全 文 ：凝胶渗透色谱-多角度激光散射联用技术研究
红芪多糖中 4 个组分分子特征
陈同强1，ADILBEKOV J1，3，王娟1，沈孝丽1，
石义凯1，胡芳弟1，封士兰1，2*
( 1. 兰州大学 药学院，甘肃 兰州 730000; 2. 甘肃省新药临床前研究重点实验室，甘肃 兰州 730000;
3. 塔什干药物研究所，乌兹别克斯坦 塔什干 100015)
［摘要］ 目的:测定红芪多糖 3( HPS-3) 中 4 个组分的绝对分子量，相对分子质量分布，均方根旋转半径( Rg ) ，多分散系
数( Mw/Mn) 等分子特征参数，以均方根旋转半径( Rg ) 对重均分子量( Mw) 作图，计算 4 个组分在溶液状态的构象。方法: 采
用凝胶渗透色谱-多角度激光散射( GPC-MALLS) 联用技术，流动相为含 0. 02% NaN3的 0. 1 mol·L
－1 NaNO3溶液，Ultrahydro-
gelTM1000，500 色谱柱串联。结果: HPS-3 的 4 个组分中，HPS-3-C 的 Mw最大( 1. 986 × 105 g·mol －1 ) ;其次为 HPS-3-B( 1. 113
× 105 g·mol －1 ) 和 HPS-3-D ( 8. 457 × 104 g·mol －1 ) ; HPS-3-A 的 Mw 最小( 1. 223 × 104 g·mol －1 ) ，而 Rg最大 ( 55. 5 nm) 。
HPS-3-D相对分子质量分布范围最广，Mw/Mn 2. 543。在流动相中，HPS-3-A为球型构象，HPS-3-C为无规则线团构象，HPS-
3-B和 HPS-3-D则均为高枝化度结构。结论:为进一步研究 HPS-3 中 4 个组分分子特征与其生物活性的关系提供必要依据。
［关键词］ 红芪多糖;凝胶渗透色谱;多角度激光散射;分子特征
［稿件编号］ 20111109005
［基金项目］ 甘肃省中小企业创新基金计划项目( 0911WCCA005)
［通信作者］ * 封士兰，教授，Tel: ( 0931) 8915686，E-mail: fengshl@
lzu. edu. cn
红芪系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪 Hedysar-
um polybotrys Hand. -Mazz 的根，为甘肃特产名贵药
材。作为传统中药，在临床上具有强心，降糖，利尿，
抗病毒，抗衰老等功效［1］。红芪多糖是红芪的主要
活性成分之一，其中 HPS-3 部分具有较明显的降血
糖［2］及体外抗氧化［3］等作用。目前国内外对红芪
的化学成分已有了较详细的报道［4］，而对于红芪多糖
研究，主要集中在化学结构［5-7］及一些药理作用［8-10］
的研究。多糖作为生物高分子化合物，其药理活性，
不但取决于多糖链的化学结构，与多糖本身的溶解
度、相对分子质量及分布、支化度、链构象等物理性质
也有着密切关系。由于多糖的生理功能主要是在人
体的体液环境中实现，因此，只有弄清多糖分子在溶
液中的链构象才能深入研究其生物活性。本实验测
定了 HPS-3 中 4 个组分在溶液中的绝对分子量
( Mw) 、多分散系数( Mw/Mn) 、均方根旋转半径( Rg )
等数据，经软件计算 4个组分在溶液中的构象。
与传统凝胶渗透色谱( GPC) 法［11］相比，尺寸排
除色谱和光散射联用( GPC-MALLS) 为绝对方法，可
直接测定 Mw，Mw /Mn，Rg。GPC-MALLS 联用技术
测定相对分子质量时受样品结构及相对分子质量限
制小，不依赖泵流速，不需要标准品作对照，就可直
接测得重均分子量，更重要的是，该技术还可提供样
品在溶液状态下构象信息。
1 材料
BS-100N自动部分收集器，BT100N数显恒流泵
( 上海青浦沪西仪器厂) ; CR22G Ⅱ型离心机( 日本
日立公司) ; BUCHIR-200 旋转蒸发仪 ( 瑞士 Buchi
公司) ; LABCONCO 型真空冷冻干燥仪 ( 美国
LABCONCO公司) ; Waters 高效液相色谱仪; Wyatt-
DAWN HELEOS十八角度激光光散射仪( Astra 处理
软件，美国怀雅特公司) ; BS-224S 1 /1 万分析天平
( Sartorius公司) 。
红芪药材购自甘肃武都，经兰州大学药学院马
志刚教授鉴定为红芪 H． polybotrys 的根，干燥、粉碎
后备用。葡聚糖标准品 ( 批号 Mw23800，美国 PSS
公司) ，Sephadex G-100，G-75( 上海长征制药厂) ，其
他试剂均为分析纯。
2 方法
2. 1 HPS-3 的提取［12］
红芪药材粉碎后，用 95%乙醇脱脂 1 h。10 倍
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量水 60 ℃下提取 2 次，每次 1 h，合并后浓缩，浓
缩液依次以 30%，50%，70%乙醇沉淀，分别得红
