全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月 ·2641·
二次通用旋转组合法优化黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的酶解提取工艺
包旭宏 1, 2，王继龙 1，魏舒畅 1*，高建德 1，范凌云 1
1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000
2.甘肃奇正藏药有限公司，甘肃 兰州 730000
摘 要：目的 采用二次通用旋转组合设计优化黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的酶解提取工艺。方法 在确定酶比例的基
础上，选定复合酶用量、酶解时间、加水量和提取时间为考察因素，以毛蕊异黄酮苷、芒柄花素提取量为指标，采用二次通
用旋转组合设计优化黄芪酶解提取工艺。结果 优化所得黄芪酶解提取的最佳工艺条件：复合酶用量 340 mg，酶解时间 110
min，加水量 19 倍，提取时间 150 min，在此条件下，毛蕊异黄酮苷、芒柄花素提取量分别为 0.25 mg/g、67.95 µg/g。结论 优
化所得黄芪酶解提取工艺稳定可行。
关键词：黄芪；毛蕊异黄酮苷；芒柄花素；酶解；提取；二次通用旋转组合设计
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)18 - 2641 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.18.013
Enzymatic extraction process of calycosin glucoside and pormononetin in Astragali
Radix with quadratic general rotary unitized design
BAO Xu-hong1, 2, WANG Ji-long1, WEI Shu-chang1, GAO Jian-de1, FAN Ling-yun1
1. Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China
2. Gansu Cheezheng Tibetan Medicine Co., Ltd., Lanzhou 730000, China
Abstract: Objective The technological conditions for enzymatic extraction of calycosin glucoside and formononetin in Astragali
Radix were optimized by using quadratic general rotary unitized design. Methods On the base of single factors experiments, main
factors that affecting the extraction efficiency, such as enzyme dosage, enzymatic hydrolysis time, adding water volume, and
extraction time were selected. With the content of calycosin glucoside and formononetin as evaluation index, the process of enzymatic
extraction of Astragali Radix was optimized by using quadratic general rotary unitized design. Results The optimum enzymatic
extraction process was as follows: enzyme dosage 340 mg, enzymatic hydrolysis time 110 min, adding water volume 19 times, and
extraction time 150 min. Under these optimum conditions, the content of calycosin glucoside was 0.25 mg/g, and formononetin was
67.95 µg/g. Conclusion The optimum enzymatic extraction process of Astragali Radix is stable and feasible.
Key words: Astragali Radix; calycosin glucoside; formononetin; enzymatic hydrolysis; extraction; quadratic general rotary unitized
design

黄芪药材来源于豆科植物蒙古黄芪 Astragalus
membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.)
Hsiao 或膜荚黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.)
Bge. 的干燥根[1]。具有补气固表、利尿托毒、排脓、
敛疮生肌之功效。作为甘肃省大宗道地药材，其医
疗、保健功用而深得各界信任。
用酶解法提取中药材可减小传质阻力，有效提
高成分提取率、缩短提取时间，而且由于酶解条件
温和，可保持天然产物的构象[2-3]。黄芪为纤维性根
茎类药材，造成传质阻力的物质除纤维素外尚有半
纤维素、果胶等物质。本实验用复合酶酶解黄芪药
材，更有利于有效成分提取。
二次通用旋转组合设计因具有旋转性，可克服
正交、均匀等实验设计方法的不足，因此，广泛应
用于科学研究[4]。本实验以黄芪中异黄酮类物质毛
蕊异黄酮苷及芒柄花素提取量为指标，采用二次通

