全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 24期 2015年 12月

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百里醌抑制卵巢癌生长及其机制研究
龚建明，王 晓，吴 洁，黄引平
温州医科大学附属第一医院 妇产科，浙江 温州 325000
摘 要：目的 研究百里醌对卵巢癌生长的影响及其作用机制。方法 百里醌作用卵巢癌细胞株 SKOV3后，CCK-8法检测
细胞增殖；ELISA法检测细胞凋亡；荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）水平；Western blotting检测胞核蛋白 Nrf2、胞浆
蛋白 Keap1、Akt、p-Akt、NQO1、GCLC的表达；实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测细胞中 NQO1和 GCLC mRNA水平。
制备裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，观察百里醌对肿瘤生长的影响；免疫组化检测肿瘤组织 Nrf2、NQO1 和 GCLC 的阳性表
达。结果 与对照组比较，百里醌明显抑制 SKOV3 细胞生长（P＜0.05、0.01），并诱导细胞凋亡（P＜0.01）；升高细胞内
ROS水平（P＜0.05）；下调胞核 Nrf2蛋白及胞浆 p-Akt蛋白表达（P＜0.05），上调 Keap1蛋白表达（P＜0.001）；下调 NQO1、
GCLC的 mRNA和蛋白表达（P＜0.05、0.01）。百里醌抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的生长（P＜0.01），降低肿瘤组织中 Nrf2、
NQO1、GCLC的阳性表达（P＜0.05、0.01）。结论 百里醌抑制卵巢癌生长，其机制可能是抑制胞核 Nrf2蛋白表达，促进
癌细胞内 ROS的产生，诱导细胞凋亡。
关键词：百里醌；卵巢癌；Nrf2；NQO1；GCLC；Keap1
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)24 - 3717 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.24.018
Inhibition of thymoquinone on tumor growth of ovarian cancer and its mechanism
GONG Jian-ming, WANG Xiao, WU Jie, HUANG Yin-ping
Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China
Abstract: Objective To study the effect and mechanism of thymoquinone in the growth inhibition of ovarian cancer. Methods After
ovarian cancer cells SKOV3 were treated with thymoquinone, cell growth was observed by the CCK-8 assay and apoptosis was
evaluated by ELISA. ROS in SKOV3 cells was detected by fluorescent probe. The expression of Keap1 protein, nuclear Nrf2 protein,
P-Akt protein, Akt protein, NQO1 protein, and GCLC protein in SKOV3 cells was analyzed by Western blotting assay. NQO1 and
GCLC mRNA were analyzed by RT-PCR. SKOV3 cells were injected into nude mice to establish engrafted tumor model.
Immunohistochemistry was used to detect the positive expression of NQO1, GCLC, and Nrf2 in the ovarian tumors. Results
Compared with the control group, thymoquinone significantly inhibited the proliferation of SKOV3 cells and increased the apoptosis
(P < 0.05, 0.01). Thymoquinone could lessen the expression of nuclear Nrf2 protein and P-Akt protein (P < 0.05), but significantly
increase the expression of Keap1 protein (P < 0.001). Protein and mRNA expression of NQO1 and GCLC in SKOV3 cells treaded by
thymoquinone, were lower than those in the control group (P < 0.05, 0.01). The positive expression of NQO1, GCLC, and Nrf2 was
also decreased in ovarian tumors after treatment of thymoquinone (P < 0.05, 0.01). Conclusion Thymoquinone could inhibit the
proliferation of ovarian cancer cells by inhibiting the expression of nuclear Nrf2, increasing the generation of ROS in ovarian cancer
cells to promote apoptosis.
Key words: thymoquinone; ovarian cancer; Nrf2; NQO1; GCLC; Keap1

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发
病率仅次于宫颈癌，死亡率占各类妇科肿瘤的首位，
严重威胁着女性的身体健康和生命安全。手术及化疗
可治愈大多数卵巢癌初期患者，但临床上出现耐药的
患者日益增多，晚期患者死亡率依然很高。故寻找有
效的抗卵巢癌的药物成为热点课题之一[1]。
随着植物化学技术的进步，传统医药的化学成
分及功效逐渐被发现。黑种草 Nigella damascene L.

