全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 8期 2014年 4月

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• 药材与资源 •
地黄 microRNAs 和靶基因的生物信息学预测及验证
赵春丽 1, 2，李先恩 2，都晓伟 1*，孙 鹏 2*
1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193
摘 要：目的 拟利用地黄 Rehmannia glutinosa EST数据通过生物信息学手段预测新的地黄 microRNAs（miRNA），为
今后地黄 miRNA的生物学研究奠定基础。方法 根据 miRNA 家族在不同物种中的保守性，将 miRBase数据库中的已
知植物 miRNA 与通过高通量测序获得的 93 172 条地黄 EST 序列进行同源比对，按照 miRNA 前体应具备的标准进行
筛选。结果 预测到分属于 8个家族的 8条潜在地黄 miRNA序列，并通过实时荧光定量 PCR对 8条预测的 miRNA进
行了检测，证实 8条 miRNA在地黄中真实存在。随后利用软件对 8条地黄 miRNA的靶基因进行预测，发现其靶基因
主要编码与地黄生长发育、代谢以及胁迫响应等过程相关的蛋白。结论 新预测的地黄 miRNA及其靶基因为今后研究
它们在地黄中的生物学功能奠定了基础。
关键词：地黄；microRNA；靶基因；生物信息学；PCR检测
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)08 - 1129 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08.017
Bioinformatic prediction and validation of conserved microRNAs and their target
genes in Rehmannia glutinosa
ZHAO Chun-li1, 2, LI Xian-en2, DU Xiao-wei1, SUN Peng2
1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
Abstract: Objective In order to establish the material basis for future studies on the biological function of miRNAs, we
aimed to predict novel miRNAs from EST sequences of Rehmannia glutinosa by using bioinformatic strategies. Methods
Since most of the plant miRNAs were conserved in plant species, all plant miRNAs deposited in miRNase were aligned to the
93 172 EST sequences generated by next generation high-throughput RNA sequencing technology and the putative miRNA
precursors were screened according to serious criteria. Results Eight novel rehmannia miRNAs were identified which
belonged to eight different families that were further validated by real-time PCR analysis. Then the eight rehmannia miRNAs
were subjected to target prediction analysis, and the results showed that the target genes encoded the proteins related to root
growth, metabolism, stress responses and other processes. Conclusion The miRNAs and their target genes identified in this
study will provide clues to their biological functions in R. glutinosa.