收稿日期：2014-05-12
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81060345）
作者简介：包旭宏（1976—），男，高级工程师，硕士生导师，主要从事中药新药研究。Tel: (0931)8558428 E-mail: bxh@qzh.cn
*通信作者 魏舒畅，男，教授，硕士生导师。Tel: (0931)8765391 E-mail: zhiyao@gszy.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月 ·2642·
用旋转组合设计对复合酶提取其中毛蕊异黄酮苷及
芒柄花素的工艺条件进行优化，研究结果对纤维性
根茎类药材中的黄酮类物质酶解提取工艺具有参考
意义。
1 仪器与材料
Agilent1260 型高效液相色谱仪，配 G1312C 泵、
G1315D 型 DAD 检测器、G1329B 型自动进样器、
G1316A 型柱温箱和 1260 色谱工作站（美国 Agilent
公司）；ABT100—5M 分析天平（德国 KERN 公司）；
AKRY—UP—1816 超纯水机（成都唐氏康宁科技发
展有限公司）。
药材黄芪（来源于甘肃武都），经甘肃中医学院
药学系魏舒畅教授鉴定，为豆科植物蒙古黄芪
Astragalu membranaceus (Fisch.) Bge. var.
mongholicus (Bge.) Hsiao 的干燥根；毛蕊异黄酮苷
对照品（批号 111920-201203）、芒柄花素对照品（批
号 111703-200602），中国食品药品检定研究院；纤
维素酶、果胶酶、木聚糖酶，甘肃华羚生物科技有
限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 测定方法的建立
2.1.1 色谱条件 [5] 色谱柱为 Theromo BDS
Hypersil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波
长 260 nm；柱温 25 ℃；体积流量 1.0 mL/min；进
样量 10 µL；流动相为乙腈-0.3%甲酸水溶液，梯度
洗脱程序为 0～12 min，20%～37%乙腈；12～16
min，37%～40%乙腈；16～22 min，40%～50%乙
腈；22～30 min，50%～80%乙腈；30～35 min，
80%～20%乙腈。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称定毛蕊异黄酮苷
2.39 mg 置于 5 mL 量瓶中，芒柄花素 1.52 mg 置于
10 mL 量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，制得各单
一对照品溶液，分别量取不同体积单一对照品溶液，
混合稀释制成系列浓度混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 按不同工艺条件，分别
向 100 g 黄芪中加入 4 倍量水，再加入一定量的酶
搅匀，于 50 ℃酶解一定时间后加热灭活 10 min，
补水并回流，抽滤，滤液浓缩至每 1 mL 浓缩液相
当于 0.25 g 原药材，精密吸取浓缩液 10 mL，用醋
酸乙酯萃取（20 mL×3），合并醋酸乙酯萃取液，
水浴挥干溶剂，剩余物用甲醇溶解定容至 10 mL 量
瓶中，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，
即得。
2.1.4 线性关系的考察 取“2.1.2”项下混合对照
品溶液，分别精密进样 10 µL，按上述色谱条件测
定峰面积，以峰面积对进样量进行线性回归，得回
归方程：毛蕊异黄酮苷 y＝1 585.8 x＋11.002，线性
范围 23.9～4 780.0 ng，r＝0.999 9；芒柄花素 y＝
3 271.4 x＋8.778 2，线性范围 7.6～1 520.0 ng，r＝
0.999 9。
2.1.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液连续
进样 6 次，毛蕊异黄酮苷、芒柄花素峰面积的 RSD
分别为 0.86%、1.04%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于 0、
2、4、6、8、12、24 h 精密进样 10 µL，毛蕊异黄
酮苷、芒柄花素峰面积的RSD分别为0.47%、0.31%，
表明供试品溶液在 24 h 内稳定。
2.1.7 重复性试验 按“2.1.3”项下依法平行制备
6 份供试品，分别进样 10 µL，毛蕊异黄酮苷、芒柄
花素质量分数的 RSD 分别为 0.96%、0.77%，表明
该方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 取已测定的黄芪药材
（1.25 g）6 份，同法制成供试品溶液，分别精密加
入一定量的对照品（毛蕊异黄酮苷、芒柄花素）。
按“2.1.3”项下方法处理，并按上述色谱条件测定，
计算回收率。毛蕊异黄酮苷、芒柄花素的平均回收
率分别为 99.27%、99.63%，RSD 分别为 1.88%、
1.41%。
2.2 酶使用比例的确定
固定水提取工艺条件（总加水量 18 倍，提取时
间 120 min，提取 3 次），分别考察纤维素酶、果胶
酶和木聚糖酶用量（0、50、100、200、400 mg，
酶解 2 h）对黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素提取量
的影响。结果显示，随着酶用量的增加，毛蕊异黄
酮苷和芒柄花素提取量均不断增大，当纤维素酶用
量为 100 mg、果胶酶与木聚糖酶用量分别为 200 mg
时，二者提取量均达到最高，继续增加酶用量，提
取量均反而下降。因此确定纤维素酶、果胶酶、木
聚糖酶的质量比为 1︰2︰2。
2.3 二次通用旋转组合设计优化试验[6-8]
2.3.1 数学模型的建立与显著性检验 根据单因
素试验结果，确定 3 种酶组成的复合酶用量的零水
平，选定复合酶用量（x1）、酶解时间（x2）、加水
量（x3）和提取时间（x4）4 个因素，以毛蕊异黄
酮苷提取量（y1）和芒柄花素提取量（y2）为指标，
采用 4 元（1/2 实施）2 次通用旋转组合设计优化
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月 ·2643·
黄芪酶解提取工艺，试验设计及结果见表 1，方差
分析见表 2。
根据试验结果计算出拟合方程的各项系数，从
而得到 y1及 y2的回归方程 y1＝0.231 3＋0.032 8 x1＋
0.014 5 x2＋0.013 2 x3－0.001 4 x4－0.012 3 x12－
0.018 1 x22＋0.003 0 x32－0.001 3 x42＋0.005 8 x1x3－
0.005 3 x1x4；y2＝63.298 7＋5.598 5 x1＋3.720 9 x2＋
5.427 2 x3－0.094 2 x4－3.960 2 x12－2.439 9 x22－
5.176 4 x32－2.148 2 x42＋2.233 8 x1x2－2.203 8 x1x3－
1.286 3 x1x4。