芪多糖 1 ( HPS-1 ) ，红芪多糖 2 ( HPS-2 ) ，红芪多糖
3 ( HPS-3 ) 。
2. 2 HPS-3 的分离纯化［13］
HPS-3 经 Sevag 法脱蛋白，双氧水脱色，浓缩后
以 70%乙醇沉淀 2 次，冷冻干燥。用水溶解后，经
DEAE-cellulose 52 柱色谱( 2. 6 cm ×70 cm) ，分别用
含 0，0. 1，0. 3 mol·L －1 NaCl 的 NaAc-HAc 缓冲盐
( pH 5. 2) 洗脱，苯酚-硫酸法示踪，分别得到 4 个组
分。4 个组分分别经反复 Sephadex G-100( 2. 6 cm ×
90 cm) ，Sephadex G-75 ( 2. 6 cm ×90 cm) 柱色谱，蒸
馏水洗脱，得到 HPS-3-A，HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-
D 4 个组分。
2. 3 HPGPC鉴定多糖组分纯度
采用 HPGPC-DAD-RI 联用技术，UltrahydrogelTM
1000，500色谱柱串联，流动相超纯水，流速 0. 8 mL·
min －1，柱温 40 ℃，示差折光检测器温度 40 ℃，进样量
30 μL。样品浓度为 3 g·L －1，0. 22 μm膜过滤。
2. 4 GPC-MALLS 联用技术分析 4 个组分的
构象［14，17］
2. 4. 1 色谱分析条件 采用 UltrahydrogelTM1000，
500 色谱柱串联凝胶色谱，流动相为含 0. 02% NaN3
的 0. 1 mol·L －1NaNO3溶液，流速 0. 8 mL·min
－1，
柱温 40 ℃ ; MALLS 光源气体为氦气和氖气，波长
690 nm。流动相折光指数取 1. 330，4 个组分在溶液
中的折光指数增量( dn /dc) 测得值均近似为 0. 135，
校准激光的仪器常数为 8. 110 4 × 10 －6，校准示差折
光检测器仪器常数为 2. 269 7 × 10 －4。
2. 4. 2 样品溶液的制备 精密称取样品 HPS-3-A，
HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D，用流动相配制成 5 g·
L －1溶液，经 0. 22 μm 滤膜过滤，进行 GPC-MALLS
分析。
2. 4. 3 4 个组分分枝状况的化学分析 采用 Ha-
komori法［15］甲基化 4 次，IR检测，无羟基峰后水解、
还原、乙酰化进行 GC-MS 分析。
3 结果与讨论
3. 1 HPS-3 中 4 个组分的定性分析
HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 水溶液双缩脲和茚
三酮反应均呈阳性，HPS-3-A水溶液则呈阴性; 4 个组
分苯酚硫酸反应均产生颜色反应;苯酚-硫酸法测得
HPS-3-A，HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 多糖质量分数
分别为 99. 2%，96. 5%，95. 3%，95. 2%。HPLC-DAD
图显示，4 个组分在 190 nm 左右均有多糖特征吸收
峰，而 HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 水溶液在 280 nm
有弱紫外吸收，HPS-3-A水溶液则无。以上结果表明
组分 HPS-3-A为多糖，组分 HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-
3-D为含少量蛋白质或多肽的多糖蛋白质复合物。
经元素分析仪分析，HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 有
少量 N元素( 分别为 0. 54%，0. 83%，0. 47% ) ，据凯
氏定氮原理计算得 HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 蛋白
质质量分数分别为 3. 38%，5. 19%，2. 94%。
3. 2 HPGPC纯度检测结果
HPS-3 中 4 个组分经 HPGPC 检测，见图 1，
HPS-3-A，HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D均为单一对称
峰，由出峰时间 tR可初步判断，HPS-3-A 的相对分
子质量最小，HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 三者相对
分子质量大小相近。
1. HPS-3-A; 2. HPS-3-B; 3. HPS-3-C; 4. HPS-3-D。
图 1 HPS-3 中 4 个组分的 HPGPC图
