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Chemical structural features and primary molecular conformation of polysaccharide HPS4-1A from Hedysarum polybotrys

红芪多糖HPS4-1A的化学结构特征研究及分子构象初步分析



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 2 期 2013 年 1 月

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红芪多糖 HPS4-1A 的化学结构特征研究及分子构象初步分析
党子龙,刘小花,赵安娜,梁建娣,梁 瑾,刘子亨,封士兰*
兰州大学药学院,甘肃 兰州 730000
摘 要:目的 研究红芪多糖 HPS4-1A 的化学结构特征,并初步分析其构象。方法 红芪经水提醇沉法提取、Sevage 法脱
蛋白、H2O2脱色素、Sephadex G-200 色谱柱分离纯化得到均一的红芪多糖 HPS4-1A。以 GC 法、高效液相凝胶色谱(HPGC)
法、凝胶渗透色谱-多角度激光散射仪联用(GPC-MALLS)法、元素分析、苯酚硫酸法、Bradford 法研究其理化性质;以
GPC-MALLS 法对其构象进行初步分析。采用甲基化、部分酸水解、以及 NMR 研究其连接方式、主链和支链结构及分支点
状况。结果 HPS4-1A 的绝对分子质量为 7.386×104,相对分子质量 6.68×105以上;由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳
糖组成,其摩尔比为 1∶2∶1∶2,主链骨架由 1, 5、1, 3, 5 连接的 α-L-呋喃阿拉伯糖和 1, 6、1, 2, 6 连接的 α-D-吡喃半乳糖
组成,侧链分支点位于阿拉伯糖的 3 位与半乳糖的 2 位。侧链分支由 1, 4、1, 4, 6-α-D-吡喃葡萄糖,1, 2、1, 2, 4-α-L-呋喃鼠
李糖组成。主链末端连接主要是阿拉伯糖,并且连接在 1, 5 连接的阿拉伯糖的 5 位。侧链末端连接主要是葡萄糖,还有少量
的阿拉伯糖。结论 HPS4-1A 为一种新的中性红芪杂多糖,其构象为无规线团状,并且相对分子质量分布呈单分散性。
关键词:红芪;中性多糖;化学结构;构象;单糖组成
中图分类号:R284.18 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)02 - 0141 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.02.005
Chemical structural features and primary molecular conformation
of polysaccharide HPS4-1A from Hedysarum polybotrys
DANG Zi-long, LIU Xiao-hua, ZHAO An-na, LIANG Jian-di, LIANG Jin, LIU Zi-heng, FENG Shi-lan
School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Abstract: Objective To study the chemical structural features and conformation of polysaccharide HPS4-1A from Hedysarum
polybotrys. Methods A fraction of water-soluble neutral polysaccharide was obtained from H. polybotrys by aqueous extraction
followed by precipitation with ethanol. The homogeneous polysaccharide named HPS4-1A was obtained after treated with Savage
method and H2O2 , and purified with Sephadex G-200 gel filtration chromatography. Then GC, HPGC, GPC-MALLS, element
alanalyser, phenol sulfuric acid method, and Bradford method were used to study the physicochemical property of HPS4-1A; The
conformation was primarily analyzed with GPC-MALLS method. The connection, main chain and branched-chain structures, and the
condition of branching point were studied by methylation, partial acid hydrolysis, and NMR method. Results The absolute and
relative molecular weights of HPS4-1A were 7.386 × 104 and above 6.68 × 105; HPS4-1A was a heteropolysaccharide and consisted of
L-rhamnose, L-arabinose, D-glucose, and D-galactose (1︰2︰1︰2). HPS4-1A proved to be a neutral sugar, with 1, 6- and 1, 2,
6-α-D-galactopyranosyl and 1, 5- and 1, 3, 5-α-L-arabinofuranosyl residues in backbone, and 1, 4- and 1, 4, 6-α-D-glucopyranosyl and
1, 2- and 1, 2, 4-α-L-rhamnofuranosyl residues in branches. Arabinose mainly connected the end of backbone, and glucose and a
small quantity of arabinose mainly connected the end of branches. Conclusion HPS4-1A is a new neutral heteropolysaccharide from
H. polybotrys. HPS4-1A has a random coil state conformation with monodisperse mass distribution.
Key words: Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz; neutral heteropolysaccharide; chemical structure; conformation; monosaccharide
composition

