全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 7 期 2016 年 4 月

• 1187 •
杭菊 DFR 基因克隆及其在花中表达特征分析
陈 璐，汪 涛，郭巧生*，张晓明，宋玲珊
南京农业大学中药材研究所，江苏 南京 210095
摘 要：目的 克隆杭菊 Chrysanthemum morifolium 二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）基因，并研究其
在花芽分化期及开花期不同时期的表达特征。方法 根据已报道的菊花 Chrysanthemum morifolium DFR 基因序列设计引物，
通过荧光定量 PCR（RT-PCR）技术从杭菊头状花序中扩增出目的基因片段，连接、转化、挑取阳性克隆测序并拼接；采用
基于内参基因的相对定量 PCR 方法，分析该基因表达量特征。结果 得到全长 1 152 bp 的杭菊 DFR 基因，最大开放阅读框
1 029 bp，共编码 342 个氨基酸。NCBI 上进行 Blast 比对，该基因与其他植物的 DFR 基因有很高的同源性。RT-PCR 表明该
基因在花芽分化时期不同阶段以及开花期不同时期花不同部位中表达量均有差异。花芽分化时期杭菊 DFR 基因在 50 d 表达
量最高；开花期该基因在时期 I 的管状花中表达量最高，在时期 II 的花序托中表达量最低。结论 克隆得到杭菊 DFR 基因
cDNA 序列，该基因表达存在时间和空间上的差异，表达量在花蕾膨大成熟到舌状花开放 30%的时间段内最高。该结果为进
一步进行该基因在杭菊中的表达与催化产物的关系和调控机制研究奠定了基础。
关键词：杭菊；DFR 基因；实时定量 PCR；荧光定量 PCR；基因克隆
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)07 - 1187 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.07.021
Analysis on cloning of dihydroflavonol 4-reductase gene in capitulum of
Chrysanthemum morifolium cv. ‘Hangju’ and its expression characteristics
CHEN Lu, WANG Tao, GUO Qiao-sheng, ZHANG Xiao-ming, SONG Ling-shan
Institute of Chinese Medicinal Materials, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Objective To clone the dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene from the capitulum of Chrysanthemum morifolium and
study its expression at different stages of flower bud differentiation period, and in different periods of flowering in different tissues.
Methods Two pairs of primers were designed according to the reported DFR gene sequences of C. morifolium, target fragments were
amplified by RT-PCR, connected, and transformated, then positive cloning was detected by PCR and then sequenced. Results
Sequencing results showed that 1 152 bp sequence was acquired with the largest open reading frame of 1 029 bp, which encoded 342
amino acids. Blast comparison was carried out on NCBI. The gene had higher homology compared with the DFR from other species.
The sequence of DFR gene was cloned from C. morifolium. Quantitative PCR showed that the gene expressions were different at
different stages of flower bud differentiation period, and in different periods of flowering in different tissues. The highest expression of
DFR gene was at day 50 of stages of flower bud differentiation period; And in flowering the highest expression of DFR gene is in
tubular flowers in the period I and the lowest expression is in the receptacle in period II. Conclusion The DFR gene of C. morifolium
cv. ‘Hangju’ is cloned. The expression of DFR gene is different both in time and in space. The highest expression is in the period from
the buds mature to the capitulum open completely.
Key words: Chrysanthemum morifolium cv. ‘Hangju’; dihydroflavonol 4-reductase; RT-PCR; qPCR; gene cloning

菊花为菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium
Ramat. 的干燥头状花序，具有疏风清热、平肝名目、
清热解毒之功效[1-2]。杭菊 Chrysanthemum morifolium
Ramat. cv. ‘Hangju’ 是药用菊花的主要栽培类型之
一[3]，主要化学成分包括黄酮类、挥发油类、绿原
酸类等[4]。黄酮类化合物（flavonoids）是一类来自
于丙二酰辅酶 A 和苯丙氨酸次生代谢产物[5]，广泛
分布于植物界，对植物的生长、发育、开花、结果