表 1 二次通用旋转组合设计试验与结果
Table 1 Design and results of quadratic general rotary unitized method
试验号 x1 / mg x2 / min x3 / 倍 x4 / min y1 / (mg·g−1) y2 / (μg∙g−1)
1 150 (−1) 60 (−1) 15 (−1) 90 (−1) 0.14 34.43
2 150 (−1) 60 (−1) 21 (1) 210 (1) 0.17 50.86
3 150 (−1) 120 (1) 15 (−1) 210 (1) 0.17 37.53
4 150 (−1) 120 (1) 21 (1) 90 (−1) 0.19 51.14
5 350 (1) 60 (−1) 15 (−1) 210 (1) 0.19 44.22
6 350 (1) 60 (−1) 21 (1) 90 (−1) 0.26 54.16
7 350 (1) 120 (1) 15 (−1) 90 (−1) 0.24 58.58
8 350 (1) 120 (1) 21 (1) 210 (1) 0.26 61.05
9 82 (−1.682) 90 (0) 18 (0) 150 (0) 0.15 43.28
10 418 (1.682) 90 (0) 18 (0) 150 (0) 0.25 62.55
11 250 (0) 40 (−1.682) 18 (0) 150 (0) 0.15 49.43
12 250 (0) 140 (1.682) 18 (0) 150 (0) 0.21 65.00
13 250 (0) 90 (0) 13 (−1.682) 150 (0) 0.23 40.06
14 250 (0) 90 (0) 23 (1.682) 150 (0) 0.25 58.89
15 250 (0) 90 (0) 18 (0) 50 (−1.682) 0.22 57.04
16 250 (0) 90 (0) 18 (0) 250 (1.682) 0.23 59.04
17 250 (0) 90 (0) 18 (0) 150 (0) 0.23 62.06
18 250 (0) 90 (0) 18 (0) 150 (0) 0.24 63.47
19 250 (0) 90 (0) 18 (0) 150 (0) 0.22 62.37
20 250 (0) 90 (0) 18 (0) 150 (0) 0.24 63.38