红芪为豆科植物多序岩黄芪 H e d y s a r u m
polybotrys Hand. -Mazz 的干燥根,具有补气升阳、
固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒
排脓、敛疮生肌的功效[1]。红芪中含有多种不同活

收稿日期:2012-11-07
基金项目:甘肃省中小企业创新基金计划资助(0911WCCA005)
作者简介:党子龙(1988—),男,在读硕士研究生。
*通信作者 封士兰 E-mail: fengshl@lzu.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 2 期 2013 年 1 月

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性组分的多糖,其药理作用也不相同。文献报道红
芪多糖具有降血糖[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、免疫调
节[4]以及保肝[5]等药理作用。本课题组提取纯化得
到的多糖 HPS4 经前期研究表明具有抗辐射、抗肿
瘤以及抗氧化的药理作用,本实验分析了从 HPS4
中分离纯化得到的一种新的杂多糖组分红芪多糖-
1A(HPS4-1A)的结构。
1 材料与仪器
BP211D 型与 BS224S 型电子天平(德国
Sartorius 公司);UV—1700 紫外可见分光光度计(日
本岛津公司);DHG—9075A 型电热恒温鼓风干燥
箱(上海一恒);KQ—3200DE 超声波仪器(江苏
昆山公司);BS—100N 自动部分收集器,BT100N
数显恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)。CR22GⅡ离
心机(日本日立);Freezone 6PWS 型真空冷冻干燥
仪(美国 LABCONCO);透析袋(截留相对分子质
量 3 500,美国科技发展公司);multi EA 4000 元素
分析仪(德国 Elementar Analysensysteme 公司);
Dawn HeleosⅡ型十八角度激光散射仪(美国怀雅特
技术公司);Waters 600 高效液相色谱仪(美国
Waters 公司);UltrahydrogelTM 1000、500 色谱柱(美
国 Waters 公司);GC 2014 型气相色谱仪(日本岛津
公司);QP2010 GC-MS 仪(日本岛津公司);OV—
101 毛细管色谱柱(兰州中科安泰分析科技有限责
任公司);600 MHz Inova 600 NB 核磁共振波谱仪
(德国 Bruker 公司)。
标准单糖:鼠李糖(批号 111683-200401)、阿
拉伯糖(Ala,批号 111506-200001)、木糖(Xyl,
批号 111508-200404)、甘露糖(Man,批号 140651-
200602)、葡萄糖(Glc,批号 110833-200904)、半
乳糖(Gal,批号 100226-201105)、葡萄糖醛酸(批
号140648-200602)、半乳糖醛酸(批号111646-200301)
均购于中国食品药品检定研究院;右旋糖酐(dextran)
