Actin-R
进行 RT-PCR 扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检
测发现在 760 bp 处有一条亮带（图 2），且上下无
杂带，与推测的目的片段大小一致。将该条带进
行切胶、回收、克隆。随机挑取 14 个阳性克隆测
序，经序列比对后发现其中包含了 3 条不同的 Actin
基因片段，长度均为 760 bp，分别命名为 PhACT1、
PhACT2、PhACT3。
2.2 基因组 DNA 及 Actin 基因侧翼片段的扩增
琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，改良 CTAB 法
能获得较高质量的基因组 DNA，可用于后续实验
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• 1938 •


M-Marker 1～4-块根 5～8-叶
M-Marker 1—4-root tuber 5—8-leaf
图 1 太子参总 RNA 电泳检测
Fig. 1 Electrophoresis of total RNA from P. heterophylla

M-Marker 1-PCR 扩增产物
M-Marker 1-products of PCR amplification
图 2 Actin 基因核心片段电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of DNA fragments of Actin by PCR
（图 3）。经 Dra I 和 Hae III 2 种限制性内切酶消化
后与接头相连的产物形成 2 个“DNA 库”，利用
GSP1、GSP2 与 ap1～ap12 组成的引物对对 3 条
Actin 基因的侧翼序列进行巢式扩增，选取阳性扩增
进行克隆，每条序列选取 2～3 个阳性克隆进行平行
测序（图 4）。通过 Sequencher 4.2 软件将测序结果
分别与 PhACT1、PhACT2、PhACT3 进行序列拼接，
通过 Blast 和 Genetyx version 7 对拼接序列进行比
对、分析，除去非编码区，最终确定 3 条 Actin 基
因的编码区由760 bp分别延长至1 008、1 008及975
bp，GenBank 登入号依次为 KT363847、KT363848、
KT363849。
2.3 太子参 Actin 基因序列分析
根据序列拼接结果，推测 PhACT1、PhACT2
与 PhACT3 分别编码含 336、336 和 325 个氨基酸
残基的多肽，其中包含 2 种 Actin 信号序列：
YVGDEAQSKRG（35～45、35～45、24～34）为
Actinssignature 1 序列，LLTEAPLNPKANR（86～

M-Marker 1～4-贵州施秉太子参（GS-2）
M-Marker 1—4-provenance of Guizhou Shibing (GS-2)
图 3 太子参基因组 DNA 电泳检测
Fig. 3 Electrophoresis of genomic DNA from P. heterophylla

1-PhACT3 5’-侧翼序列 2-PhACT3 3’-侧翼序列 3-PhACT2 5’-
侧翼序列 4-PhACT2 3’-侧翼序列 5-PhACT1 5’-侧翼序列
6-PhACT1 3’-侧翼序列 M-Marker
1-PhACT3 5’-flanking sequence 2-PhACT3 3’-flanking sequence
3-PhACT2 5’-flanking sequence 4-PhACT2 3’-flanking sequence
5-PhACT1 5’-flanking sequence 6-PhACT1 3’-flanking sequence
M-Marker
图 4 抑制 PCR 扩增 Actin 基因侧翼序列 (5’→3’)
Fig. 4 Suppression PCR amplification flanking sequence of
Actin gene (5’→3’)
98、86～98、85～87）为 Actins and actin-related proteins
signature 序列（图 5）。通过 BlastP 对 3 个 Actin 基因
编码的蛋白进行保守区预测，结果显示 PhACT1、
PhACT2和PhACT3均属于NBD_sugarkinase_ HSP70_
actin superfamily 家族（图 6）。统计发现，3 条多肽均
含有 20 种常见氨基酸，量相对较多的是丙氨酸（Ala，
A）、甘氨酸（Gly，G）、异亮氨酸（Ile，I）、亮氨酸
（Leu，L）和谷氨酸（Gly，E），以上 5 种氨基酸的总
量在 3 条多肽中分别达 40%、38%和 38.4%，量相对
较低的是色氨酸（Trp，W）和半胱氨酸（Cys，C），
分别只含 3 个和 2 个。
2.4 太子参 Actin 基因进化分析
为了探索太子参 Actin 基因与其他植物 Actin
基因的进化关系，选取序列比对中同源性较高的鹅
肠 菜 Myosoton aquaticum (L.) Moench 、 甜 菜
Betavulgaris L.、青葙 Celosia argentea L. 等 15 个物
种的 23 条 Actin 基因，利用它们的氨基酸序列构建
1 2 3 4 5 6 7 8 M
2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 M 23 130 bp
9 416 bp
6 557 bp
4 361 bp
2 322 bp
2 027 bp