Key words: Rehmannia glutinosa Libosch; microRNA; target gene; bioinformatics; PCR detection

地黄 Rehmannia glutinosa Libosch 为玄参科
（Scrophulariaceae）地黄属 Rehmannia Libosch. ex
Fisch. et Mey多年生草本植物，是著名的“四大怀药”
之一，具有滋阴清热、补血止血等功效。地黄应用
广泛，为多种方剂配伍要药及中成药的主要原料。
miRNA是一类在真核生物中发现的长度为 21 nt

收稿日期：2013-11-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30901969）
作者简介：赵春丽（1986—），女，硕士研究生，研究方向为药用植物分子生物学。Tel: 13121897466 E-mail: chunli_x2@sina.com
*通信作者 都晓伟 Tel: (0451)87267031 E-mail: duxiaowei@hljucm.net
孙 鹏 Tel: (010)62810019 E-mail: psun@implad.ac.cn
网络出版时间: 2014-03-17 网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/doi/10.7501/j.issn.0253-2670.2014.08..html
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左右的单链小分子 RNA。miRNA 通过与靶基因的
特异性碱基互补配对，从而降解靶基因或抑制其翻
译，在转录后水平对动植物的基因表达进行调控[1]。
miRNA参与一系列真核细胞的基因表达调控，在植
物中，对植物器官的形态建成、生长发育、逆境胁
迫的应答、次生代谢等都具有重要的调控作用[2]。
miRNA在植物体内的表达具有组织和时期特异性，
并且在进化上有很高的保守性[3-5]。
近年来，随着 miRNA 研究范围的扩大和深
入，miRBase 数据库（http://www.mirbase.org/）
中的 miRNA 数量不断增多，一些药用植物如红
豆杉、白木香、人参、地黄等也开展了 miRNA
研究，Yang等[6]利用高通量测序技术分析、鉴定
与地黄连作障碍相关的 miRNA，发现一些与转
录、信号转导、块根发育相关的 miRNA 可能与
地黄连作障碍的形成相关。与模式植物拟南芥、
水稻等已鉴定的 miRNA 数量相比，目前已鉴定
的地黄 miRNA 数量有限，在 miRBase数据库中
仅登录了 13条地黄 miRNA序列。虽然高通量测
序仍是目前鉴定 miRNA 的最直接手段，但利用
本物种 EST序列预测新的 miRNA序列则更加经
济、快捷，可以有效地扩充本物种的 miRNA 数
量，被广泛用于植物 miRNA的鉴定[7-9]。课题组
前期转录组测序工作的完成，为地黄 miRNA 及
其靶基因的生物信息学预测奠定了良好的基础。
本研究根据植物 miRNA 进化上的高度保守性，
以已知的植物 miRNA 为探针，与高通量测序获
得的地黄 EST 进行序列比对，预测新的地黄
miRNA，为扩展地黄 miRNA 的研究范围奠定研
究基础。
1 材料
地黄 Rehmannia glutinosa Libosch种植于中国
医学科学院北京协和医学院药用植物研究所试验
田，经中国医学科学院北京协和医学院药用植物研
究所李先恩研究员鉴定为地黄栽培种 85-5。
2 方法
2.1 参考 miRNA 序列的选择
本研究首先从 miRNA 数据库 miRBase中下载
了拟南芥、大豆、水稻、玉米等 71种植物（不含地
黄）的 7 385条 miRNA。随后，为避免 miRNA数
据的冗余，本研究剔除了不同物种 miRNA 之间的
重复序列，剩余的 miRNA 序列进入下一步分析，
作为预测地黄保守 miRNA的参照序列。
2.2 地黄 miRNA 的生物信息学预测流程
将无重复的植物 miRNA序列与 93 172条地黄
EST进行序列同源比对，筛选出少于等于 3个碱基
错配的同源 EST 序列，比对上的 EST 再经自身比
对 去 除 冗 余 序 列 后 ， 用 Mfold 3.2 软 件
（http://www.bioinfo.rpi.edu/ applications/mfold/rna/
form1.cgi）预测候选 miRNA前体序列的二级结构，
并分析其结构稳定性[10]。
2.3 二级结构筛选标准
地黄 miRNA 的生物信息学预测参照 Zhang 等
[11]的方法，具体筛选标准如下：（1）新预测的地黄