对照品(668 000、410 000、273 000、148 000、48 600、
23 800、11 600、5 200)批号为 SDKC-600-200903,
购于美国 PSS 公司。
红芪样品购自甘肃武都,经兰州大学药学院马
志刚教授鉴定为多序岩黄芪 Hedysarum polybotrys
Hand. -Mazz. 的根。干燥、粉碎后备用。
2 方法
2.1 提取与分离
粉碎的红芪(4.0 kg)以 10 倍量的沸水提取 3
次,每次 3 h。水提取液减压浓缩至生药质量浓度
1 mg/mL,加入 95%乙醇至终体积分数为 70%。所
得沉淀复溶于水中(质量分数 1%~3%),加入 95%
乙醇至终体积分数为 40%,取上清液,浓缩后得到
红芪粗多糖 4(HPS4)。HPS4 经 Sevage 法脱蛋白[6],
H2O2 除色素[7]后再醇沉分级,得到 40%多糖部位
HPS4-1 和 70%多糖部位HPS4-2。HPS4-1 经 Sephadex
G-200 柱色谱,以 0.05 mol/L pH5.2 的 NaAc-HAc 缓
冲液洗脱得到 3 个均一组分:HPS4-1A、HPS4-1B、
HPS4-1C。HPS4-2 经 DEAE-52 柱色谱,以 0.1~1.0
mol/L 的 NaCl 梯度洗脱得到 1 个均一组分 HPS4-2A。
2.2 HPS4-1A 质量分数、相对分子质量、绝对分
子质量、分子构象及分子质量分布
采用高效凝胶色谱法(HPGPC)对 HPS4-1A
进行质量分数鉴定及相对分子质量的测定,流动相
为蒸馏水。采用凝胶渗透色谱与光散射仪(GPC-
MALLS)联用技术测定其绝对分子质量、分子构象
及相对分子质量分布,流动相为 0.1 mol/L NaNO3
与质量分数为 0.02% NaN3 的混合溶液。色谱柱为凝
胶渗透色谱柱 UltrahydrogelTM 1 000、500 串联,体
积流量 0.8 mL/min,柱温 30 ℃,示差折光检测器
温度为 35 ℃。相对分子质量测定时将相对分子质
量分别为 5 200、11 600、23 800、48 600、148 000、
273 000、410 000、668 000 的右旋糖酐标准品用流
动相配成质量浓度为 0.5 mg/mL 的水溶液,按相对
分子质量由小到大顺序依次分别进样,测定保留时
间(t)。以 t 对相对分子质量对数(lgMw)绘制标
准曲线,计算 HPS4-1A 的相对分子质量。
2.3 多糖理化性质的测定
总糖质量分数的测定用苯酚-硫酸法[8];蛋白质
质量分数的测定用 Bradford 法[9];糖醛酸的鉴定与
质量分数测定用气相色谱法[8]和硫酸-咔唑法[8];多
糖中碳(C)、氢(H)、氮(N)、硫(S)元素分析
采用元素分析仪进行分析。
2.4 单糖组成分析
取 10 mg HPS4-1A、加 2.0 mL 2.0 mol/L 三氟乙
酸(TFA)置于特弗伦管中,封管后 120 ℃水解 3 h,
冷却后于 60 ℃减压旋蒸除去 TFA,加入 1.5 mL 甲
醇溶解,减压蒸干,重复 3 次,除尽 TFA。向已水
解的样品中加入 10 mg 盐酸羟胺、7 mg 内标肌醇六
乙酰酯、0.5 mL 吡啶,置烘箱中 90 ℃恒温 30 min。
