全 文 ：·1270· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月

• 药理与临床 •
松果菊苷的血清蛋白质结合机制研究
郭 明*，许建婷，范文翔
浙江农林大学理学院，浙江 临安 311300
摘 要：目的 研究血清白蛋白（serum albumin，SA）结合松果菊苷（echinacoside，ECH）的分子作用机制。方法 生理
条件下，光谱法测定药物与蛋白质的结合参数，分子模拟构建 ECH 与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的结合
模型，考察药物与 SA 结合机制。结果 构建的药物与 BSA 结合模型表明，药物与蛋白质的相互作用力主要是氢键和范德
华力，兼有疏水作用力。光谱实验表明 ECH 与 BSA 的相互作用为静态结合过程，结合强度较强，ECH 与 BSA 分子的结合
距离（r）值较小，说明发生了能量转移现象。ECH 对 BSA 的结构域微区构象产生影响，使结合位域的疏水性发生改变。
分析荧光相图得出 ECH 与 BSA 反应构象型态的变迁为“二态”模型。BSA 与 ECH 相互作用的热力学参数表明 ECH 与 BSA
之间是以氢键和范德华力为主的分子间作用。荧光偏振定量证明了 BSA 与 ECH 相互作用过程中生成了非共价复合物。结论
光谱实验与计算机模拟结果一致，可为研究 ECH 与 BSA 相互作用机制提供一定的参考。
关键词：松果菊苷；血清白蛋白；光谱实验；分子模拟；荧光偏振定量
中图分类号：R96 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)09 - 1270 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.09.014
Binding mechanism between bovine serum albumin and echinacoside
GUO Ming, XU Jian-ting, FAN Wen-xiang
School of Science, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an 311300, China
Abstract: Objective To explore the binding mechanism between echinacoside (ECH) and serum albumin (SA). Methods The
binding parameters were detected by spectrum experiment under physiological conditions, and the molecular modeling techniques had
been used to investigate the binding mechanism between ECH and bovine serum albumin (BSA). Results Molecular docking
revealed that ECH binded to BSA mainly by hydrogen bonds and van der Waals forces, and there was a hydrophobic interaction. The
results from spectroscopy indicated that the drug could bind with BSA to form static complex with significantly strong bond. The value
of binding distances (r) was low, which indicated the occurrence of energy transfer. ECH affected the conformation of micro-domain
and changed the hydrophobicity of the binding domain. The fluorescence phase diagram revealed that the changes on the
conformational pattern of proteins had been affected by drug conformed to the “all-or-none” pattern. According to the obtained
thermodynamic parameters, it also showed that the main interactional force of ECH binding with BSA was hydrogen bonds and van der
Waals forces. The fluorescence polarization proved quantitatively that ECH-BSA generated a non-covalent complex. Conclusion The
experimental results agree with computer molecular modeling, which provides helpful reference for the interaction mechanism of ECH
binding with BSA.
Key words: echinacoside; serum albumin; spectrum experiment; molecular simulation; fluorescence polarization quantitation

松果菊苷（echinacoside，ECH），又称海胆苷
（误名）、紫锥花苷，为苯乙醇苷类化合物，是管花
肉苁蓉的有效成分之一。研究表明，ECH 具有明显
的神经保护作用，主要表现为抗活性氧自由基损伤。
同时，其具有抗神经细胞凋亡、保护肝脏、抗炎、
抗肿瘤、延缓衰老、促血管舒张活性、促进组织愈
合、改善免疫调节等功能[1-2]，其分子式为 C35H46O20。
目前，ECH 与血清白蛋白（serum albumin，SA）