收稿日期：2015-09-27
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81503180）
作者简介：陈 璐（1989—），女，硕士，南京农业大学园艺学院中药材研究所在读硕士，研究方向为中药资源利用与开发。
E-mail: 2013104127@njau.edu.cn
*通信作者 郭巧生 Tel: (025)84395980 E-mail: gqs@njau.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 7 期 2016 年 4 月

• 1188 •
以及抗菌防病起重要作用[6]。其中，花青素是一类水
溶性天然色素，广泛存在于植物界[7]。它不仅控制植
物花、果皮等的颜色，同时具有抗衰老、抗氧化、
抗动脉硬化等作用，是目前发现的最强的自由基清
除剂 [8-9] 。二氢黄酮醇还原酶（ dihydroflavonol
4-reductase，DFR）是花青素合成过程的关键酶，催
化二氢黄酮醇，如二氢堪非醇、二氢榭皮素和二氢杨
梅素分别生成无色天竺葵素、无色矢车菊素和无色翠
雀素[10]。目前，对 DFR 基因研究集中在园艺植物花
色或果实颜色等相关问题，对药用植物品质形成相关
研究比较少见。而对杭菊的研究多集中在生理、化学、
种质资源及组织培养等方面[2,11-15]，对遗传特征与品
质形成关系研究尚停留在初步探索阶段，尚未见杭菊
DFR 基因相关报道。本实验采用 RT-PCR 扩增法从杭
菊头状花序中克隆得到杭菊 DFR 基因，并对其表达
量特征进行分析，为进一步进行该基因在杭菊中表达
与催化产物的关系和调控机制研究奠定基础。
1 材料
实验材料采自于浙江桐乡药用菊花种质圃，
于 2014 年 6 月定植于南京农业大学药用菊花种质
圃，经南京农业大学中药材研究所郭巧生教授鉴
定 为 药 用 菊 花 栽 培 类 型 杭 菊 Chrysanthemum
morifolium cv. ‘Hangju’；自花芽分化开始每隔 10 d
取 1 次样品，直到花蕾膨大成熟；参照郭巧生
等 [16]药用菊花头状花序开放程度标准（表 1），将
杭菊开花期分为 4 个时期，分别采摘各时期舌状
花、管状花和花序托，−80 ℃保存备用。
表 1 杭菊头状花序开放程度分级标准
Table l Flowering degree standard for capitulum of C.
morifolium cv. ‘Hangju’
等级 舌状花开放度 管状花开放度
时期 I 开放 30% 未开放
时期 II 开放 50% 开放 30%
时期 III 开放 70% 开放 50%
时期 IV 全部开放 全部开放