取出后冷至室温,加入 0.5 mL 醋酸酐,在 90 ℃下
继续反应 30 min(乙酰化)。反应产物减压蒸干,溶
于 1.0 mL 氯仿中,进行 GC 分析[10]。
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气相色谱条件:色谱柱为 OV-101 柱;进样口
温度为 210 ℃;检测器温度为 260 ℃;载气压力
0.5 mPa;程序升温:起始温度 175 ℃,以 15 ℃/min
的速度升至 225 ℃,保持 5 min,然后以 5 ℃/min
的速度升至 250 ℃,保持 1.5 min。
2.5 甲基化分析
HPS4-1A 5 mg 充分干燥,溶于 DMSO,用改
良的 Hakomori 法[8]甲基化,经 IR 分析无羟基后,
水解,还原,乙酰化后进行 GC-MS 分析。
气相色谱条件:柱温 175 ℃;载气为氦气;进
样口温度 210 ℃;载气体积流量 1.00 mL/min;进
样模式为分流;分流比 50.0;进样体积 1 μL。
质谱条件:离子源温度 200 ℃;接口温度 210
℃;溶剂延迟 4 min;阈值 1 000;起始时间为 4.00
min;结束时间为 14.83 min;采集方式为 Scan;质
谱检测范围(m/z)为 33.00~630.00。
2.6 部分酸水解分析[8]
取 HPS4-1A(50 mg)用 0.1 mol/L TFA 100 ℃
水解1 h,冷却至室温后于60 ℃减压旋蒸除去TFA,
加入 1.5 mL 甲醇溶解,减压蒸干,重复 3 次,除尽
TFA。用蒸馏水溶解,透析(截留相对分子质量 3 500)。
袋内部分经 Sephadex G-200 柱色谱纯化后得到次级
多糖组分 HPS4-1A-H;袋外部分经 Sephadex-25 柱色
谱纯化得一低聚糖 HPS4-1A-L 和混合的单糖组分。
然后按“2.4”项方法进行单糖组成分析。
2.7 NMR 分析
精密称取充分干燥的 HPS4-1A 15 mg,溶于 0.5
mL 重水中,冷冻干燥,如此重复用重水交换 3 次,
再溶于 0.5 mL 重水后,用微孔滤膜(0.45 μm)滤
过后在 Bruker DRX—600 核磁共振光谱仪上进行
1H-HMR 和 13C-NMR 分析。
3 结果
3.1 HPS4-1 的分离纯化
HPS4-1 经 Sephadex G-200 排阻色谱分离,
HPS4-2 经 DEAE-52 分离得白色絮状红芪多糖
HPS4-1A、HPS4-1B、HPS4-1C,以及 HPS4-2A;
得率分别为 0.4%、0.6%、0.3%、10%。经过 HPGPC
检测,各多糖均呈单一对称峰(峰面积归一化法计
算质量分数均在 98%以上,其中 HPS4-2A 质量分数
达到 99.64%),说明以上 4 组分都是均一多糖。
3.2 HPS4-1A 相对分子质量、绝对分子质量、分
子构象及分子质量分布
以右旋糖酐系列标准葡聚糖的保留时间(t)为
横坐标和相对分子质量的对数(lgMw)为纵坐标计
算得回归方程为 lgMw=s-3.20e-001t^1+2.39e-
003t^2,r2=0.998 1。如图 1 所示,色谱峰 A 为
HPS4-1A 的色谱峰,HPS4-1A 的相对分子质量大于
6.68×105。