收稿日期：2013-11-06
基金项目：国家自然科学基金资助项目（20877072）；浙江省自然科学基金资助项目（Y2100458）
*通信作者 郭 明，男，教师，主要从事药物分析与分子作用机制研究。Tel: (0571)63740852 E-mail: guoming@zafu.edu.cn
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的相互作用研究尚未见文献报道。
SA 是血浆中量最丰富的蛋白质，具有贮运内
源代谢产物和外源药物分子等重要生理功能[3]。SA
相对分子质量较小，溶解性较大、稳定性较好、与
配体具有较好的亲和性，比较易于分离、提纯，可
大量制备，且其三级结构已被人类所探知，常作为
药物与蛋白质分子相互作用研究中的模型大分子。
不同动物种类 SA 的分子结构、功能有差别，人血
清白蛋白（human serum albumin，HSA）与牛血清
白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的氨基酸序
列高度相似，BSA 及 HSA 与药物的相互作用具有
共性特征，而 BSA 价廉易得，因此，BSA 是理想
的模型蛋白质分子。BSA[4-6]是由 582 个氨基酸残基
组成的单肽链蛋白质，其空间结构由 3 个结构域组
成，每个结构域由 2 个亚结构域以槽口相对的方式
形成圆筒结构，几乎所有的疏水性氨基酸残基都分
布于圆筒的内部构成 3 个疏水腔。HSA 是由 585 个
氨基酸组成的单肽链蛋白质，由 3 个相似结构域组
成（I～III）：结构域 I（残基 1～195），结构域 II（残
基 196～383），结构域 III（残基 384～585），每个
结构域又包含 2 个相似螺旋结构的亚域（A 和 B），
6 个亚域聚集在一起，形成不对称的心型分子，HSA
分子内含有 18 个酪氨酸残基，唯一的色氨酸残基
（Trp214）位于亚结构域 II-A。与 HSA 不同的是，
BSA 缺失 HSA 氨基酸序列的 116 位和 585 位残基，
以及 BSA 在 134 位及 213 位各含 1 个色氨酸残基。
BSA 与 HSA 均具有广泛的应用价值，分析生理条
件下药物与 BSA 的相互作用，可以获得药物的药效
学信息，深入阐明药物结合机制，也有助于为 HSA-
药物结合机制的深入分析提供理论参考。
本实验基于光谱法结合分子模拟技术研究了中
药活性成分 ECH 与 BSA 的相互作用，从获得的光
谱数据确定了它们的结合反应常数、热力学常数及
药物对蛋白质构象的影响，从分子水平上阐释 ECH
和 BSA 相互作用的机制，进而为分析 ECH 的药效
作用机制提供参考。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
BSA（质量分数≥98%）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，
GR），上海华美生物工程公司；ECH（质量分数≥
98%），上海浩然生物技术有限公司；其他试剂均为分
析纯，实验用水为亚沸蒸馏去离子水。配制浓度为 0.1
mol/L pH 7.4 的 Tris-HCl 缓冲溶液（内含 0.10 mol/L
NaCl 维持离子强度），用此缓冲溶液配制浓度为 10.0
μmol/L BSA 和浓度为 1.0 mmol/L ECH 贮备溶液。
ZD—2 型精密酸度计，上海雷磁仪器厂；F—
4500 型荧光光度计，日本 Hitachi 公司；UV—2450
型紫外-可见分光光度计，日本 Shimadzu 公司；SGI
O2 计算机图形工作站，DOCK 软件（4.02 版本）。
1.2 分子模拟
利用 SGI O2 工作站的 DOCK 4.02 程序包建立