Trizol（Invitrogen）；反转录试剂盒、DNA 凝胶回
收试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD-19T Vctor、大肠
杆菌感受态细胞（DH5α）、工具酶等（TaKaRa Bio，
中国大连）；PCR 引物（上海立菲生物技术有限公司）。
2 方法
2.1 RNA 提取与鉴定
利用 Trizol 法提取总 RNA。提取后用琼脂糖凝
胶电泳检测 RNA 的质量，并使用核酸蛋白检测仪
检测所提 RNA 的浓度和纯度。
2.2 cDNA 合成和 PCR 扩增目的片段
取 10 μL RNA 作为模板，按照反转录试剂盒说
明书进行反转录得到 cDNA 第一链。根据 GenBank
报道的菊花 DFR 的 CDS 全序列（GenBank 登录号
GU324979）设计 DRF-1F：5’-ATGAAAGAAGACT-
CACCAGCCA-3’和 DFR-1R：5’-GGGACTGATAAAT-
GGACCAACA-3’；DFR-2F：5’-ACATTGGCGGAGA-
AAGCAG-3’和 DFR-2R：5’-AAACACATTCCCAG-
TCCCG-3’ 2 对引物并委托上海立菲生物技术有
限公司合成；以 cDNA 为模板扩增 2 段目的片段，
PCR 反应体系为 E×Taq 0.2 μL、10×Taq buffer 2
μL、Mg2+（25 mmol/L）2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）
2 μL、DFR-1F/DFR-2F（10 μmol/L）0.5 μL、
DFR-1R/DFR-2R（10 μmol/L）0.5 μL、cDNA 模
版 2 μL、ddH2O 15.8 μL，总体积为 25 μL。PCR
反应条件：预变性 94 ℃、3 min，94 ℃变性、30
s，58 ℃、退火 1 min，72 ℃延伸、90 s，30 个
循环，72 ℃补充延伸 5 min。PCR扩增产物经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测后回收和纯化。
2.3 杭菊 DFR 基因的克隆
将回收的目的片段与 pMD-19T Vector 载体连
接；转化 DH5α，含氨苄青霉素 LBamp 培养基上涂
板培养，蓝白斑选择阳性克隆，进行 PCR 检测后
DNA 序列测序。
2.4 杭菊 DFR 基因序列的验证
根据测序后拼接的 DFR 基因全序列设计引物
primer3-F: 5’-GACTCACCAGCCATTGTATG-3’和
primer3-R: 5’-TCACCAAGTATGCTCTTTGC-3’，以
cDNA 为模板扩增目的基因，反应条件和反应体系
均与“2.2”项相同。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检
测后回收纯化；纯化产物经连接、转化后蓝白斑挑
取阳性克隆经 PCR 检测后进行测序。最后将测序结
果与拼接结果进行比对。
2.5 生物信息学分析
将测序结果拼接得到杭菊 DFR 基因，在 NCBI
上进行 Blast 比对，并与已公开的其他植物 DFR 基
因进行同源性分析，根据完整开放阅读框（ORF）
预测氨基酸序列并构建系统进化树。
2.6 杭菊花中 DFR 基因表达量分析
荧光定量 PCR（qPCR）分析抗菊花芽分化过
程和开花期不同时期舌状花、管状花、花序托的
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 7 期 2016 年 4 月

• 1189 •
DFR 基因表达量。根据杭菊 DFR 基因设计荧光定
量 PCR 引物 primer-F：5’-GACATTATGGAAGGCG-
GATT-3’和 primer-R：5’-GTGGCAACATGAAACA-
CTC-3’进行 qPCR，扩增产物长度为 85 bp；选择
actin 作为内参基因，设计引物：primer（actin）-F：
5’-ACAACTGCTGAACGGGAAAT-3’ 和 primer
（actin）-R：5’-TCATAGACGGCTGGAAAAGG-3’，
扩增产物为长度为 196 bp。PCR 反应体系：SYBR
Premix E×TaqTM（2×）10 μL；primer-F 和 primer-R
均为 0.4 μL（10 μmol/L）；cDNA 模板 2 μL；ROX
Reference Dye（50×）0.4 μL；ddH2O 6.8 μL。以 actin
作为内参，设 3 个重复，以 ROX 作为荧光校正；预
变性 95 ℃、30 s 后 95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 个
循环；熔解曲线为 95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、
15 s，每升高 0.3 ℃，采集 1 次荧光信号，重复 3 次。
3 结果与分析
3.1 杭菊 DFR 基因 cDNA 全长克隆
利用 Trizol 法从杭菊中提取总 RNA，经凝胶电
泳检测结果显示 28 S rRNA 和 18 S rRNA 条带清晰
（图 1-A）且前者亮度约为后者 2 倍，说明所提取
RNA 完整性较好；经核酸蛋白检测仪检测 A260/A280
值为 1.92，A260/A 230 值为 2.06，说明 RNA 纯度较高，
已达到 RT-PCR 扩增和 qPCR 要求。
根据菊花 DFR 基因（GenBank 登录号：
GU324979）的 CDS 全序列分别设计 2 对引物，以
杭菊 cDNA 为模板分别进行扩增和测序（图 1-B），
将测序结果拼接得到 1 条全长为 1 152 bp 的杭菊
DFR 基因序列。根据已得到的 DNA 序列设计引物，
扩增得到的片段长度为 1 152 bp（图 1-C），测序后
结果与拼接得到的目的基因完全一致。