收稿日期：2015-06-11
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81070510）
作者简介：龚建明，男，医师，硕士，从事妇科肿瘤及围产医学研究。E-mail: jamydoctor@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 24期 2015年 12月

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主要分布于我国新疆及中东、中亚等地中海沿岸国
家，全草均可入药，其种子含油高达 30%。近年研
究表明黑种草籽具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调
血脂、保肝等多种药理活性[2]。百里醌是黑种草籽油
中分离得到的主要有效物质，具有清除羟自由基和
活性氧自由基的能力，以及强大的抗肿瘤效应，可
抑制多种恶性肿瘤细胞生长和转移[3-5]。但其抗肿瘤
机制尚未完全明确。本实验观察百里醌体内外对卵
巢癌生长的影响，并探讨其作用机制，为百里醌应
用于临床治疗卵巢癌提供实验基础。
1 材料
1.1 药品与试剂
百里醌，批号 H47007，质量分数 99%，购自
美国 Sigma公司，以无水乙醇配制成 2 mg/mL母液，
临用时 RPMI 1640 培养基稀释成所需浓度；凋亡
ELISA、CCK-8、活性氧（ROS）试剂盒均购自南
京建成生物工程研究所；胎牛血清、RPMI 1640培
养基购自美国 Gibco公司；Nrf2、Keap1、Akt、p-Akt、
NQO1、GCLC 抗体购自美国 Sigma 公司；胞浆蛋
白、磷酸化蛋白提取试剂盒购自武汉博士德生物工
程有限公司。
1.2 动物
雌性 BALB/c裸鼠，8～10周龄，体质量 18～
20 g，购于中国科学院上海实验动物中心。动物合
格证号 SCXK（沪）2007-0005。
1.3 细胞
人卵巢癌细胞株 SKOV3 购自中国科学院上海
细胞库，培养在含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培养
液中，37 ℃、5% CO2培养箱下培养。细胞单层贴
壁生长，至 70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。
2 方法
2.1 CCK-8法检测细胞增殖
收集处于对数生长期的 SKOV3 细胞，制成单
细胞悬液，接种到 96 孔板，每孔 5×103个，过夜
贴壁后，分组如下：对照组，加入等量的 1%乙醇
溶液；百里醌 15、30、60、120 μmol/L组，加入相
应浓度的百里醌；每组 3 孔。设置空白孔，不加细
胞加入等量的 PBS。置 37 ℃培养箱 24 h，药物作用
结束前 1 h，各孔加入 CCK-8溶液 0.01 mL，继续培
养 1 h，使用酶标仪检测 450 nm波长处的吸光度（A）
值，计算细胞存活率［存活率＝(给药组 A值－空白
孔 A值)/(对照组 A值－空白孔 A值)］。
2.2 ELISA法检测细胞凋亡
实验分为 2 组：对照组，加入等量的 1%乙醇
溶液；百里醌组，加入 60 μmol/L百里醌。药物作
用 24 h，细胞凋亡检测按照试剂盒说明书进行。
2.3 细胞内 ROS的测定
细胞分组及药物处理同“2.2”项，收集各组细
胞，1 000 r/min离心 5 min，得细胞沉淀，避光条件
下加入适当体积稀释好的 2,7-二氢二氯荧光素二乙
酸酯（DCFH-DA），细胞培养箱内孵育 20 min，培
养液漂洗 3次，荧光酶标仪测定荧光强度。
2.4 Western blotting检测胞核蛋白Nrf2及胞浆蛋
白 Keap1、Akt、p-Akt、NQO1、GCLC的表达
细胞分组及药物处理同“2.2”项，收集各组细
胞，加入含 PMSF的细胞裂解液，提取上清液为细
胞总蛋白。按试剂盒说明书提取胞浆蛋白及磷酸化
蛋白。测量蛋白浓度后取等量蛋白样品上样，10%
SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封
闭后加入一抗 Nrf2、Keap1、Akt、p-Akt、NQO1、
GCLC，4 ℃过夜，再度洗膜后加入辣根过氧化物
酶标记的二抗，室温孵育 2 h，ECL显色，X线胶
片曝光，用软件 Quantity One分析条带灰度值。
2.5 RT-PCR检测 NQO1、GCLC基因表达
软件 Primer 3 设计特异性引物，序列见表 1。
Trizol法提取总 RNA，取 2 μL测定 260、280 nm处
A值，A260/A280值为 1.8～2.0，说明 RNA纯度较高。
应用实时荧光定量 PCR（RT-PCR）试剂盒进行逆转
录和 PCR。反应条件：95 ℃、1 min，60 ℃、1 min，
65 ℃、2 min，循环 40次。扩增产物在 1.5%琼脂糖
凝胶上电泳，以GAPDH作为内参，Bio-Rad Gel凝胶
图像分析系统扫描，分析目的基因相对表达水平。
表 1 NQO1、GCLC引物序列
Table 1 Primer sequences of NQO1 and GCLC
引物名称 正向引物 (5’-3’) 反向引物 (5’-3’)
NQO1 AGCCGTCATTTGTAAGTCCTG AATGCTTGATGATCTACTCTTC
GCLC AGGCCGATAATGAGGACTGGG CGACCTTATTCCACTTTGTACCT
GAPDH ACCAGCAAGCACAACCACGAG TTCGTCAATACAACCATGATGA
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 24期 2015年 12月