药物与蛋白质相互作用模型，进行分子模拟计算。
受体蛋白 BSA 的晶体结构来源于 PDB 蛋白质晶体
数据库，编码 4F5S。ChemDraw 构建 ECH 的分子
结构，基于分子力学MM2力场优化后利用Ganssian
量化计算优化生成实验分子模型，分子对接预处理
时使用 AutoDock Toolkit（ADT）进行受体与配体
的优化处理。分子对接技术对配体的不同取向进行
定位，以经验势能函数作为评价函数，找到配体与
受体的最佳结合方式，进而确认 BSA 活性部位[7]。
1.3 实验方法
1.3.1 BSA 与 ECH 溶液的荧光光谱及 ECH 溶液的
吸收光谱测定 移取2.5 mL BSA溶液于1 cm的石英
比色皿中，微量进样器逐次加入 1.0 mmol/L ECH 溶
液进行荧光滴定（滴定剂累加体积≤100 μL），缓冲
溶液进行荧光空白校正，测定时荧光发射与激发狭缝
宽度均为 2.5 nm，波长扫速 1 200 nm/min，固定激发
波长 282 nm，室温下绘制 250～900 nm 的发射光谱；
荧光光谱仪扫描激发波长和发射波长之间的波长差
（Δλ）分别为 15、60 nm 的上述溶液体系的同步荧光
光谱。发射与激发狭缝宽度同上，扫速 240 nm/min，
Tris-HCl 缓冲溶液进行荧光空白校正。
1.3.2 荧光偏振光谱测定 固定激发波长为 282
nm，先以垂直偏振光激发样品，分别检测荧光的垂
直偏振分量（IVV）和水平偏振分量（IVH）；再以水
平偏振光激发样品，检测荧光的垂直偏振分量（IHV）
和水平偏振分量（IHH）；室温下绘制 250～900 nm
的荧光偏振光谱。移取 2.5 mL Tris-HCl 缓冲溶液于
1 cm 石英比色皿中，微量进样器加入 1.0 mmol/L
ECH 溶液，使其浓度为 10.0 μmol/L，测定 500～190
nm 紫外吸收光谱，扫速 60 nm/min 扫描，狭缝宽度
2.5 nm，缓冲溶液定基线。
2 结果与讨论
2.1 分子模拟研究
分子模拟构建 ECH 与 BSA 相互作用的结合反
应模型时，分别考虑 BSA 的 Sudlow’s sites I、sites
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II[8]、6 个脂肪酸结合位点及 triethylene glycol 药物
结合位点进行 ECH 分子对接的模拟计算工作。分子
对接 ECH 与 BSA 的结合模型见图 1。
由图 1 可见，ECH 分子结合在 BSA 的表面活
性口袋处。ECH 分子距 BSA 酪氨酸残基（Tyr149
和 Tyr155）和苯丙氨酸（Phe148）很近，这解释了
ECH 猝灭 BSA 内源荧光现象。同时，ECH 分子与
BSA 结合过程中，ECH 分子中 B 环上与 C 环对位
的羟基氧原子与 Glu152 发生氢键相互作用，C 环上
的羟基氧原子与 Arg194 发生氢键相互作用；另一
方面，ECH 非共价结合在 BSA 活性位点域，其结
合口袋周围主要由 Leu153、Leu197、Leu218、
Leu237、Leu259、Ala150、Ala193、Ala216、Ala260、
Ala290、Ala341、Phe148、Val188、Val240、Val292、
Val342、Ile289、Pro151、Pro338、Pro446 氨基酸残
基形成疏水区域，由分子模拟结果可知氢键及范德
华力起主要作用，是该药物与蛋白质分子结合的主
要驱动力，同时也兼有疏水作用的存在。
由分子模拟结果可知，ECH 与 BSA 的主要作
用力为氢键和范德华力，兼有疏水作用力的存在，
为验证 ECH 与 BSA 的键合机制和键合方式，通过
光谱实验来进一步证实分子模拟的合理性。