Fig. 1 Chromatogram of the liquors of the four components in
HPS-3
3. 3 GPC-MALLS联用技术分析
采用葡聚糖对照品对各个角度激光强度作归一
化处理，考察对流动相浓度 ( 含 0. 02% NaN3 的
NaNO3溶液，0 ～ 0. 1 mol·L
－1 ) ，样品浓度( 2 ～ 5 g
·L －1 ) ，柱温 ( 30 ～ 50 ℃ ) 及流速 ( 0 ～ 1 mL·
min －1 ) 对样品激光信号的影响［16］，结果表明，流动
相浓度对样品激光信号的影响最大，其次为样品浓
度，而柱温与流速的影响则较小。为避免过高柱压，
同时尽量缩短分析时间，流速设为 0. 8 mL·min －1。
流动相浓度的增大以及样品浓度的增加( 特别是相
对分子质量较小的样品) ，在较大程度上削减了噪
音，提高了激光信号，然而过高浓度的流动相易造成
色谱柱及检测器污染，而且，多糖相对分子质量较
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大，溶解度一般较小，浓度过高，溶解不完全，易造成
较大实验误差。因此，最终选用含 0. 02% NaN3的
0. 1 mol·L －1 NaNO3溶液为流动相，样品质量浓度
为 5 g·L －1，柱温为 40 ℃，选取 90 度角激光信号
( 灵敏度高) ，此条件下的样品色谱图见图 2。
1. 示差图; 2. 90 度角激光峰色谱图。
图 2 4 个组分的示差图和 90 度角激光峰色谱图
Fig. 2 Chromatograms of four components with differential re-
fraction Index and scattering angle 90 degrees
与图 1 比较，HPS-3-A 在 MAALLS 和示差图上
的出峰时间( tR≈25 min) 基本不变，而其他三者 tR
均出现明显延迟，而且，在考察流动相浓度对样品激
光信号影响过程中，发现随着流动相浓度的变化，
HPS-3-A的 tR基本不受影响，而其他三者的 tR随着
流动相浓度变大而逐渐增加。HPS-3-A作为多糖组
分，多糖链的构型与分子形状大小在流动相一定浓
度范围内不会随电解质 ( 盐 ) 的浓度改变，而且，
HPS-3-A相对分子质量较小，其在溶液中的运动自
由度较大，受电解质( 盐) 浓度的影响也会小一些，
而 HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 作为多糖蛋白质或
多肽复合物，其中含有少量蛋白质或多肽，其构型和
分子形状大小会受到电解质( 盐) 的影响［17］。一般，
在电解质( 盐) 浓度较小时，一定相对分子质量的多
糖蛋白或多肽复合物会具有较大分子形状，随着电
解质( 盐) 的增加，分子形状会逐渐变小，因为凝胶
柱的分子筛作用是按分子大小出峰，而不是按相对
分子质量大小被洗脱出来。由于激光信号强弱与样
品浓度及相对分子质量有直接关系，而 4 个组分配
制的浓度相等，因此，由 90 度角激光峰色谱图可见，
HPS-3-A相对分子质量最小，HPS-3-D 的相对分子
质量分布最宽。
HPS-3 中 4 个组分的相对分子质量分布见图 3，
分子特征参数见表 1。其中，HPS-3-D 相对分子质
量分布范围最大，HPS-3-A 的重均相对分子质量
( Mw) 最小，HPS-3-C 的 Mw 最大，HPS-3-D 的多分
散系数 Mw /Mn为 2. 543，处于 2 ～ 3，属于中等分布
宽度样品; 而其他三者多分散系数均接近于 1，属于
窄分布样品，当 Mw /Mn 为 1 时，则认为样品的相对
分子质量分布是均一的。
1. HPS-3-A; 2. HPS-3-B; 3. HPS-3-C; 4. HPS-3-D。
图 3 HPS-3 中 4 个组分的相对分子质量分布
Fig. 3 Molar mass distribution of four components in HPS-3
HPS-3 中 4 个组分均方根旋转半径 ( Rg) 分布
见图 4，四者 Rg随着洗脱体积增加均有逐渐变小的
趋势，说明分子形状逐渐减小。由表 1 可知，四者的
Rg都较小，其中，HPS-3-A 的 Rg 最大 ( 55. 5 nm) ，
HPS-3-B，HPS-3-C，HPS-3-D 三者相差不大，与 Mw
大小顺序是不一致的，这是由于 HPS-3-B，HPS-3-C，
HPS-3-D在电解质( 盐) 溶液中分子形状发生皱缩而
引起分子大小降低造成的。一般来说，MALLS 准确
测定样品 Rg 的范围为 10 ～ 500 nm，而 HPS-3-B，
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表 1 HPS-3 中 4 个组分的分子特征参数