M-Marker D1-目的基因片段 1 D2-目的基因片段 2 D3-目的基因全长 A-杭菊总 RNA 提取凝胶电泳 B-杭菊 DFR 基因 RT-PCR 扩增凝胶
电泳 C-杭菊 DFR 基因全序列 PCR 扩增的凝胶电泳 D-荧光定量 PCR 引物特异性验证的琼脂糖凝胶电泳
M-Marker D1-target gene fragment 1 D2-target gene fragment 2 D3-target gene fragment 3 A-agarose gel electrophoresis of total RNA of C. morifolium
cv. ‘Hangju’ B-agarose gel electrophoresis of RT-PCRC amplification of DFR gene in C. morifolium cv. ‘Hangju’; C-agarose gel electrophoresis of RT-PCR
amplification of full-length sequence of DFR gene in C. morifolium cv. ‘Hangju’; D-agarose gel electrophoresis of specific verification of qPCR primers
图 1 相关电泳图
Fig. 1 Related electrophotogram
3.2 杭菊 DFR 基因的生物信息学分析
已得到的杭菊DFR基因序列在NCBI上进行序列
比对分析，发现该序列与菊花 DFR 基因序列同源性
为 99%，说明该基因确实为杭菊 DFR 基因。序列分
析表明，该基因包含一个长度为 1 029 bp 的 ORF，共
编码 342 个氨基酸（图 2）。根据在线分析软件
（http://web.expasy.org/），该蛋白的相对分子质量约为
38 440，理论等电点（pI）为 6.09。根据在线分析软
件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）预测该蛋白的二级结构，
结果表明该蛋白由 134 个 α-螺旋、62 个延伸链、36
个 β-折叠和 110 个自由卷曲相连接（图 3）。
3.3 杭菊 DFR 基因的同源性及系统进化树分析
NCBI 在线对杭菊 DFR 基因编码的氨基酸序
列与其他物种DFR基因编码的氨基酸序列进行比
对分析，通过 MEGA 6.06 软件，采用 Test
Neighbor-Joining 法构建系统进化树（图 4）。结果
表明，杭菊 DFR 基因编码氨基酸序列与菊科其他植
物 DFR 基因编码氨基酸序列同源性很高，其中与菊
花的 DFR 基因编码氨基酸序列的同源性高达 98%，
大丽花 Dahila pinnata Cav. 86%，向日葵 Helianthus
annuus L. 84%；与其他科属植物也有较高的同源
性，同源性均在 72%～80%。从进化树上可看出杭
菊 DFR 基因编码氨基酸与菊科的菊花、大丽花、向
日葵、矢车菊 Centaurea maculosa L.、雪莲 Saussurea
involucrate Kar. et Kir.、红凤菜 Gynura bictor DC.、
非洲菊 Gerbera jamesonii Bolus. 的 DFR 基因编码
氨基酸在进化关系上较近，与其他科属如杜鹃花
Rhododendron simsii Planch. 、 猕 猴 桃 Actinida
chinensis Lindl. 等的DFR基因编码氨基酸在进化关
系上较远；同科属间进化保守。
D1 M D2 D3 M M

A B C D
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 000 bp
500 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
200 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
200 bp
100 bp
28 S
18 S