只显示配体周围 1.00 nm 的残基，BSA 与配体结构用棍棒模型表示，其中红色的代表氧，红色虚线代表配体和蛋白质之间的氢键
only residues around 1.00 nm of the ligand are displayed. The residues of BSA and the ligand structure are represented using stick model,
there into red sticks represented oxygen. The hydrogen bond between the ligand and the protein is represented using red dashed line
图 1 ECH 与 BSA 相互作用的分子对接图 (A) 及疏水表面图 (B)
Fig. 1 Molecular docking mode (A) and hydrophobic surface map (B) of interation between ECH and BSA

2.2 BSA与ECH相互作用荧光光谱及结合反应机制
图 2 为 BSA、ECH 及二者以等物质的量混合体
系的荧光光谱。在 282 nm 激发波长下，BSA 最大发
射波长为 342 nm，而由 ECH-BSA 体系荧光光谱可以
看出，药物的加入使 BSA 的荧光强度（F）降低，表
明药物与 BSA 间存在着相互作用，发生了能量转移。
图 3 为 ECH-BSA 的紫外吸收差谱，可以发现
BSA 的紫外吸收曲线及 BSA-ECH 等摩尔混合物与
ECH 的差谱几乎完全重合，表明 ECH 的加入并未
使 BSA 的紫外吸收发生变化。同时由图 2 可见，
ECH在 282 nm激发波长及 342 nm发射波长下没有
吸收，因此，可不考虑内滤光效应。
图 4为BSA荧光发射谱随ECH浓度的变化图。
分析图 4 可知，a 峰为 BSA 的一级荧光峰，从图中
可以看出随着药物的加入，a 峰逐渐降低；b 峰为激
发峰的二级倍频荧光峰；c 峰为 BSA 的二级倍频荧
光峰。在固定 BSA 浓度的条件下，随着反应体系中
药物浓度增大，BSA 的荧光强度呈规律性的降低，
这表明药物对 BSA 有猝灭作用。荧光最大发射峰位





图 2 BSA-ECH 体系中各试样的荧光图谱
Fig. 2 Fluorescence emission spectra of BSA-ECH
solution system
A B
25 ℃
37 ℃
7 000
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
F
300 350 400 450 500
λ / nm
300 350 400 450 500
λ / nm
7 000
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
F
BSA
BSA-ECH（1∶1）
ECH
BSA
ECH
BSA-ECH（1∶1）
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图 3 ECH-BSA 的紫外吸收差谱
Fig. 3 UV absorption difference spectrum of ECH-BSA






图 4 BSA 与 ECH 相互作用的荧光图谱
Fig. 4 Fluorescence quenching spectra of BSA
interacting with ECH
置出现了红移，25 ℃时红移为 15 nm，37 ℃时为
8 nm，说明 ECH 和 BSA 确实存在相互作用，ECH
猝灭了 BSA 氨基酸残基的内源荧光，造成 BSA 分
子中与 ECH 相互作用的氨基酸残基的微区环境发
生一定变化。
蛋白质与药物分子相互作用的荧光猝灭过程通
常分为静态猝灭与动态猝灭，动态猝灭过程遵循
Stern-Volmer 方程。静态猝灭是猝灭剂与荧光体分
子在基态时生成不发光的复合物，由静态猝灭的实
验数据可以求取结合参数。首先按 Stern-Volmer[9]
方程［F0/F＝1＋Kqτ0[D]＝1＋KSV[D]，式中 Kq 为双
分子猝灭过程速率常数；τ0 为猝灭剂不存在时生物
大分子的平均荧光寿命；[D]为猝灭剂 ECH 的浓度；
KSV 为 Stern-Volmer 猝灭常数，即双分子猝灭过程
速率常数（双分子猝灭过程速率常数 Kq＝KSV/τ0）
与单分子衰变速率常数的比率］处理上述体系。由
实验测得 ECH 与 BSA 相互作用的荧光光谱数据，
按 Stern-Volmer 方程处理可得图 5。
由于无猝灭剂时生物大分子的 τ0 为 10−8 s 数量
级[10]，则由实验数据可以通过 Stern-Volmer 方程计
算不同温度下 ECH-BSA 相互作用的猝灭常数 KSV、
Kq，计算结果列于表 1。




图 5 ECH 对 BSA 荧光猝灭的 Stern-Volmer 图
Fig. 5 Stern-Volmer curves of BSA fluorescence
quenching by ECH

表 1 BSA 与 ECH 相互作用的猝灭参数
Table 1 Quenching constants of ECH binding with BSA
T / K KSV / (L·mol−1) Kq / (L·mol−1·s−1) R
298 5.996 5×104 5.996 5×1012 0.993 3
310 4.812 0×104 4.812 0×1012 0.995 0