miRNA序列与已知的miRNA序列碱基错配数小于
4；（2）新预测的地黄 miRNA 前体能够折叠成发夹
状的二级结构，并且其成熟的 miRNA 与相同家族
已知的 miRNA位于前体发夹结构的相同臂上；（3）
成熟的 miRNA 与另一条臂上的互补序列有不超过
5 个的错配碱基；（4）成熟的 miRNA 与另一条臂
上的互补序列不允许有缺口或者较大的环；（5）
miRNA 前体要有绝对值较高的最小折叠自由能
（Minimal folding free energy, MFE）和较高的最小折
叠自由能系数（minimal folding free energy index,
MFEI）；（6）miRNA中 A＋U量在 30%～70%。
2.4 miRNA 的荧光定量 PCR 检测
用 Trizol 试剂（Invitrogen, USA）提取各组织
的总 RNA，具体方法参照说明书。分别提取地黄的
根、茎、叶、花 4个不同组织的总 RNA，Nano DropTM
2000分光光度计（Thermo Fisher, USA）检测总 RNA
的浓度和纯度，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的
完整性，总 RNA于−80 ℃贮存备用。
miRNA 在地黄组织的表达检测采用实时荧光定
量 PCR方法：首先在miRNA的 3’末端做多聚腺苷酸
化处理，然后用含接头的引物进行第一链反转录，最
后用荧光定量 PCR 检测 miRNA 的表达情况。其中
miRNA3’末端polyA处理和第一链cDNA合成均采用
miRcute miRNA cDNA 第 一 链 合 成 试 剂 盒
（TIANGEN）。荧光定量 PCR反应在CFX—1000型荧
光定量 PCR 仪上（Bio-Rad）运行，按照 miRcute
miRNA荧光定量检测试剂盒（TIANGEN）说明步骤
冰上配制反应体系：miRcute miRNA Premix（2×）
10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR
Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，DNA模板 2.5 μL，
ddH2O（灭菌蒸馏水）补足至 20 μL，设置温度梯度
摸索 PCR最佳退火温度，最终确定反应条件为 95 ℃
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预变性 2 min，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸 1 min，
40个循环，延伸阶段收集信号，从 60 ℃ 到 95 ℃，
每个循环增加 0.5 ℃，持续 0.05 s获得解链温度，采
集融解曲线荧光信号。反应结束后确认 Real Time
PCR的扩增曲线和溶解曲线，记录Ct值。
2.5 地黄 miRNA 靶基因的生物信息学预测
由于植物 miRNA 与其靶基因具有高度的序列
互补性，科研人员根据这一特点开发了多款植物
miRNA 靶基因预测软件，本实验以地黄 EST 序列
为参照序列，采用当前运用较多的 psRNATarget软
件（http://www. plantgrn.org/psRNATarget/）进行在
线靶基因预测，运行参数设置为默认。psRNATarget
通过罚分机制筛选潜在靶基因，每个 G∶U摆动配
对、碱基插入或缺失分别罚 0.5、1、2分，在 miRNA
5’端第 2～7 bp发生除 G∶U 外的碱基错配罚分为
1，总得分≤3的基因为 miRNA的潜在靶基因[12]。
根据靶基因的功能注释，分析 miRNA 在地黄中的
功能作用。
3 结果与分析
3.1 预测到的地黄 miRNA 序列及其二级结构
从 miRBase（V 20.0）数据库下载的 71种植物
共计 7 385条miRNA经去冗余后得到 3 956条唯一
的 miRNA序列，以此为探针与地黄 EST序列进行
BLASTN比对分析，筛选出 237条候选 miRNA前
体序列，其中能够用Mfold折叠形成茎环结构，并
符合相应筛选标准的共有 8条。最终成功预测到的
8条地黄 miRNA，分别属于 8个不同的 miRNA家
族（表 1）。
表 1 地黄中新发现的 miRNA 及其序列特征
Table 1 Novel miRNAs predicted from R. glutinosa and their sequence signatures
miRNA miRNA序列 (5’-3’) Gene ID 定位 LM LP (A＋U) / % MFE / (kJ·mol−1) MFEI
miR168 UAGCUUGGUGCAGCUCGGGA 4 495 3’ 20 109 45.87 196.36 0.79