564 bp
1 2 3 4 5 6 M
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
150 bp
100 bp
50 bp
2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 M
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• 1939 •

框内为 Actin 信号序列
Box for Actin signal sequence
图 5 太子参 Actin 基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig. 5 Nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of Actin gene fragment of P. heterophylla

图 6 太子参 Actin 保守区结构域
Fig. 6 Conserved domains of Actin protein from P. heterophylla
NJ 进化树（图 7）。结果发现，来源于太子参的 3
个 Actin 基因被归入 Class I 和 Class II 2 个亚群，
PhACT2（KT363848）和 PhACT3（KT363849）出
现在 Class I，PhACT1（KT363847）出现在 Class II，
说明太子参 Actin 不仅存在多个异型体，而且发生
了功能的分化。
将太子参与其他植物的 Actin 氨基酸序列片段
进行多重比较，发现 Actin 基因虽然在植物进化过
120
40
240
80
360
120
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160
600
200
720
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1 008
336


120
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1 008
336


120
40
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160
600
200
720
240
840
280
960
320
975
325
PhACT1
PhACT2
PhACT3
PhACT1
PhACT2
PhACT3
Query seq.
Specific hits
Superfamilies
Multi-domains
Query seq.
Specific hits
Superfamilies
Multi-domains
Query seq.
Specific hits
Superfamilies
Multi-domains
NBD_sugar-kinase_HSP70_actin
NBD_sugar-kinase_HSP70_actin superfamily
ACTIN


NBD_sugar-kinase_HSP70_actin
NBD_sugar-kinase_HSP70_actin superfamily
ACTIN


NBD_sugar-kinase_HSP70_actin
NBD_sugar-kinase_HSP70_actin superfamily
ACTIN
1 50 100 150 200 250 300 336
1 50 100 150 200 250 300 336
1 50 100 150 200 250 300 325
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• 1940 •

图 7 Actin 氨基酸序列 NJ 进化树分析
Fig. 7 Phylogenetic tree of Actin amino acid sequence
程中基因功能发生了分化，但其氨基酸序列仍表现
出高度的保守性。在进行多重比较的 336 个氨基酸
序列中，保守氨基酸多达 314 个，而非保守氨基酸
仅有 22 个，不足 7%。已有研究[16]发现在关键位置
氨基酸的替换可能是引起植物 Actin 基因功能分化
的原因，在本研究中同样的位置也出现了类似的替
换，PhACT1 与同属于 Class II 的拟南芥（U39480）
和水稻（NM001057621）在第 181 位由 S 取代了 M，
第 217 位 S 取代 A，第 221 位 S 取代 N（U39480
为 N）（图 8），暗示这 3 个特殊位置的氨基酸突变
可能与植物 Actin 基因功能分化存在一定的联系。
2.5 表达稳定性分析
通过半定量 RT-PCR 技术，分析 3 个 Actin 基因
在不同种源、不同器官、不同生长发育时期的表达情
况。根据 3 个 Actin 基因的核心片段设计的特异引物
Actin-1F/Actin-1R、Actin-2F/Actin-2R、Actin-3F/Actin-3R
分别对 PhACT1、PhACT2、PhACT3 基因进行特
异扩增，扩增产物长度依次为 344、328 和 464 bp
（图 9）。
2.5.1 种源特异性分析 分别提取不同种源太子参
块根中的总 RNA，利用半定量 RT-PCR 分析 3 个
Actin 基因在太子参不同种源块根中的表达情况。研
究发现，3 个 Actin 基因在不同种源块根中均有表