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 7 期 2016 年 4 月

• 1190 •

1 TTATGAAAGAAGACTCACCAGCCATTGTATGTGTCACTGGAGCTTCCGGTTTCATTGGTT
1 M K E D S P A I V C V T G A S G F I G
61 CATGGCTCGTTATGAGACTACTCGAACGTGGCTATATTGTTCGTGCTACTGTTCGTGACC
20 S W L V M R L L E R G Y I V R A T V R D
121 CTGGTGACATGAAAAAGGTGAAACATTTGCTTGAACTTCCAAAAGCCGAAACAAACTTGA
40 P G D M K K V K H L L E L P K A E T N L
181 CATTATGGAAGGCGGATTTAGCGCTAGAAGGAAGTTTTGATGAAGCCATTGAAGGTTGCC
60 T L W K A D L A L E G S F D E A I E G C
241 ATGGAGTGTTTCATGTTGCCACCCCTATGGACTTTGAGTCCAAGGACCCTGAGAACGAAA
80 H G V F H V A T P M D F E S K D P E N E
301 TCATAAAGCCAACAATCGACGGTGTATTAAGCATCATAAGATCATGTGTTAAAGCTAAAA
100 I I K P T I D G V L S I I R S C V K A K
361 CAGTCAAGAAACTGGTGTTCACCTCCTCTGCTGGGACTGTTAACGTACAAAAACAGCAAG
120 T V K K L V F T S S A G T V N V Q K Q Q
421 TTCCGGTCTATGATGAGTCACACTGGAGCGATCTGGACTTCATCTACTCCAAAAAAATGA
140 V P V Y D E S H W S D L D F I Y S K K M
481 CAGCCTGGATGTATTTCGTGTCAAAAACATTGGCGGAGAAAGCAGCATGGAAAGCAACAA
160 T A W M Y F V S K T L A E K A A W K A T
541 AGGAAAATAACATTGATTTTATTAGTATCATACCAACGTTAGTTGTTGGTCCATTAATCA
180 K E N N I D F I S I I P T L V V G P L I
601 GTCCCTCGTTCTCACCAAGTCTCATGACCGCACTTTCTTTGATCATTGGAGCGGAATCAC
200 S P S F S P S L M T A L S L I I G A E S
661 ATTATTCGATTATTAAGCAATGTCAATACGTTCATTTGGATGATCTTTGCGAGAGTCATA
220 H Y S I I K Q C Q Y V H L D D L C E S H
721 TATATCTCTATGAGCAACCCAAAGCCGAAGGGAGATACATCTGCTCTTCACATGATGCCA
240 I Y L Y E Q P K A E G R Y I C S S H D A
781 CCATTCATCAATTAGCAAAAATGATCAAGGAGAAATGGCCAGAGTATCAAGTTCCAGCTA
260 T I H Q L A K M I K E K W P E Y Q V P A
841 AGTTTGAGGGGATCGATGATGAGATACCGATAGTTTCTTTTTCATCAAAGAAGTTAACCG
280 K F E G I D D E I P I V S F S S K K L T
901 ACATGGGGTTCAAGTTTAAATATGATTTCGAGGAGATGTTCAGAGGAGCAATCAAAAGTT
300 D M G F K F K Y D F E E M F R G A I K S
961 GTAAAGAGAAAGGATTACTTCCATATTCCACAAACGAGACGAAGGAGGGACTCAGCTCGT
320 C K E K G L L P Y S T N E T K E G L S S
1021 CTCATCTCTAGTAACAAAGGCGGACACTCACGAAGAGGAAAAGTTACAGATTATCCATAA
340 S H L *
1081 GGTGGCAACCCCACCCTTTAGCTCCTCTAGCAAAGAGCATACTTGGTGAATAATCCACAT
方框中为起始密码子和终止密码子
Initiation codon and termination codon in boxes
图 2 杭菊 DFR 基因 cDNA 序列及预测的氨基酸序列
Fig. 2 cDNA sequence of DFR gene in C. morifolium cv. ‘Hangju’ and its predicted amino acid sequence

图 3 杭菊 DFR 基因编码氨基酸二级结构预测
Fig. 3 Secondary structure prediction of C. morifolium cv. ‘Hangju’ DFR gene