Table 1 Molecular parameters of the four components in HPS-3
样品
重均分子量
/ g·mol － 1
数均分子量
/ g·mol － 1
多分散系数
( Mw /Mn)
均方根旋转半径
/nm
HPS-3-A 1. 223 × 104 ( 5) 1. 085 × 104 ( 3) 1. 127( 6) 55. 5( 5)
HPS-3-B 1. 113 × 105 ( 3) 1. 101 × 105 ( 5) 1. 101( 5) 15. 0( 15)
HPS-3-C 1. 986 × 105 ( 0. 6) 1. 611 × 105 ( 1) 1. 232( 1) 12. 2( 13)
HPS-3-D 8. 457 × 104 ( 0. 8) 3. 326 × 104 ( 3) 2. 543( 3) 13. 3( 12)
注:括号内为 RSD( % ) ，由统计软件得出。
HPS-3-C，HPS-3-D的 Rg均接近于其测定范围下限，
从而造成较大的测量误差。
1. HPS-3-A; 2. HPS-3-B; 3. HPS-3-C; 4. HPS-3-D。
图 4 HPS-3 中 4 个组分的均方根旋转半径分布
Fig. 4 Distribution of mean square radius of gyration of the four
components in HPS-3
当斜率为 1 时，表示高分子在溶液中是棒状排
列，当斜率为 0. 4 ～ 0. 6 时则表示高分子在溶液中呈
线性无规则线团，斜率约为 0. 33 时则表示为球状形
态［18］。由 Astra处理软件计算，结果见图 5，HPS-3-
A斜率 0. 35 ± 0. 01，在流动相溶液中为球形结构;
HPS-3-C斜率 0. 66 ± 0. 15，为无规则线团构象的线
性聚合物; HPS-3-B和 HPS-3-D的 Rg 对 Mw 作图线
性关系较差，两者类似 U 型曲线，表明两者为典型
的高枝化度结构，而且，HPS-3-D 的枝化程度比
HPS-3-B更高，这是因为对于相同相对分子质量的
多糖线形与枝化分子，枝化分子的旋转半径要更大，
从而造成曲线弯折成 U型。
3. 4 4 个组分分枝状况的化学分析结果
由甲基化结果可知，HPS-3-A 主要存在 3 种连
接方式( 1→，1→4，1→4，6，摩尔比例为 1∶ 8 ∶ 1 ) ，非
还原性末端( 1→) 的比例明显低于其他残基，因此
枝化程度较低; HPS-3-C 主要存在 4 种连接方式
图 5 HPS-3 中 4 个组分的 Rg与 Mw之间的关系
Fig. 5 Rg-Mw relationships of four components in HPS-3
( 1→，1→3，1→4，1→3，5，摩尔比例为 2 ∶ 4 ∶ 4 ∶
2 ) ，其枝化程度也不高，但较 HPS-3-A 高 ; HPS-3-
B 主要存在 4 种连接方式 ( 1→，1→6，1→4，1→
4，6，摩尔比例为 4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 2 ) ，非还原性末端的比
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例高于其他残基，枝化程度较高 ; HPS-3-D 主要
存在 5 种连接方式( 1→，1→4，1→3，1→4，6，1→
3，5，摩尔比例为 6 ∶ 4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 2 ) ，非还原性末端的
比例明显高于于其他残基，枝化程度很高，为 4
个组分中最高，这与 GPC-MALLS 联用技术分析
的结果是一致的。
4 结论
采用 GPC-MALLS联用技术，对红芪多糖 HPS-3
中分离纯化出来的 4 个组分的相对分子质量及分
布，分子均方根旋转半径及分布等进行了测定，进而
对 4 个组分在溶液状态的构象进行了研究，这些为
更深一步对红芪多糖 HPS-3 中 4 个组分的构效关系
研究提供必要数据。多糖组分 HPS-3-A 在水和盐
溶液中分子大小基本没有改变，而其他三者作为多
糖蛋白质或多肽复合物，在不同浓度盐溶液中，分子
形状则发生较大改变。
当然，影响红芪多糖 HPS-3 中 4 个组分的分子
特征的因素还有很多，如溶液类别及 pH，糖复合物
中蛋白质或多肽种类及含量等，以及这些因素与 4
个组分分子特征可能存在的关系，这些均有待于进
一步研究。
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Study on molecular characteristics of four components contained
in Hedysari Radix polysaccharide by gel permeation chromatography