miR172 UGAGAAUCUUGAUGAUGCUGCAU 40 783 5’ 23 69 63.77 75.78 0.72
miR396 UUCAAGAAAGCUGUAGGAAAA 92 675 5’ 21 110 66.36 172.50 1.11
miR397 UUGAGUGCAGCGUUGAUGAU 35 712 3’ 20 65 52.31 56.94 0.44
miR472 UGGUCGAAGUAGGCUA AAUC 8 171 3’ 20 51 47.06 65.73 0.58
miR2218 UUGCCUGCUUGCCGAUUCCU 92 228 5’ 20 83 51.81 149.89 0.90
miR5290 AUUUGGAGAGAGAAAGACACAU 73 579 5’ 22 62 62.90 149.05 1.55
miR6111 CUUUAUGUCACG AUGGAUGAC 46 017 3’ 21 60 45.00 98.81 0.72
定位-成熟 miRNA在前体中的定位 LM-成熟 miRNA的长度 LP-前体序列的长度 MFE-最小折叠自由能 MFEI-最小折叠自由能系数
Location-location of mature miRNA in precursor LM-length of mature miRNA LP-length of precursor MFE-minimal folding free energies, unit is
MFEI-minimal folding free energy index
在地黄中预测到的 8 条成熟 miRNA 的长度为
20～23 bp，其中有一半为 20 bp。通常情况下，大
多数动物 miRNA前体长度为 70～100 bp，其二级
结构也相对保守[13]；而植物 miRNA 前体在长度和
二级结构上则存在多样性[14]。由表 1可以看出，新
预测的地黄 miRNA 前体的长度变化相对较大，在
51～110 bp；虽然地黄 miRNA前体的长度和二级结
构变化很大，但都能折叠成茎环结构（图 1）。8条
成熟 miRNA有 4条位于前体的 3’端，4条位于前体
的 5’端，该比例与在其他植物中的报道类似[15-16]。
在新预测的 8条地黄 miRNA中，地黄 miRNA
前体的 A＋U量在 45.0%～67.0%，MFE在 56.94～
196.36 kJ/mol，平均值为 120.62 kJ/mol；其 MFEI
为 0.44～1.55，平均值为 0.85（表 1），均符合 miRNA
二级结构稳定性要求。
3.2 新预测地黄 miRNA 的荧光定量 PCR 验证
为了验证新预测的 miRNA 在地黄中的真实
性，根据 8条 miRNA序列设计引物，用实时定量
PCR对地黄 miRNA进行检测，荧光定量融解曲线
显示各 miRNA扩增产物为单峰，PCR产物琼脂糖
凝胶电泳显示片段大小约 100 bp，表明 8条miRNA
在地黄中真实存在。Ct值与表达值的关系为 Ct值
越小，表达值越高。8 个 miRNA 在地黄中均有表
达，其中 miR472和 miR6111在 4个组织中的表达
差异不大；其余 6条 miRNA的表达呈现组织特异
性，其中 miR168 和 miR5290 的 Ct值在根、茎、
叶、花中依次降低，说明其表达值呈逐渐升高的趋
势；miR396和 miR172在叶、花中高表达；miR397
在花中表达值高；miR2218在茎、花中表达值高。
结果见图 2。
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miR168 miR172

A A - UG U C---- AAA
UG GAAUC U A GAUGCUG AUUGGC U
AC UUUAG A U UUGCGAC UAAUCG A
G A U GU U AUAUA GCC
miR396 miR397

C U -- C UU U- --- U
GUCGU GAG UG AGCG GA GAU UCU A
CGGUA CUC GC UCGU CU CUG GGA G
A U CA - UC UU UAU U
miR472 miR2218
C GU UA A- CG
UCGUG CGAAG GGCU AAU U
AGCAC GCUUU UCGA UUG C
A -- GC GG UG
GA A U- UA UACUCUUAGAUCU
GGAA UGGGAGG UUGGCAAGC GC \
CCUU ACCCUCC AGCCGUUCG CG C
CA - UU UC UUUUUAAACACCA
miR5290 miR6111
G AU A