A-HPS4-1A B-对照品中的杂质 1~7-右旋糖酐对照品(相对分子
质量从大到小)
A-HPS4-1A B-impurities in reference substance 1—7-dextran
reference substance (relative molecular weight is in a decreasing order)
图 1 HPS4-1A 及右旋糖酐对照品 HPLC 图
Fig. 1 HPLC chromatogram of HPS4-1A and dextran
reference substance
采用示差折光检测器和激光检测器分别记录供
试品质量浓度和供试品在不同角度的光散射强度;
dn/dc 值为 0.174,通过多角度激光散射仪自带ASTRA
V 软件计算得到 HPS4-1A 的绝对分子质量为 7.386×
104、分布指数 d= wM / nM =1.057;以旋转均方根半
径对摩尔质量作图(图 2)得到的斜率为 0.45,说


图 2 HPS4-1A 均方根旋转半径对摩尔质量图
Fig. 2 Root mean square turning radius
to molar mass of HPS4-1A

60
50
40
30
20
1.0×105
摩尔质量 / (g·mol−1)







/
n
m


10 20 30
t / min
1
A B
2
3
4
5
6
7
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明 HPS4-1A 的构象为无规则线团;分布指数接近
1.00,说明 HPS4-1A 相对分子质量分布呈单分散性,
即表明摩尔质量分布范围较集中,分子大小较均一。
3.3 多糖理化性质
HPS4-1A 的总糖质量分数为 99.32%,蛋白质质
量分数为 0.00%,糖醛酸测定呈阴性,即不含有糖醛
酸。元素分析 C、H、O、S、N 的质量分数分别为
38.81%、6.92%、54.27%、0.00%、0.00%,经计算得
C、H、O 的摩尔比约为 1∶2∶1,符合多糖的元素及
组成比例,此结果也证明 HPS4-1A 不含硫酸基和蛋
白质。由于 HPS4-1A 不含氮元素,说明不含氨基;并
且不含糖醛酸,说明 HPS4-1A 为中性多糖。
3.4 单糖组成分析
HPS4-1A 经气相色谱分析后,用面积归一化法
得 HPS4-1A 的单糖组成及其比例为 Rha-Ara-Glc-Gal
(1∶2∶1∶2)。色谱图见图 3 和图 4。

1-鼠李糖 2-阿拉伯糖 3-木糖 4-甘露糖 5-葡萄糖 6-半乳糖
7-内标, 下图同
1-Rha 2-Ara 3-Xyl 4-Man 5-Glc 6-Gal 7-internal standard, same as below
图 3 混合单糖对照品的气相色谱图
Fig. 3 GC chromatogram of mixed monose
reference substances

图 4 HPS4-1A 的气相色谱图
Fig. 4 GC chromatogram of HPS4-1A
3.5 甲基化分析
经改良的 Hakomori 甲基化后结果见表 1。
表 1 HPS4-1A 甲基化结果
Table 1 Methylating results of HPS4-1A
部分甲基化的糖基 摩尔比 糖基连接方式
2, 3, 5-tri-O-Me-Araf 1.47 Araf (1→
2, 3-di-O-Me-Araf 24.09 →5) Araf (1→
2-O-Me-Araf 7.63 →3, 5) Araf (1→
3, 4-di-O-Me-Rha 5.22 →2) Rhap (1→
3-O-Me-Rha 2.78 →2, 4) Rhap (1→
2, 3, 4, 6-tetra-O-Me-Glc 4.67 Glcp (1→
2, 3, 6-tri-O-Me-Glc 24.84 →4) Glcp (1→
2, 3-di-O-Me-Glc 2.67 →4, 6) Glcp (1→
2, 3, 4-tri-O-Me-Gal 16.02 →6) Galp (1→
3, 4-di-O-Me-Gal 9.35 →2, 6) Galp (1→

3.6 部分酸水解结果分析
HPS4-1A 部分酸水解后经气相色谱对其单糖
组成分析知,HPS4-1A-L 的单糖组成及其比例为
Rha-Glc-Ara(1.0∶1.1∶0.2);HPS4-1A-H 的单糖
组成及其比例为 Ara-Gal(2.6∶2.7≈1∶1)。从部
分酸水解结果可知主链骨架由阿拉伯糖和半乳糖组
成,支链主要由葡萄糖和鼠李糖组成,也有少量的
阿拉伯糖存在于支链中。
3.7 NMR 分析
HPS4-1A 的 NMR 分析后数据见表 2。参考文
献报道的 α-L-Araf异头碳的化学位移位于 δ 113.4~
107.6;α-L-Rhap 异头碳的化学位移位于 δ 101.0~
100.0;α-D-Glcp 异头碳的化学位移位于 δ 102.0~
100.0;α-D-Galp 异头碳的化学位移位于 δ 102.0~
100.0。因此可以确定 HPS4-1A 中的阿拉伯糖为
α-L-Araf;鼠李糖为 α-L-Rhap;葡萄糖为 α-D-Glcp;
半乳糖为 α-D-Galp;由碳谱和氢谱的数据推知多糖
HPS4-1A 的主要连接方式与甲基化的结果一致。表
1 中鼠李糖、葡萄糖连接方式的摩尔比总和与阿拉
伯糖、半乳糖连接方式的摩尔比总和接近 2∶3,虽
然与气相色谱的结论(1∶1)有偏差,偏差的原因
可能是由于在甲基化过程中超声使支链断裂造成,
但足以说明 HPS4-1A 为多分支的多糖。
4 讨论
由于相对分子质量和绝对分子质量测定时溶剂
系统不同,所以多糖伸展和皱缩的程度不同[22]。多
糖在水中呈伸展状态,在盐溶液中呈皱缩状态[23],