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2.6 裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型的制备
将 2×106个 SKOV3细胞悬浮于 0.2 mL培养基
中，注射到裸鼠腋下皮肤内建立卵巢癌皮下移植瘤
模型。接种 2周后，选择移植瘤直径约为 10 mm的
裸鼠，随机分为对照组和百里醌组，每组 8只（保
证每组至少 5只成功完成实验）。对照组 ig 1%无水
乙醇 0.2 mL；百里醌组，ig 给药剂量为 20 mg/kg
（根据预试验结果确定），每 2天给药 1次，给药 2
周；第 8周处死裸鼠，仔细剥离皮下移植瘤组织并
称质量，计算抑瘤率。
抑瘤率＝(对照组瘤质量－给药组瘤质量)/对照组瘤质量
2.7 免疫组化检测肿瘤组织中 Nrf2、NQO1 和
GCLC蛋白表达
取新鲜移植瘤组织，经 10%甲醛固定，石蜡包
埋，切片，脱蜡水化后，按照免疫组化试剂盒操作
步骤进行染色，在高倍镜下随机选择 20个视野，计
算镜下阳性细胞所占比例。
2.8 统计分析
实验结果均以 ±x s表示。应用 SPSS 16.0软
件，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方
差分析。
3 结果
3.1 对 SKOV3细胞增殖的影响
SKOV3细胞经浓度为 15、30、60、120 μmol/L
的百里醌作用 24 h 后，细胞存活率分别为
（85.2±4.4）%、（75.1±3.5）%、（54.1±2.0）%和
（34.1±2.7）%（n＝3），与对照组比较，差异均显
著（P＜0.05、0.01）。百里醌作用 24 h后 IC50为 61.4
μmol/L，因此选择 60 μmol/L进行后续实验。
3.2 对 SKOV3细胞凋亡的影响
60 μmol/L百里醌作用 SKOV3细胞 24 h后，
诱导细胞凋亡率为（13.7±1.1）%（n＝5），与对照
组凋亡率（3.8±0.6）%比较，差异显著（P＜0.01）。
3.3 对细胞内 ROS生成的影响
SKOV3细胞经百里醌作用 24 h后，细胞内DCF
密度值为（68.3±2.7，n＝5），与对照组（54.9±4.4）
比较，差异显著（P＜0.05）。
3.4 对胞核 Nrf2蛋白及胞浆 Keap1、p-Akt、Akt
蛋白表达的影响
与对照组比较，百里醌组胞核 Nrf2蛋白、胞浆
p-Akt蛋白表达率显著下调（P＜0.05）；Akt蛋白表
达无显著差异（P＞0.05）；Keap1 蛋白表达显著上
调（P＜0.001）。结果见图 1。
3.5 对NQO1和GCLC mRNA和蛋白表达的影响
与对照组比较，百里醌组 NQO1、GCLC mRNA
和蛋白表达均下调，差异显著（P＜0.05、0.01）。
结果见图 2、3。