目前，生物大分子与活性小分子相互作用的荧
光猝灭机制研究中，常用 2 种方法判定荧光猝灭机
制，一种方法是比较双分子猝灭过程速率常数与猝
灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭速率常数
（2.0×1010 L·mol−1·s−1）来间接判断荧光猝灭机制[11]；
另一种方法是通过变温实验直接推断荧光猝灭机
制[12]。由表 1 结果可知，ECH 对 BSA 荧光猝灭的
Stern-Volmer 曲线有良好的线性关系，Kq 值远大于
2.0×1010 L/(mol·s)，说明 ECH 对 BSA 的猝灭是由
于形成了复合物而引起的静态猝灭。另外，在不
同温度下作 ECH 对 BSA 荧光猝灭的 Stern-Volmer
图（图 5）。由图 5 可见，在选定的浓度范围内，
随着温度升高，猝灭常数呈降低趋势，进一步确
定了 ECH 对 BSA 的猝灭机制为静态猝灭。由此 2
5
4
3
2
1
0
A
BSA
BSA-ECH
250 300 350 400 450 500
λ / nm
CBSA＝CECH＝10.0 μmol·L−1
7 000
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
F
25 ℃
37 ℃
300 500 700 900
λ / nm
CBSA＝10.0 μmol·L−1
1～8：CECH 分别为 0、
4、8、10、16、24、
32、40 μmol·L−1
1



↓



8
a
b c
7 000
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
1



↓



8
F
c b
a
300 500 700 900
λ / nm
298 K
310 K
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
F 0
/
F
0 15 30 45
[D] / (μmol·L−1)
a-BSA 的一级荧光峰
b-激发峰的二级倍频荧光峰
c-BSA 的二级倍频荧光峰
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个结果可以确定 ECH 与 BSA 的荧光猝灭机制为
静态猝灭。
2.3 ECH 与 BSA 相互作用的结合常数（K）及结
合位点数（n）
由实验数据分析得到ECH与 BSA相互作用的
动态荧光猝灭机制，则由荧光分子荧光强度-猝灭
剂浓度关系得出结合参数的理论计算公式 [13]：
lg[(F0－F)/F]＝lgK＋nlg[Df]，式中 F0 与 F 分别为
猝灭剂加入前后荧光分子的相对强度，K 是结合常
数，n 是结合位点数。因为加入的 ECH 溶液体积远
小于比色皿中溶液体积，可以合理采用猝灭剂的总
浓度 [D] 代替 [Df]。以 lg[D] 对 lg[(F0－F)/F] 作
双对数图（图 6），求得 K 和 n 值，结果列于表 2。



图 6 ECH-BSA 体系荧光变化线性拟合图
Fig. 6 Fluorescence change linear fitting results
of ECH-BSA system
表 2 BSA 与 ECH 的结合参数
Table 2 Binding parameters of ECH and BSA binding
T / K K / (L·mol−1) n 拟合方程 R SD 显著性
298 9.954 5×105 1.28 Y＝5.998 0＋1.277 5 X 0.992 8 0.060 2 P＜0.000 1
310 1.203 0×105 1.10 Y＝5.080 3＋1.095 1 X 0.998 8 0.021 4 P＜0.000 1

由图 6 结合表 2 可见，ECH 与 BSA 之间存在结
合强度较强的相互作用，ECH 与 BSA 存在 1 个结合
位点，说明ECH 分子与BSA 形成了较稳定的复合物。
2.4 ECH 与 BSA 相互作用力的测定
药物分子与生物大分子的相互作用力类型包括
氢键、范德华力、静电引力、疏水相互作用，在一
定温度范围内，相互作用过程的 ΔH 可视为常数，
则可以计算相互作用的热力学参数。根据热力学公
式[14]及前文求出的 K，求得 ECH 与 BSA 结合反应
的热力学参数。
ΔG＝ΔH－T×ΔS
ΔG＝−RT lnK
ln(K2/K1)＝(ΔH/R)×(1/T1－1/T2)
求得的 ΔG、ΔH 及 ΔS 值列于表 3。药物与蛋
白质的分子作用机制可根据药物-生物大分子的相
互作用模式判定，药物与蛋白质相互作用的类型可
由如下规则确定[15]：ΔS＞0 时为疏水和静电作用力；
ΔS＜0 时为氢键和范德华力；ΔH＞0，ΔS＞0 时为
典型的疏水作用力；ΔH＜0，ΔS＜0 时为氢键和范
德华力。由表 3 的结果可知，ECH 与 BSA 的相互
作用主要为氢键和范德华力。
2.5 ECH 对 BSA 体系的能量转移参数测定
按照 Förster 非辐射能量转移机制[16]可以求出
猝灭剂分子-蛋白质分子间的能量转移效率（E）及
表 3 ECH 与 BSA 的热力学参数
Table 3 Thermodynamic parameters of ECH
binding with BSA
T / K
ΔH /
(kJ·mol−1)
ΔS /
(J·mol−1·K−1)
ΔG /
(kJ·mol−1)
298 −36.65
310
−162.13 −404.77
−41.50