7 8 9 10 11 12 13 14
t / min
1
2
3
4
5
6 7

7 8 9 10 11 12 13 14
t / min
1
2
5
6
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表 2 HPS4-1A 的 1H-NMR 和 13C-NMR 化学位移
Table 2 1H-NMR and 13C-NMR chemical shifts of HPS4-1A
多糖残基 C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6 参考文献
A α-L-Araf(1→ 113.4/― 84.2/4.20 76.8/3.95 86.5/4.00 64.9/3.82, 3.86 11-12
B →5)α-L-Araf(1→ 107.6/5.06 81.3/4.20 75.6/4.05 86.5/4.27 69.6/3.79, 3.91 13-14
C →3, 5)α-L-Araf(1→ 108.5/5.04 80.7/4.27 84.2/4.04 81.2/4.45 72.8/3.82, 3.96 13-14
D →2)α-L-Rhap(1→ 101.0/― 78.6/4.10 72.7/3.87 76.0/3.41 70.2/3.74 20.73/1.11 13,15
E →2, 4)α-L-Rhap(1→ 101.0/― 79.2/4.20 72.8/3.92 84.2/3.82 72.8/3.47 21.0/1.12 13,16-17
F α-D-Glcp (1→ 102.0/4.87 74.3/3.61 76.0/3.96 73.6/3.87 75.6/3.74 72.7/3.44 17-18
G →4) α-D-Glcp (1→ 102.6/5.06 74.3/3.60 76.0/3.84 79.3/3.50 73.7/3.63 65.0/3.63, 3.68 19-20
H →4, 6) α-D-Glcp (1→ 101.8/4.97 74.3/3.61 75.6/3.70 78.6/3.41 72.8/3.68 76.0/4.00 19-20
I →6) α-D-Galp (1→ 101.8/5.04 72.0/3.91 72.8/4.10 71.0/3.87 72.7/4.27 69.6/3.79, 4.00 19-21
K →2, 6) α-D-Galp (1→ 102.0/5.06 80.7/3.87 73.7/3.10 72.8/3.92 72.0/4.30 70.2/3.82, 4.05 21-23
“―”表示图谱中未解析出此位置的归属
“―” indicates that the data was not assigned
与前者相比后者的分子半径变小,在通过凝胶色谱
柱时后出峰,而前者先出峰,从而导致相对分子质
量测定结果不一致。另外,相对分子质量测定时使
用的是葡聚糖的对照品,而 HPS4-1A 是由 4 种单糖
组成的杂多糖,两者结构差异较大,推测 HPS4-1A
的分支较多,分子半径较大,此结论在甲基化和部
分酸水解的结果中也得到了印证。
综上分析可知 HPS4-1A 主链骨架由 1, 5、1, 3,
5-α-L-Araf 和 1, 6、1, 2, 6-α-D-Galp 组成,侧链分支
点位于阿拉伯糖的 3 位与半乳糖的 2 位。侧链分支
由 1, 4、1, 4, 6-α-D-Glcp,1, 2、1, 2, 4-α-L-Rhap 组
成。主链非还原末端连接主要是阿拉伯糖,并且是
连接在 1, 5 连接的阿拉伯糖的 5 位[13-14]。侧链非还
原末端连接主要是葡萄糖,可能还有少量的阿拉伯
糖。HPS4-1A 为中性杂多糖,其构象为无规线团状,
并且具有单分散性,即表明摩尔质量分布范围较集
中,分子大小较均一。
体外实验表明,该多糖大剂量具有抗辐射、抗
肿瘤以及及抗氧化作用,其作用机制还在进一步研
究中。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] 赵良功, 李晓东, 赵建辉, 等. 4 种红芪多糖对实验性
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