图 4 杭菊 DFR 基因编码的氨基酸序列与其他物种 DFR 基
因编码氨基酸序列构建的进化树
Fig. 4 Phylogenetic trees based on amino acid sequences of
DFR gene in C. morifolium cv. ‘Hangju’ and other plants
3.4 杭菊 DFR 基因表达量特征分析
qPCR 分析花芽分化过程的 DFR 基因相对表达
量（图 5），经 PCR 检测引物特异性良好（图 1-D）。
结果表明花芽分化时期，0～20 d DFR 基因表达量
无明显变化，20～50 d，DFR 基因的表达量上调显
著；50 d 时，DFR 基因的表达量达到最高值。qPCR
分析开花期不同时期杭菊舌状花、管状花、花序托
的 DFR 基因相对表达量（图 6）。各部位 DFR 基因
表达量在开花期不同时期有差异；同时期花不同部
位中 DFR 基因相对表达量也有差异。其中 DFR 基因
在时期 I 的管状花中的表达量最高，在时期 II 的花序
托中表达量最低；DFR 基因在管状花中的表达量均高
于同一时期在舌状花和花序托中的表达量；DFR 基因
在花的同一部位的表达量随花期均呈现先降低后增
高的趋势，但增高和降低的时间不完全同步。
1
1
61
20
121
40
81
60
241
80
301
100
361
120
421
140
481
160
541
180
601
200
661
220
721
240
781
260
841
280
901
300
961
320
1 021
340
1 081
50 100 150 200 250
杭菊
菊花
大丽花
向日葵
矢车菊
雪莲
红凤菜
非洲菊
红薯
香彩雀
马铃薯
宁夏枸杞
黑果枸杞
胡萝卜
葡萄
西洋梨
山楂
茶树
中粒咖啡
杜鹃
猕猴桃
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 7 期 2016 年 4 月

• 1191 •


图 5 杭菊 DFR 基因在花芽分化过程的相对表达量
Fig. 5 Relative expression of DFR gene in C. morifolium cv.
‘Hangju’ in flower bud differentiation