由表 2 结果可知，y1 回归方程的失拟性检验
F1＝1.354 7＜F0.05(5, 3)＝9.01 不显著，说明未知因素
对实验结果干扰很小；显著性检验 F2＝24.630 1＞
F0.01(11, 8)＝5.74 极显著，说明模型的预测值与实测
值拟合很好。单因素中，仅 x4不显著，其他几个因
素的分析均达到了显著水平；剔除 α＝0.10 的不显
著项后得回归方程 y1＝0.231 3＋0.032 8 x1＋0.014 5
x2＋0.013 2 x3－0.012 3 x12－0.018 1 x22。
由表 2 结果可知，y2 回归方程的失拟性检验
F1＝8.675 9＜F0.05(5, 3)＝9.01 不显著，说明未知因素
对实验结果干扰很小；显著性检验 F2＝53.073 2＞
F0.01(11, 8)＝5.74 极显著，说明模型的预测值与实测
值拟合很好。单因素中，仅 x4不显著，其他几个因
素的分析均达到了显著水平；剔除 α＝0.10 的不显
著项后得回归方程 y2＝63.298 7＋5.598 5 x1＋3.720 9
x2＋5.427 2 x3－3.960 2 x12－2.439 9 x22－5.176 4
x32－2.148 2 x42＋2.233 8 x1x2－2.203 8 x1x3。
2.3.2 单因素效应分析 根据试验结果对单因素进
行效应分析，结果见图 1。
由图 1-A 可知，x1对 y1影响最大，其次是 x2，
x4 对 y2影响最小。y1随着各因素（提取时间除外）
取值的增加而增加，当酶解时间编码值达到 0.500
时，y1随酶解时间编码值的增大反而下降。
由图 1-B 可知，x3 对 y2 影响最大，其次是 x1，
x4 对 y2影响最小。随着各因素取值的增加，y2 也随
之增加，当 y2达到最高时，继续增加对应各因素的
取值，y2 反而下降。
2.3.3 y2 的交互作用效应分析 由表 2 方差分析结
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月 ·2644·
表 2 y1 和 y2 方差分析
Table 2 Analysis of variance for y1 and y2
变异来源
y1 y2
平方和 自由度 均方 偏相关 F 值 P 值 平方和 自由度 均方 偏相关 F 值 P 值
x1 0.009 0 1 0.009 0 0.960 7 89.748 5 0.000 1 263.935 4 1 264.830 9 0.959 8 89.976 4 0.000 1
x2 0.001 8 1 0.001 8 0.892 0 18.028 7 0.002 9 117.996 5 1 118.514 2 0.936 8 40.095 7 0.000 2
x3 0.001 5 1 0.001 5 0.854 4 14.668 2 0.004 8 252.699 5 1 251.116 9 0.977 2 85.879 0 0.000 1
x4 0.000 0 1 0.000 0 −0.171 9 0.153 7 0.692 3 0.076 7 1 0.077 1 −0.072 8 0.026 2 0.883 3
x12 0.001 3 1 0.001 3 −0.842 3 13.225 8 0.006 4 135.266 6 1 135.283 0 −0.923 6 46.091 2 0.000 1
x22 0.002 9 1 0.002 9 −0.918 1 29.096 5 0.000 7 52.013 0 1 52.002 2 −0.868 9 17.733 9 0.002 7
x32 0.000 1 1 0.000 1 0.363 7 0.773 8 0.406 3 233.388 5 1 232.843 0 −0.946 1 79.223 1 0.000 1
x42 0.000 0 1 0.000 0 −0.168 4 0.148 6 0.702 5 40.760 6 1 40.687 4 −0.848 9 13.915 3 0.005 6
x1x2 0.000 0 1 0.000 0 −0.074 4 0.028 1 0.875 1 24.892 7 1 24.828 4 0.791 6 8.489 5 0.019 2
x1x3 0.000 2 1 0.000 2 0.500 8 1.654 3 0.236 3 24.429 7 1 24.501 1 −0.793 7 8.337 7 0.020 7
x1x4 0.000 1 1 0.000 1 −0.474 8 1.407 1 0.279 5 8.097 6 1 8.139 4 −0.589 8 2.772 2 0.128 5
回归 0.026 9 11 0.002 5 F2＝24.630 1 0.000 1 1 717.697 0 11 156.291 0 F2＝53.073 2 0.000 1
剩余 0.000 8 8 0.000 1 0.331 7 23.861 2 8 2.977 2
失拟 0.000 6 5 0.000 1 F1＝1.354 7 21.265 1 5 4.264 9 F1＝8.675 9 0.004 2
误差 0.000 2 3 0.000 1 1.475 2 3 0.495 1
总和 0.028 0 19 1 685.893 1 19
x2x3与前面因子 x1x4线性相关，x2x4与前面因子 x1x3线性相关，x3x4与前面因子 x1x2线性相关
There is a linear correlation between x2x3 and x1x4, x2x4 and x1x3, x3x4 and x1x2, respectively