与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01, 下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group, same as below
图 1 百里醌对 SKOV3 细胞胞核蛋白 Nrf2 及胞浆蛋白
Keap1、p-Akt、Akt表达的影响 ( x±s, n = 5)
Fig. 1 Effect of thymoquinone on protein expression of
nuclear Nrf2 as well as Keap1, p-Akt, and Akt in SKOV3
cells ( x±s, n = 5)

图 2 百里醌对 SKOV3细胞中 NQO1和 GCLC mRNA表
达的影响 ( x±s, n = 5)
Fig. 2 Effect of thymoquinone on expression of NQO1 and
GCLC mRNA in SKOV3 cells ( x±s, n = 5)

图 3 百里醌对 SKOV3 细胞中 NQO1 和 GCLC 蛋白表达
的影响 ( x±s, n = 5)
Fig. 3 Effect of thymoquinone on expression of NQO1 and
GCLC proteins in SKOV3 cells ( x±s, n = 5)
核 Nrf2
总 Nrf2
β-actin
对照 百里醌
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
对照 百里醌
对照 百里醌
核
N
rf2
/总
N
rf2

对照
百里醌

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
p-Akt Akt Keap1
p-Akt
Akt
Keap1
β-actin
蛋
白
相
对
表
达
水
平

对照 百里醌
对照
百里醌

NQO1
GCLC
GAPDH
NQO1 GCLC
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
R
N
A
相
对
表
达
水
平

对照
百里醌

NQO1 GCLC
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
R
N
A
相
对
表
达
水
平

NQO1
GCLC
β-actin
对照 百里醌
*
*
**
*
*
*
**
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3.6 对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长的抑制作用
百里醌组平均肿瘤质量为（0.43±0.06）g，与
对照组［（0.79±0.10）g］比较，瘤质量明显减轻
（P＜0.01），抑瘤率为 45.6%。
3.7 对肿瘤组织Nrf2、NQO1和GCLC表达的影响
免疫组化染色可见百里醌组肿瘤组织中 Nrf2、
NQO1和 GCLC阳性表达率分别为（28.5±2.9）%、
（27.0±3.4）%和（17.6±1.6）%，对照组中分别为
（36.9±3.9）%、（44.4±5.0）%和（31.4±3.8）%；
与对照组比较，百里醌组肿瘤组织中 Nrf2、NQO1
和 GCLC阳性表达率均下降，差异显著（P＜0.05、
0.01）。结果见图 4。