图 6 杭菊 DFR 基因在开花期不同时期不同部位的相对表
达量
Fig. 6 Expression of DFR gene in C. morifolium cv.
‘Hangju’ in different tissues in different blossom of periods
4 讨论
花青素作为黄酮类化合物的一种，不仅直接
调控植物的花、果实、种子的颜色，同时还有一
定的药理作用，如抗肿瘤、降血糖等[17-18]，因此
它不仅影响杭菊的外在品质，也影响其内在品质，
具有很高的开发利用价值。DFR 是 DFR 超家族中
的一条短链还原酶[19]，作为花青素代谢途径中的
关键酶之一，已经从玉米、金鱼草、拟南芥和矮
牵牛等多种植物中克隆得到 [20-21]。本实验通过
RT-PCR 技术首次克隆得到了杭菊 DFR 基因的
cDNA 序列，为今后对杭菊花青素合成代谢途径
的深入研究提供了基础。
基因克隆方法包括 RT-PCR 扩增法、RACE 技
术及筛选 cDNA 文库等。RT-PCR 扩增法因实验设
计简单、易操作、结果稳定、可靠性高而成为首选。
许志茹等[22]通过 RT-PCR 扩增法克隆得到了芜菁
DFR 基因。袁定阳等[23]利用此方法克隆得到籼稻叶
绿素 a/b 结合蛋白基因全长。因此本实验采用
RT-PCR 扩增法克隆杭菊 DFR 基因方法可行、结果
可靠。通过基因序列的比对以及编码氨基酸序列的
比对，表明该基因进化比较保守，特别是在同科属
之间非常保守，这与柳爱玲等[24]的研究结果一致。
qPCR 技术被广泛应用于核酸浓度的定量、环境
监测、基因转录检测、生物分类和植物病原物鉴测
等方面，在医院研究中也用于中药的研究[25]。在研
究基因表达量上该技术具有特异性强、灵敏度高、
重复性好、定量准确、自动化程度高等优点[26]。本
实验通过 qPCR技术研究了杭菊花中DFR基因的表
达量特征。结果表明 DFR 基因的表达存在时间和空
间上的差异；从花芽开始分化到头状花序完全开放
的过程中，杭菊 DFR 基因在花蕾成熟膨大到舌状花
开放 30%的时间段内表达量最高；杭菊 DFR 基因
在花芽分化时期主要在成熟膨大的花蕾中表达，而
在花芽分化初期表达量较低，开花期则主要在管状
花中表达，这些部位都是杭菊的着色部位，由此推
测 DFR 基因可能在植物组织的着色部位表达量较
高，这与焦淑珍等[27]的研究结果一致。孟春祥等[28]
研究发现光照可诱导非洲菊 DFR 基因的表达。由此
推测杭菊 DFR 基因在开花期时期 IV 的表达量高于
时期 II、时期 III，可能是由于随着花瓣开放程度的
增加，光照面积增加而使 DFR 基因的表达量升高。
而杭菊 DFR 基因表达量在时期 II 出现显著减少可
能与一些内部转录因子有关。各部位 DFR 基因表达
量不完全同步也可能是受到其他环境因素和内部因
素的影响。
本实验克隆得到了杭菊 DFR 基因的序列，证实
了该基因在花中表达存在时间和空间差异；研究结
果结合相关文献内容推测，杭菊 DFR 基因表达量可
能与着色部位发育过程和光照诱导等因素有关；在
花中的表达模式如何受到环境因子和内部因子的调
控，DFR 基因的表达量又如何影响花青素合成等问
题仍需进一步研究。
参考文献
[1] 邵清松, 郭巧生, 李育川, 等. 药用菊花 HPLC 图谱分
析及其模式识别研究 [J]. 中草药 , 2011, 42(11):
2330-2334.
[2] 黄 莺, 王康才, 张 媛, 等. 药用菊花种间杂交及 F1
代鉴定研究 [J]. 中草药, 2011, 42(4): 783-787.
[3] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[4] 邵清松, 郭巧生, 张志远. 药用菊花种质资源遗传多样
性的 ISSR 分析 [J]. 中草药, 2009, 40(12): 1971-1975.
[5] 汪秋安, 周 冰, 单 杨, 等. 天然黄酮类化合物的抗
氧化活性和提取技术研究进展 [J]. 化工生产与技术,
2004, 11(5): 29-32.
相
对
表
达
量

4.0
3.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 20 30 40 50 60
t/d
I 期 II 期 III 期 IV 期
舌状花
管状花
花序托
15.0