CAUUUGGAGAGAGAAA ACACAUGU GU U
GUAAACCUCUCUCUUU UGUGUACA UA A
A CG G
G -- - C A AUG
GCG GUCCAU GUGGCGU GAGU GU \
CGC UAGGUA CACUGUA UUCA CA U
G AG G U G GGU
黑色加粗为成熟 miRNA序列
Black mark for mature miRNA sequences
图 1 新预测地黄 miRNA 前体的二级结构图
Fig. 1 New prediction on second structures of pre-miRNA from R. glutinosa

图 2 新预测的地黄 miRNA 在根、茎、叶、花中的表达情况
Fig. 2 Expression of new predicted miRNAs from
R. glutinosa in roots, stems, leaves, and
flowers of R. glutinosa
3.3 地黄 miRNA 靶基因的预测及主要功能分析
根据新鉴定的 8条地黄 miRNA序列，通过在线
软件 psRNATarget对其靶基因进行了预测，8条地黄
miRNA 共预测到 51 个靶基因，其中有 34个靶基因
有功能注释，这些靶基因分别编码转录调控因子、信
号转导、细胞骨架、代谢等相关蛋白见表 2。
4 讨论
miRNA作为一种新发现的非编码基因表达调控
因子，在真核生物的基因表达调控中起到十分重要
的作用，参与了调控植物器官的形态建成、生长发
育、信号转导、激素合成和对逆境因子的应答[17-18]。
除此之外，研究人员还发现 miRNA 影响植物次生
代谢产物的生物合成。如拟南芥中的 miR828 参与
调控黄酮类化合物等次生代谢产物的合成 [ 19 ]；
miR156 可靶向与次生代谢相关的 SPL 转录因子，
当上调 miR156 的表达时可促进拟南芥中花青素的
积累，下调 miR156 的表达时却会使植物体内黄酮
醇的积累量升高[20]。随着 miRNA 研究的扩大和深
入，植物 miRNA 的功能研究不再仅集中在模式植
物中，药用植物的 miRNA研究也越来越得到关注。
如 Hao等[21]发现红豆杉中的 miR164和 miR171可
直接靶向紫杉醇合成途径中的紫杉烷13α-羟基化酶
和紫杉二烯 2α-O-苯甲酰转移酶基因，参与调控紫
杉醇的生物合成。Wang 等[22]通过实验推测出掌叶
半夏中 miR166 作用的靶基因与叶的发育有关；
miR397的靶基因与氧化、干旱、营养等胁迫响应有
关；miR156作用的靶基因参与花的发育调控。陈新
建等[23]利用 Solexa 测序技术并结合生物信息学和
C - C U AUUA-- U UC AG
CAUG UUUUCC ACAGC UUUCUUGAACUUU UUU AUUUU UCCUU A
GUAC AAAAGG UGUCG AAAGAACUUGAAG AAG UAAAA AGGGA A
A G A - AAGACG U CU GA
A U UG UCU AG --- - G UU UG AC
GCCAGCUCCUGA UUG UC GC GCC UC CCAUAU GA UGGU AG G
UGGUCGAGGGCU GAC GG CG UGG AG GGUAUA UU ACCG UC A
G C GU UU- A- GUA A G C- -- CA

miR172
miR168
miR396
miR397
miR472
miR2218
miR5290
miR6111
40
35
30
25
20
15
10
C
t值

根 茎 叶 花
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表 2 地黄中新预测 miRNA 的靶基因及其编码蛋白
Table 2 Target genes of new predicted miRNA and their encoding proteins in R. glutinosa
miRNA 靶基因 靶蛋白 抑制作用
miR168 Unigene4495_RNA AGO1-2 分裂
Unigene10361_RNA 光敏素 B 分裂
Unigene192_RNA 生长素响应因子 1 分裂
miR172 Unigene67738_RNA AP2结构域的转录因子 分裂
Unigene14104_RNA poly(A)-mRNA 结合蛋白 翻译
Unigene867_RNA 生长素响应家族蛋白 分裂
Unigene58139_RNA 蛋白质结合蛋白 分裂
Unigene22164_RNA 核基质成分蛋白 1 分裂
Unigene18719_RNA F-box蛋白 分裂
Unigene78641_RNA 假设蛋白 分裂