Nrf 2 NQO 1 GCLC
图 4 百里醌对肿瘤组织中 Nrf2、NQO1和 GCLC表达的影响 ( x±s, n = 5)
Fig. 4 Effect of thymoquinone on expression of Nrf2, NQO1, and GCLC in tumor tissue ( x±s, n = 5)
4 讨论
本实验结果表明，百里醌能抑制体外卵巢癌细
胞的生长，同时细胞凋亡检测表明百里醌能有效诱
导卵巢癌细胞凋亡。在体内移植瘤模型中，也观察
到百里醌明显抑制卵巢癌移植瘤生长。进一步研究
发现百里醌的抗肿瘤机制可能与其氧化应激相关。
氧化应激是体内的 ROS 超过了机体的抗氧化
防御机制的一种病理状态，为了减少 ROS对细胞的
损害，细胞内有一系列有效的抗氧化防御体系。
NQO1、GCLC 等抗氧化酶均能降低过氧化物的形
成，保护细胞膜结构和功能完整[6]。
NQO1酶属于 II相解毒酶，能够借助 NADH或
NADPH作为电子供体，催化醌类化合物的还原反应。
体内的醌类被还原有 2种方式：一种是单电子反应，
生成活泼的半醌类物质，进而产生大量 ROS，对细
胞造成氧化损伤；另一种是双电子还原反应，由 II
相解毒酶催化，醌类直接被还原成氢醌，氢醌稳定易
被排泄。NQO1酶能催化后一种反应，避免生成大量
的 ROS，从而保护细胞不被氧化损伤。
还原型谷胱甘肽（GSH）具有较强的抗氧化能
力，能使细胞免受各种有害物质（如氧化剂、亲电
子物质等）的损伤，通过谷胱甘肽过氧化物酶
（GSH-Px）的催化作用清除体内多余的氧自由基。γ-
谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是合成 GSH的限
速酶，其催化亚基 GCLC具有全酶活性。GCLC是
通过合成 GSH实现其抗氧化作用[7]。
本实验结果显示百里醌作用于卵巢癌 SKOV3
细胞后，细胞内 ROS 水平明显升高，而细胞内
NQO1、GCLC mRNA和蛋白水平均下降；免疫组
化结果显示百里醌能明显抑制抗氧化酶 NQO1、
GCLC 在体内肿瘤中的表达。百里醌使体内外卵巢
癌抗氧化酶的表达减少，使体内清除氧自由基的能
力下降，增加 ROS的产生，促进卵巢癌细胞的凋亡。
Nrf2 属于 CNC 转录因子家庭成员，是参与细
胞内抗氧化应激反应的一种重要转录因子。Nrf2包
括 6 个功能域，分别命名为 Neh1～Neh6，正常情
况下，Nrf2主要定位于细胞质内，活性由负性调节
蛋白 Keap1调控。Nrf2包括 2个重要的保守区域，
对照



百里醌
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与 Keap1相互作用后被固定于细胞质中的位点上，
同时可被 Keap1通过泛素化迅速降解[8-10]。
当细胞受到激活剂的信号攻击后，激活 PI3k/Akt
途径，使位于细胞质的 Akt 转移到细胞膜上获得催
化，Akt通过蛋白激酶对其 Ser473和 Thr308磷酸化
而被激活[11-12]。p-Akt可使下游靶基因产物 Nrf2磷酸
化，活化的Nrf2从Keap1中解离，易位进入细胞核，
与小 Maf 蛋白等结合成异二聚体，识别抗氧化反应
元件 ARE，从而激活多种抗氧化基因和 II相酶基因
的转录，如 NQO1、GCLC、SOD 等[13]。这些酶直
接和间接地参与 ROS的清除，增加GSH和NADPH
的合成，还可以加速致癌物的排除。
本实验结果表明，与对照组相比，百里醌组胞
核 Nrf2蛋白表达明显减少，而 Keap1蛋白表达显著
增加。这表明百里醌干预后 SKOV3细胞内 Nrf2在
核内表达减少，可能是由于 Keap1蛋白表达增加，
加强了对 Nrf2的结合抑制，并通过泛素化促进其降
解。本实验同时发现，与对照组相比，百里醌组 p-Akt
蛋白表达亦减少，这表明百里醌可能同时通过抑制
Akt的磷酸化，来减少 Nrf2的活化。进而减少抗氧
化酶 NQO1、GCLC 等在体内的表达，使肿瘤体内
氧化与抗氧化失衡，产生大量的 ROS，促进肿瘤细
胞凋亡。
综上所述，百里醌可能通过促进 Keap1蛋白表
达、抑制 Akt磷酸化、进而抑制 Nrf2核转位，减少
多种抗氧化酶和 II相酶的表达，促进卵巢癌细胞内
ROS水平增加，诱导凋亡。
参考文献
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