图 1 各单因素与毛蕊异黄酮苷 (A) 和芒柄花素 (B) 提取量的关系
Fig. 1 Relationship of each single factor to extraction amounts of calycosin glucoside (A) and formononetin (B)

果可知，存在交互作用且达到显著水平的有 x1x2和
x1x3，因此仅对此二组交互作用的因素作效应分析。
选取 2 个因素的零水平，考察另 2 个因素的交互作
用，分别作图可以直观地分析各因子间的互作效应，
结果见图 2。
由图 2-A 可以看出，在 x2一定时，增加 x1 即可
提高芒柄花素的提取量，但在不同酶解时间时，其
变化趋势是不同的，当酶解时间较短时，y2 随着酶
用量的增加呈先增大后减小趋势；而当酶解时间延
长时，y2 随着酶用量的增加而迅速增大，当达到最
大值后进一步增加酶用量对 y2的影响较小。两者的
相互影响表明，选取适宜的酶用量和酶解时间可使
芒柄花素的量有较大提高。
由图 2-B 可以看出，y2 随着 x1和 x3的增加而增
加，当达到最大值后，进一步增加酶用量和加水量，
y2 反而逐渐降低。
2.3.4 提取工艺的优化与验证 由试验结果分析可
知，在试验中不但存在着单因素效应，而且还有因
0.25


0.22


0.19


0.16


0.13
y 1
/
(m
g·
g−
1 )
60


50


40


30
y 2
/
(μg
∙g−
1 )
x1
x2
x3
x4
−1.682 −1.341 −1.000 −0.500 0 0.500 1.000 1.341 1.682 −1.682 −1.341 −1.000 −0.500 0 0.500 −1.000 −1.341 −1.682
编码值 编码值
A B
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图 2 酶用量与酶解时间 (A) 和加水量 (B) 交互作用效应
Fig. 2 Interaction effect of enzyme dosage with enzymatic hydrolysis time (A) and additive quantity of water (B)

素间的交互作用，因此很难从单因素效应和交互作
用的结果分析中找到最佳提取条件，且 4 元 2 次回
归的数学模型不存在提取量函数的极大值。本实验
采用频率分析法分别分析各回归模型以找到最佳提
取条件，结果见表 3。
由表 3 可知在 95%的置信区间 y1 大于 0.21
mg/g、y2 大于 53.93 µg/g，鉴于二者提取量并考虑
到实际操作性，将最优提取条件定为复合酶用量
340 mg、酶解时间 110 min、加水量 19 倍、提取时
间 150 min。