框内为特殊位置的氨基酸突变位点
Box for the special position of the amino acid mutation sites
图 8 不同物种 Actin 基因比对分析
Fig. 8 Comparison on alignment of Actin from different species
芒果（JF737036）
胡杨（XM011048067）
蔷薇（JN399226）
桑（HQ163776）
毛白杨（JX986590）
蓖麻（AY360221）
猕猴桃（EF063572）
棉花（AY305728）
棉花（AY305727）
太子参 （KT363848）
甜菜（XM010673076）
甜菜（HQ656028）
青葙（HQ844002）
梭梭（KM886609）
鹅肠菜（KP099106）
太子参（KT363849）
拟南芥（U39480）
拟南芥（U39449）
拟南芥（U27980）
拟南芥（U27982）
甜菜（XM010687471）
太子参（KT363847）
拟南芥（U27981）
玉米（NM001156990）
水稻（X15865）
水稻（NM001057621）
Class I










Class II
0.02 0 0.010 0.000
KT363847
KT363848
KT363849
XM_0106730
AY305728
HQ656028
HQ44002
U39480
NM_00115699



KT363847
KT363848
KT363849
XM_0106730
AY305728
HQ656028
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115
115
104
115
115
115
115
115
115



230
230
219
230
230
230
230
230
230
336
336
325
336
336
336
336
336
336
* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 *
120 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 *
240 * 260 * 280 * 300 * 320 *
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 11 期 2016 年 6 月

• 1941 •

M-Marker 1-PhACT2 2-PhACT3 3-PhACT1
图 9 3 个 Actin 基因扩增片段
Fig. 9 Amplification fragments of three Actin genes
达，PhACT2 和 PhACT3 表达量高且稳定，PhACT1
在不同种源太子参块根中的表达量具有一定的差异
且相对较低（图 10）。
2.5.2 组织特异性分析 分别提取 GZ-2 的花、茎、
叶、块根的总 RNA，半定量 RT-PCR 分析表明，3 个
Actin 基因在太子参各器官中均有表达，PhACT1 在各
器官中的表达量相对较低，PhACT3 的表达量相对较
高，但两者在不同器官的表达量存在一定的差异，而
PhACT2 在各器官中的表达量高且稳定（图 11）。

1-FZ-2 2-GS-2 3-GS-3 4-GS-1 5-FZ-1 6-JJ-2 7-JJ-1
图 10 3 个 Actin 基因在不同种源块根中的表达
Fig. 10 Expression levels of three Actin genes in root tuber
of P. heterophylla from different sources
2.5.3 生长过程中表达稳定性分析 为了检测 3 个
Actin 基因在太子参生长过程中的表达情况，以
GZ-2 为样品，提取同一株太子参不同茎节和相应茎
节上叶的总 RNA，通过半定量 RT-PCR 分析，结果
表明，3 个 Actin 基因在生长过程中表达相对稳定，

1, 5-花 2, 6-茎 3, 7-叶 4, 8-块根
1, 5-flowerr 2, 6-stem 3, 7-leaf 4, 8-root tuber
图 11 3 个 Actin 基因在太子参不同器官中的表达
Fig. 11 Expression levels of three Actin genes of P.
heterophylla in different organs
除 PhACT1 表达量相对偏低外，PhACT2 和 PhACT3
均相对较高（图 12）。