-multi angle laser light scatting technology( GPC-MALLS)
CHEN Tongqiang1，ADILBEKOV J1，3，WANG Juan1，SHEN Xiaoli1，SHI Yikai1，HU Fangdi1，FENG Shilan1，2*
( 1. School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;
2. Gansu Province Key Laboratory of Preclinical Study for New Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China;
3. Tashkent Pharmaceutical Institute，Tashkent 100015，Uzbekistan)
［Abstract］ Objective: To determine such molecular characteristic parameters as absolute molecular weight，molecular weight
distribution，root-mean-square turning radius ( Rg ) and polydispersity index ( Mw/Mn) of four components contained in Hedysari Ra-
dix polysaccharide 3 ( HPS-3) and map weight-average molecular weight ( Mw) with root-mean-square turning radius ( Rg ) ，in order to
calculate conformations of the four components at solution state. Method: The gel permeation chromatography-multi angle laser light
scatting ( GPC-MALLS) was adopted，with 0. 1 mol·L －1 NaNO3 contained 0. 02% NaN3 as the mobilephase，Ultrahydrogel
TM 1000
connected in series with UltrahydrogelTM500. Result: Among the four components of HPS-3，HPS-3-C showed the highest weight aver-
age molecular weight of 1. 986 × 105 g·mol －1，followed by HPS-3-B 1. 113 × 105 g·mol －1 and HPS-3-D 8. 457 × 104 g·mol －1，
HPS-3-A showed the lowest weight average molecular weight of 1. 223 × 104 g·mol －1 but the highest square radius of gyration，that is
55. 5 nm. HPS-3-D had the widest range of molecular weight distribution in four components，with the polydispersity index ( Mw/Mn)
of 2. 543. In the mobile phase，HPS-3-A was globular structure，HPS-3-C was random coil ，HPS-3-B and HPS-3-D were both highly
branched structure. Conclusion: The results provided necessary basis for further studies on molecular characteristics of the four compo-
nents contained in HPS-3 and their relationship with bioactivity.
［Key words］ Hedysari Radix polysaccharide; gel permeation chromatography; multi angle laser light scattering; molecular
characteristics
doi: 10. 4268 /cjcmm20121222
［责任编辑 孔晶晶］
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