表 3 毛蕊异黄酮苷和芒柄花素提取相关各变量取值的频率分布
Table 3 Probability distribution of each relative variable of calycosin glucoside and formononetin
水平
毛蕊异黄酮苷 芒柄花素
x1 x2 x3 x4 x1 x2 x3 x4
次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率
−1.682 0 0.000 0 0 0.000 0 20 0.086 6 46 0.198 8 0 0.000 0 0 0.000 0 0 0.000 0 19 0.133 6
−1.000 0 0.000 0 40 0.173 9 40 0.174 6 46 0.200 8 4 0.028 2 10 0.070 5 21 0.148 4 32 0.225 3
0.000 60 0.261 5 70 0.305 3 50 0.218 7 46 0.200 9 46 0.327 6 39 0.277 4 51 0.364 9 39 0.278 8
1.000 87 0.378 4 71 0.310 6 61 0.267 0 47 0.202 8 51 0.359 8 46 0.328 0 50 0.355 7 31 0.221 4
1.682 85 0.371 3 50 0.217 9 60 0.262 1 46 0.200 6 38 0.269 1 44 0.309 2 17 0.124 3 18 0.131 6
加权均数 0.9751 0.4878 0.3787 0.0000 0.8183 0.7707 0.4161 0.0000
标准误 0.0421 0.0605 0.0741 0.0823 0.0615 0.0668 0.0687 0.0904
95%置信区间 0.906～1.076 0.377～0.615 0.234～0.525 −0.160～0.160 0.685～0.926 0.664～0.934 0.290～0.564 −0.182～0.182
提取条件 340.6～357.6 101.3～108.5 18.7～19.6 140.4～159.6 318.5～342.6 109.9～118.0 18.9～19.7 139.1～160.9

按照上述提取工艺共 5 批，依法对优化所得工
艺进行验证，按“2.1.3”项下方法进行检测，结果
毛蕊异黄酮苷、芒柄花素的平均提取量分别为 0.25
mg/g、67.95 µg/g，RSD 分别为 1.58%、1.29%。结
果与预测值（0.26 mg/g、68.44 µg/g）接近。
3 讨论
黄酮是黄芪所含的一类小分子活性物质，鉴于
游离黄酮与黄酮苷在水中的溶解度相差较大，本实
验同时选芒柄花素和毛蕊异黄酮苷为指标成分，考
察酶解提取工艺各因素对 2 种物质提取量的影响。
由于所选 2 种黄酮类物质的溶解性相差较大，因
此，所得工艺条件对黄酮类物质的提取有较高的参
考价值。
二次通用旋转组合设计具有旋转性，因其一致
精度和需要较少的试验次数等优点而有利于提取工
艺条件的优化，但考虑到其能容纳的因素数有限，
本实验首先采用单因素法对纤维素酶、木聚糖酶、
果胶酶的比例进行了确定，在此基础上进行的工艺
优化则更简便有效。此外，由于 3 种酶的最适酶解
温度均为 50 ℃，最适 pH 均与黄芪水提液的 pH 较
接近，因此本实验不再对其进行考察。
单因素试验中，2 种物质的提取量均随着酶用
70
50
30
50
70
30
y 1
/
(μg
·g
−1
)
70
50
30
70
50
30
A B
−1.000
0
1.000
−1.000
0
1.000
−1.000
0
1.000
−1.000
0
1.000
酶用量 / mg 酶用量 / mg
酶解时间 / min 酶解时间 / min
y 2
/
(μg
·g
−1
)
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 18 期 2014 年 9 月 ·2646·
量的增加而提高，这是因为加入的酶破坏了黄芪植
物细胞壁的致密结构，使芒柄花素更易从细胞内释
出，从而提高了其提取量。当提取量达到最大值后，
继续增加酶用量，提取量均反而下降，其机制有待
进一步研究。本实验优化工艺的实验值与数学模型
在相同取值下的计算值基本吻合，表明所建立的数
学模型具有较好的预测性。
参考文献
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