猝灭剂与蛋白质分子中荧光发射残基的结合距离
（r）。据此理论，荧光发射体和荧光猝灭体之间的 E
和两者之间的 r 及临界能量转移距离（R0，E＝50%
时的临界能量距离）相关。
E＝R06/(R06＋r6)
R06＝8.8×10−25K2N−4ΦJ
K2为偶极空间取向因子，N 为介质的折射指数，Φ 为蛋白质
分子的光量子效率，J 为蛋白质分子荧光发射光谱与药物吸
收光谱间的光谱重叠积分
J＝ 4
0 0
( ) ( ) ( )F d F dλ ε λ λ λ λ λ∞ ∞∫ ∫
F(λ)为蛋白质分子在波长 λ 处的荧光强度；ε(λ)为药物在波长
λ 处的摩尔吸收系数
E 则可以根据公式 E＝1－F/F0 测得。
由获得的 UV 谱及荧光光谱作重叠光谱图，见
图 7。从图 7 可见，BSA 的荧光发射谱与 ECH 的紫
外吸收谱确有部分重叠。根据 Förster 的偶极-偶极
0.4
0.2
0
−0.2
−0.4
−0.6
−0.8
−1.0
298 K
310 K
lg
[(
F 0
－
F)
/F
]
−5.6 −5.2 −4.8 −4.4
lg[D]
CBSA＝10.0 μmol·L−1
CECH＝10.0 μmol·L−1
pH 7.40
λex＝282 nm
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图 7 BSA 的荧光发射谱 (a) 与 ECH 的紫外吸收谱 (b)
的重叠图
Fig. 7 Overlap between fluorescence emission spectra of
BSA (a) and UV absorption spectra of ECH (b)

非辐射能量转移理论[18]指出：当供能体与受能体足够
靠近，距离在 7 nm 范围内时，被激发的供能体分子
将会与近邻受能体分子发生非辐射能量转移现象。如
果供能体发射荧光，供能体的荧光发射光谱将与受能
体的吸收谱有足够的重叠，导致供能体荧光猝灭，并
由此可以求出受能体分子和供能体分子的结合距离。
本实验根据上述公式计算出 BSA-ECH 结合反
应的光谱重叠积分 J＝1.43×10−14 cm3·L/mol，求得
E＝0.31。在本实验条件下，取偶极空间取向因子为
两结合物各向随机分布的平均值，即 K2＝2/3，光
量子效率取色氨酸标准值 Φ＝0.118，折射指数 N＝
1.336，将以上各量代入公式，可得到 BSA 的 R0＝
2.62 nm， r 为 2.99 nm。r＜7 nm，即 BSA 的氨基
酸残基与 ECH 的距离小于 7 nm，符合非辐射能量
转移理论，氨基酸残基可将能量以非辐射方式转移
至 ECH，引起 BSA 的荧光猝灭。
2.6 ECH 对 BSA 构象的影响
蛋白质的同步荧光光谱中，Δλ＝15 nm 显示酪
氨酸残基的荧光光谱特性，Δλ＝60 nm 显示色氨酸
残基的荧光光谱特性。蛋白质中氨基酸残基的最大
发射波长与其所处环境的极性有关，故由最大发射
波长的变化可判断蛋白质构象的变化。固定 BSA 浓
度，逐渐增加 ECH 浓度，可得到 BSA-ECH 体系的
同步荧光光谱（图 8）。