14.0

3.0

2.0

1.0

0.0
相
对
表
达
量

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 7 期 2016 年 4 月

• 1192 •
[6] 杨文婷, 刘秀明, 张雪萌, 等. 红花黄酮醇合成酶基因
片段的克隆及表达分析 [J]. 中草药 , 2015, 46(2):
250-254.
[7] 丁 悦, 吴秋云, 宋 勇, 等. 植物体内花青素累积的
外源调控机制研究进展 [J]. 中国农学通报, 2014, (19):
86-91.
[8] Springob K, Nakajima J, Yamazaki M, et al. Recent
advances in the biosynthesis and accumulation of
anthoc-yanins [J]. Nat Prod Rep, 2003, 20: 288-303.
[9] Bagchi D, Sen C K, Bagchi M, et al. Anti-angiogenic,
antioxidant, and anti-carcinogenic properties of a novel
anthocyanin-rich berry extract formula [J]. Biochemistry
(Mosc), 2004, 69(1): 75-80.
[10] 郭凤丹, 夏 晗, 袁 美, 等. 花生二氢黄酮醇还原酶
基因 (DFR) 的克隆及表达分析 [J]. 农业生物技术学
报, 2011, 19(5): 816-822.
[11] Shao Q S, Guo Q S, Deng Y M, et al. A comparative
analysis of genetic diversity in medicinal Chrysanthemum
morifolium based on morphology, ISSR and SRAP
makers [J]. Biochem Syst Ecol, 2010, 38(6): 1160-1169.
[12] Wang T, Zhu Z B, Guo Q S, et al. Variation in major
flavonoids glycosides and caffeoylquinic acids during
florescence of three Chrysanthemum morifolium Ramat cv.
‘Hangju’genotypes [J]. Biochem Syst Ecol, 2013, 47: 74-79.
[13] Wang T, Guo Q S, Mao P F. Flavonoid accumulation
during florescence of three Chrysanthemum morifolium
Ramat cv. ‘Hangju’genotypes [J]. Biochem Syst Ecol,
2014, 55: 79-83.
[14] 郭巧生, 王 涛, 程俐陶, 等. 不同栽培类型药用菊花
黄酮类成分比较分析 [J]. 中国中药杂志 , 2008,
33(7)756-759.
[15] 毛鹏飞, 郭巧生, 汪 涛. 药用杭菊扦插育苗技术研究
[J]. 中草药, 2012, 43(8): 1611-1614.
[16] 郭巧生, 汪 涛, 程俐陶, 等. 药用菊花不同栽培类型
总黄酮动态积累研究 [J]. 中国中药杂志, 2008, 33(11):
1237-1239.
[17] 崔 建, 李晓岩. 花青素抗肿瘤作用机制研究进展 [J].
食品科学, 2014, 35(13): 310-315.
[18] 马淑青, 吕晓玲, 范 辉. 紫甘薯花色苷对糖尿病大鼠
血糖和血脂的影响 [J]. 营养学报, 2010, 32(1): 88-90.
[19] Martens S, Teeri T, Forkmann G. Heterologous expression
of dihydroflavonol 4-reductases from various plants [J].
Febs Lett, 2002, 531(3): 453-458.
[20] O’Reilly C, Shepherd N S, Pereira A, et al. Molecular
cloning of the a1 locus in Zea mays using the transposable
elements En and Mul [J]. EMBO J, 1985, 4(4): 877-882.
[21] 少 华, 张大生. 花青素生成相关基因 DFR 研究进展
[J]. 福建林学院学报, 2002, 22(2): 189-192.
[22] 许志茹, 刘 通, 崔国新, 等. 芜菁二氢黄酮醇 4-还原
酶基因的克隆与功能鉴定 [J]. 园艺学报, 2014, 41(4):
687-700.
[23] 袁定阳, 余 东, 谭炎宁, 等. RT-PCR 克隆籼稻叶绿素
a/b 结合蛋白基因全长 cDNA 及序列 in silico 分析 [J].
基因组学与应用生物学, 2012, 31(2): 173-177.
[24] 柳爱玲, 沈欣杰, 刘 芸, 等. 甜樱桃黄酮醇合酶基因
的克隆及其表达分析 [J]. 中国农业大学学报, 2013,
18(2): 56-63.
[25] 付春华, 陈孝平, 余龙江. 实时荧光定量 PCR 的应用
和进展 [J]. 激光生物学报, 2005, 14(6): 466-471.
[26] 刘小荣, 张 笠, 王勇平. 实时荧光定量 PCR 技术的
理论研究及其医学应用 [J]. 中国组织工程研究与临床
康复, 2010, 14(2): 329-332.
[27] 焦淑珍, 刘雅莉, 娄 倩, 等. 葡萄风信子二氢黄酮醇
4-还原酶基因 (DFR) 的克隆与表达分析 [J]. 农业生
物技术学报, 2014, 22(5): 529-540.
[28] 孟春祥, 彭建宗, 王小菁. 光和糖对非洲菊花色素苷积
累及 CHS、DFR 基因表达的影响 [J]. 园艺学报, 2007,
34(1): 227-230.