1-第 1 茎节 2-第 2 茎节 3-第 3 茎节 4-第 4 茎节 5-第 1 茎节叶
6-第 2 茎节叶 7-第 3 茎节叶 8-第 4 茎节叶
1-1th stem 2-2nd stem 3-3rd stem 4-4th stem 5-1th leaf
6-2nd leaf 7-3rd leaf 8-4th leaf
图 12 3 个 Actin 在太子参生长过程中的表达
Fig. 12 Expression levels of three Actin genes during the
growth of P. heterophylla
3 讨论
植物中的 Actin 是一条多肽链的球状蛋白，一般由
375～377 个氨基酸组成，相对分子质量约为 4.2×104，
属于多基因家族，从而产生多种 Actin 异型体[17-18]。这
些异型体虽然在一级结构上同源性很高，但在时间
和空间表达上具有组织和器官特异性，执行着不同
的生理功能，以适应不同组织和细胞类型在不同发
育时期的需要[19-20]。目前研究证明 Actin 主要分为
营养型和生殖型 2 类。编码营养型的 Actin 基因在
所有营养器官和细胞类型中组成型表达，而编码生
殖型的 Actin 基因主要在成熟花粉、生长的花粉管
或者胚珠中表达[21-23]。因此，在以 Actin 作为内参
基因进行功能基因相对定量分析时，需要筛选出在
该植物不同器官、组织以及不同生长期均能稳定表
达的组成型 Actin 基因。本研究利用 RT-PCR 和抑
制 PCR 技术得到分别编码 3 种太子参 Actin 异型体
的 Actin 基因的核心片段 PhACT1、PhACT2 和
PhACT3，其编码的蛋白质保守区预测结果显示，3
条序列均属于 Actin superfamily 家族，且含有 2 种
Actin 基 因 信 号 序 列 ： YVGDEAQSKRG 和
LLTEAPLNPKANR，与 GenBank 中收录的其他植
物的 Actin 基因编码的氨基酸序列相似度均达
95%以上，说明太子参的 Actin 基因也属于多基因
家族，编码多种 Actin 异型体，并且基因序列具
有高度的保守性。将太子参的 3 个 Actin 基因片
段编码的氨基酸序列与其他植物同等大小的氨基
酸序列进行进化分析，发现明显被分为 2 类：Class
I 和 Class II 2 个亚群，该研究与前人研究结果一
致[16,24]。3 个太子参 Actin 基因分别属于 2 类，
PhACT2 和 PhACT3 属于 Class I，PhACT1 单独属
于 Class II，说明在这 3 个太子参 Actin 基因中包含
1 2 3 4 5 6 7
PhACT1

PhACT2

PhACT3
PhACT1


PhACT2


PhACT3
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 M
500 bp
400 bp
300 bp
250 bp
150 bp
100 bp
50 bp
PhACT1
PhACT2
PhACT3
1 2 3 4 5 6 7 8
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 11 期 2016 年 6 月

• 1942 •
了营养型和生殖型 2 种类型的 Actin 异型体，基因
功能发生了分化，并且 PhACT2 和 PhACT3 这 2 个
基因在亲缘关系及功能上可能更为接近。
肌动蛋白虽然被认为是真核生物细胞中普遍存
在的最保守的古老蛋白之一，但在自然界适应生存
下其编码基因仍然存在着变异，其中在一些关键位
置的变异可能导致其产生多种异型体。通过对 3 个
太子参Actin基因编码的氨基酸序列的同源性比较，
结果显示，太子参存在 3 个特殊位置氨基酸的替换，
与李军等[16]对桑树的研究结果极为相似，这可能就
是导致功能分化的关键位置。为了从 3 个太子参
Actin 基因中筛选出稳定表达基因作为内参基因，本
研究对 3 个 Actin 基因在太子参不同种源、不同器
官以及在不同生长过程中的表达情况进行了分析，
结果与序列进化分析一致：PhACT1 表达量相对较
低且在不同的种源、器官和生长阶段中表达存在一
定的差异，可能为生殖型肌动蛋白基因；PhACT2
和 PhACT3 表达量相对较高且表达差异相对较小，
推断其为营养型肌动蛋白基因，在所有营养器官和
细胞类型中组成型表达，其中尤其以 PhACT2 表达
量高且稳定，可以作为太子参功能基因研究的内参
基因。该基因的确定为探讨太子参药材代谢物质形
成的遗传学机制以及其他功能基因的表达规律奠定
了前期基础。
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