图 8 BSA-ECH 体系的同步荧光光谱
Fig. 8 Synchronous fluorescence spectra
of BSA- ECH system
从图 8可见，BSA的荧光主要由色氨酸所贡献。
随着药物浓度的增大，酪氨酸残基的最大发射波长
基本保持不变（图 8-A）；图 8-B 显示，Δλ＝60 nm
时，色氨酸残基的最大发射波长出现了轻微蓝移现
象，说明 ECH 与 BSA 的相互结合，导致 BSA 的构
象发生变化，影响到 BSA 分子中色氨酸残基所处的
微区环境，使其色氨酸残基所处的环境极性减小，
组成疏水腔的肽链处于部分紧缩状态，疏水性有所
增加。
2.7 BSA-ECH 结合反应对 BSA 构象型态变迁的
影响
为了进一步了解 ECH 与 BSA 结合反应对 BSA
构象型态变迁的动力学机制，采用荧光相图法作进
一步分析。荧光相图法是在发射波长 λ1 和 λ2 下测定
蛋白质在不同实验条件下荧光强度 I(λ1) 和 I(λ2) 的
变化来描述蛋白质的结构变化结果。荧光强度是一
种广度性质，因此存在以下关系：I(λ1)＝a＋b I(λ2)，
a＝I1(λ1)I1(λ2)[I2(λ1)－I1(λ1)] / [I2(λ2)－I1(λ2)]，b＝
[I2(λ1)－I1(λ1)] / [I2(λ2)－I1(λ2)]。
若关系式 I(λ1)＝a＋b I(λ2)表现为线性，则表示
相应的蛋白质构象型态变迁过程符合“二态模
型”；反之若为非线性，表明蛋白质的构象型态转
变过程是一个序变过程；若该关系式表现为两条或
多条直线，其中每一条直线都描述一个“全或无”
7 000


6 000


5 000


4 000


3 000


2 000


1 000


0
F
a
b
300 500 700
λ / nm
4
3
2
1
0
A
800
600
400
200
0
F
1
↓
8
Δλ＝15 nm
260 280 300 320
1
↓
8
Δλ＝60 nm
F
7 000
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
240 260 280 300 320
λ / nm
CBSA＝10.0 μmol·L−1
1～8：CECH 分别为 0、
4、8、10、16、24、
32、40 μmol·L−1
A
B
·1276· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月

的蛋白质结构变化过程，则符合“多态模型”。
本实验以 I320－I365 的相图反应结果最准确，图
9 为根据实验数据作出的相应荧光相图。从图 9 可
以看出，ECH 与 BSA 结合反应的荧光相图呈线性，
说明 ECH 与 BSA 发生非共价结合作用时，BSA 中
构象型态变迁过程不是序变过程，是一个“二态”
模型。