miR396 Unigene24520_RNA 微管蛋白的γ复合物相关蛋白 分裂
Unigene12013_RNA 钼喋呤硫酸化酶 分裂
Unigene32769_RNA Tic62蛋白质 分裂
miR397 Unigene35712_RNA LAC11 分裂
Unigene74397_RNA 漆酶 分裂
Unigene30375_RNA 邻二酚氧化酶 分裂
Unigene9352_RNA 假设蛋白 分裂
miR472 Unigene8171_RNA Jp18 分裂
miR2218 Unigene24988_RNA 假设蛋白 分裂
miR5290 Unigene56861_RNA GTP结合蛋白同系物 LepA 分裂
Unigene6899_RNA RNA识别含基序蛋白质 分裂
Unigene25368_RNA 3-酮脂酰辅酶 A硫解酶 2 分裂
Unigene6940_RNA 磷酸胆碱磷酸酶 1 分裂
Unigene23380_RNA ATP/ ADP转运质体 分裂
Unigene79963_RNA MMP37样蛋白 翻译
miR6111 Unigene46017_RNA 细胞分裂素调节激酶 1 分裂
Unigene80378_RNA S位点的凝集素蛋白激酶家族蛋白 分裂
Unigene39634_RNA 激酶家族蛋白 分裂
Unigene23626_RNA 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 分裂
Unigene19132_RNA 受体激酶受体 TRKb 分裂
Unigene17761_RNA ATP结合酶 分裂
Unigene66344_RNA 类受体蛋白激酶 2 分裂
Unigene39357_RNA 激酶家族蛋白 分裂
Unigene5363_RNA 激酶相互作用因子 1 分裂

荧光定量分析，在正茬和重茬地黄之间构建了
miRNAs差异表达谱，发现表达差异的 miRNA参
与了转录调控、信号传导、逆境生理等生物学过程，
这些miRNAs及其靶基因直接或间接地调控地黄根
系的生长发育，在 miRNAs介导的转录后基因表达
调控在连作障碍的形成过程中可能起到关键作用，
为通过miRNAs调控基因表达而引起地黄连作障碍
的分子机制提供了线索。因此，挖掘、鉴定药用植
物 miRNA 不仅能够解析植物次生代谢产物的生物
合成途径，对今后解决药用植物的生产栽培中的困
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难，培育有效成分量高、抗性好的中药材也具有重
要意义。
虽然高通量测序技术挖掘、鉴定 miRNA 是目
前最直接有效的手段，但利用生物信息学预测
miRNA 更加快速和经济。本研究利用地黄 EST 序
列鉴定了分属于 8个家族的 8个地黄miRNA序列，
并通过实时定量 PCR 对其在地黄组织中的表达情
况进行了检测，为进一步研究它们在地黄中的功能
奠定了基础。本研究还对 8 条地黄 miRNA 的靶基
因进行了预测，预测到了 51个靶基因，这些靶基因
参与到地黄生长发育、新陈代谢、应激反应等一系
列重要的进程。如 miR168 的靶基因分别靶向
AGO1-2蛋白、光敏色素 B、生长素响应因子 1。其
中 AGO1-2蛋白在植物中参与维持基因组的稳定、
调控组织发育、对逆境的适应性应答以及在 RNA
层面对入侵核酸产生免疫等一系列过程[24]。光敏色
素 B是一种植物自身合成的色素蛋白质，可以通过
对基因表达的调控调节光周期反应进而调节植物的
生长和开花[25]；并且对叶绿素的合成和发育具有调
控作用[26]。生长素响应因子 1（ARF1）是一种调控
生长素响应基因表达的转录因子，它可与生长素响
应元件特异结合，促进或抑制基因的表达 [27]。
miR397 的靶基因编码 LAC11、漆酶、邻二酚氧化
酶，均属于多酚氧化酶，多酚氧化酶作为一种氧化
还原酶在光合作用中发挥作用。如调节叶绿体中有
害的光氧化反应速度，参与其中电子传递；还可促
进伤口的愈合，也可增加植物对病原体的抗性[28]。
在预测的 51个把基因中，miRNA对其中的绝大多
数是通过切割降解方式进行表达调控。地黄在生产
栽培过程易受病毒病及连长障碍的影响，造成块根
产量的下降和品质的下滑，以上 miRNA 的鉴定为
研究他们在地黄块根发育中的作用和在逆境胁迫条
件下的作用机制提供有利条件。
今后随着药用植物 miRNA 研究的不断深入，
必将发现更多的地黄 miRNA 及其靶基因，对其基
因表达调控的认识也将越来越全面和准确，有望运
用miRNA基因工程技术用于改良地黄的遗传品质，
培育抗逆性好、有效成分量高的地黄新品种。
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