图 9 ECH-BSA 体系的荧光相图
Fig. 9 Fluorescence phase diagram of ECH-BSA system

2.8 偏振荧光谱定量分析ECH与BSA的相互作用
偏振荧光光谱反映的是荧光体分子在激发波长
下发射波长变化的偏振光谱。偏振荧光光谱可用偏
振度（P）与各向异性（r）来度量，其中 P 可根据下
式计算[10]：P＝(IVV－GIVH)/(IVV＋GIVH)，其中 G 为校
正因子（G＝IHV/IHH），而 r 计算如下：r＝(IVV－
GIVH)/(IVV＋2GIVH)，其中 G、IHV、IHH、IVV、IVH
的含义与 P 计算公式中相同。固定 BSA 浓度，加
入不同浓度的 ECH 后，读取偏振荧光数据并按公式
计算各溶液体系的 P 及 r 值，结果见表 4。
表 4 ECH-BSA 体系荧光偏振参数
Table 4 Fluorescence polarization parameters
of ECH-BSA systems
体系 IVV IVH IHV IHH G P r
BSA 447.9 337.4 278.0 256.1 1.085 5 0.100 3 0.069 2
ECH-BSA 302.0 232.6 198.9 191.2 1.040 3 0.110 4 0.076 4
荧光体的 P 及 r 与荧光体的转动速度成反比。
荧光体越小，转动速度越快，其 P 及 r 就越小。由
表 4 数据可见，在水溶液中荧光体分子 BSA 转动速
度较快，消偏现象严重，P 及 r 较小。而 BSA 与
ECH 发生相互作用后，BSA 的 P 及 r 均有提高，说
明药物与蛋白质分子之间存在分子间作用力，形成
复合物后荧光体体积变大，分子转动受阻，旋转速
度变慢，体系的黏度变大，因而荧光偏振度随之变
大。实验数据定量证明了 BSA 与 ECH 发生相互作
用，生成了非共价复合物。
2.9 分子模拟与实验结果的符合度分析
根据光谱实验结果，ECH 中色氨酸残基及酪氨
酸残基所在微区位域与 BSA 之间具有明显的相互
作用。但对接结果显示，在配体分子周围 1.00 nm
的范围内存在着 2 个酪氨酸残基，并未存在色氨酸
残基。分子对接结果与实验结果存在一定差异。根
据光谱实验测得 ECH 与 BSA 的结合距离为 2.99
nm，将 ECH-BSA 周围 2.90 nm 的氨基酸残基分子
对接后发现该范围内存在 2 个色氨酸残基 Trp134
和 Trp213，能很好地解释 ECH 猝灭 BSA 内源荧光
的现象。将 ECH-BSA 周围 2.90 nm 的氨基酸残基
通过分子对接图显示出来（没有改变 ECH-BSA 内
核结构及相互作用力），结果见图 10。

图 10 ECH 与 BSA 相互作用的分子对接图
Fig. 10 Interaction mode between ECH and BSA
由图 10 可见，ECH 插入 BSA 所在结构位域过
程中，药物的进入在造成对接位点结构位域微区构
象改变的同时，由于 BSA 分子倾向于保持整体能量
最低的溶液“紧缩”型态，药物分子嵌入对接位点
结构位域中势必会压缩邻近微区位域使其肽链受到
挤压，相应的色氨酸邻近结构位域的肽链型态变化
（即产生别构效应），使色氨酸残基所处的环境极性
5 000
4 500
4 000
3 500
3 000
2 500
2 000
1 500
I 3
65

1 000 2 000 3 000 4 000
I320
y＝708.724 5＋1.091 66 x
R＝0.995 31，N＝8
SD＝106.765 06
P＜0.000 1 25 ℃
37 ℃
4 500

4 000

3 500

3 000

2 500

2 000
I 3
65

y＝646.311 94＋1.087 44 x
R＝0.999 58，N＝8
SD＝27.587 26
P＜0.000 1
1 000 2 000 3 000 4 000
I320
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月 ·1277·

减小，组成疏水腔的肽链处于部分紧缩状态，疏水
性有所增加，引起色氨酸残基的荧光光谱发生了蓝
移。由图 8 同步荧光光谱中，Δλ＝60 nm 的荧光谱
最大发射波长轻微蓝移的结果可知，分子模拟与实
验结果相一致。
3 结论
本实验利用光谱法结合分子模拟技术研究了中
药活性成分 ECH 与 BSA 的相互作用。分子模拟揭
示了药物在 BSA 上的结合部位，综合实验得到热力
学函数，确定了两者间的作用力，主要是氢键和范
德华力作用兼有疏水作用。光谱法的结果显示药物
分子与 BSA 之间的反应机制为动态猝灭。根据能量
转移理论，说明发生了非辐射能量转移现象。ECH
的加入可以引起 BSA 构象型态的转变，且转变符合
“二态模型”。根据荧光偏振分析证明了 BSA 与药物
确实发生了相互作用，生成了非共价复合物。实验
结果与计算机模拟相一致。本研究不仅可为中药活
性成分 ECH 与 BSA 分子相互作用的深入研究提供
有益结果，而且对于中药其他有效成分与蛋白质分
子的相互作用研究也具有一定的参考意义。
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