全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 18期 2015年 9月 ·2755·

基于最小二乘回归分析法的雷公藤多苷片免疫抑制作用谱效关系研究
池 婕 1, 2，林 兵 1#，刘志宏 1，杨丽娜 1，宋洪涛 1*
1. 南京军区福州总医院 药学科，福建 福州 350025
2. 厦门大学医学院 基础医学系，福建 厦门 361102
摘 要：目的 初步探讨雷公藤多苷片免疫抑制作用及其 HPLC 指纹图谱间的相关性。方法 采用 HPLC 建立 7 个厂家生
产的雷公藤多苷片醋酸乙酯提取物的指纹图谱，选择刀豆蛋白 A（Con A）刺激的小鼠脾淋巴细胞模型进行免疫抑制药效学
研究，分别考察雷公藤多苷片对小鼠脾淋巴细胞增殖以及细胞因子 γ 干扰素（IFN-γ）分泌的影响；采用偏最小二乘回归分
析法分析谱效关系。结果 建立了 7个厂家生产的雷公藤多苷片的 HPLC指纹图谱，从 HPLC指纹图谱中提取出 18个能够
表征差异的特征峰。药效研究结果显示不同厂家生产的雷公藤多苷片均可显著抑制 Con A 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖和
IFN-γ 的分泌（P＜0.05）。偏最小二乘回归法分析结果显示，以抑制小鼠脾淋巴细胞增殖 IC50值为药效指标时第 1、2、6、7、
17、18号峰为药效峰；以 IFN-γ 分泌抑制率为指标时，第 1、2、6、7、8、9、12、13号峰为药效峰。结论 第 1、2、6、7、
8、9、12、13、17、18号峰所代表的化合物可能为雷公藤多苷片中发挥免疫抑制主要有效成分。
关键词：雷公藤；雷公藤多苷片；指纹图谱；谱效关系；免疫抑制；偏最小二乘回归分析法
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)18 - 2755 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.18.015
Spectrum-effect relationship of immunosuppressive activity of Leigongteng
Duogan Tablet based on partial least squares regression analysis
CHI Jie1, 2, LIN Bing1, LIU Zhi-hong1, YANG Li-na1, SONG Hong-tao1
1. Department of Pharmacy, Fuzhou General Hospital of Nanjing Command PLA, Fuzhou 350025, China
2. Department of Basic Medicine, Medical College of Xiamen University, Xiamen 361102, China
Abstract: Objective To investigate the immunosuppressive components in Leigongteng Duogan Tablet (LDT). Methods High
performance liquid chromatography (HPLC) was applied to establish the fingerprint for LDT from seven manufactures. The
immunosuppressive effect of LDT was observed on Con A-induced mice spleen cells, and the cell proliferation and contents of IFN-γ were
recorded. Then the partial least squares regression (PLSR) analysis was used to investigate its spectrum-effect relationship. Results The
HPLC fingerprint for LDT from seven manufactures was established, and 18 characteristic peaks were confirmed. The in vitro cell
experimental results showed that the proliferation of mice spleen cells and secretion of IFN-γ were inhibited by all LDT significantly
compared with the control group. According to the results of PLSR, No. 1, 2, 6, 7, 17, and 18 peaks were strongly related to the
proliferation inhibition of mice spleen cells and No. 1, 2, 6, 7, 8, 9, 12, and 13 peaks were related to the secretion of IFN-γ. Conclusion
The No. 1, 2, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 17, and 18 peaks are the principal immunosuppressive substances in LDT.
Key words: Tripterygium wilfordii Hook. f.; Leigongteng Duogan Tablet; fingerprint; spectrum-effect relationship; immunosuppression;
partial least squares regression analysis

雷公藤多苷片是由卫矛科雷公藤属植物雷公藤
Tripterygium wilfordii Hook. f. 干燥去皮的根经提
取、纯化后制成的药物制剂，有显著的抗炎、免疫
抑制作用，临床上多用于类风湿关节炎、肾病综合
证等疾病的治疗[1-3]。雷公藤多苷片临床上疗效显
著，但多发的毒副作用不容忽视。

收稿日期：2015-05-07
基金项目：福建省科技计划重大项目（2012I1001）
作者简介：池 婕，硕士研究生，研究方向为中药药理学。Tel: (0591)22859972 E-mail: 1324867045@qq.com
林 兵，男，博士，主管药师，研究方向为中药药理学。Tel: (0591)22859972 E-mail: yaoxuelinhao@163.com
*通信作者 宋洪涛，男，博士，主任药师，博士生导师，主要从事药剂学和临床药学方面的研究。
Tel: (0591)22859459 E-mail: sohoto@vip.163.com
#并列第一作者
·2756· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 18期 2015年 9月

指纹图谱现已成为国际公认的控制中药或天
然药物质量最有效的方法之一。结合药效数据，可
以使指纹图谱中化学成分体现出相应的药效，而且
还能够阐明指纹图谱特征与药效的相互关系，确定
相应的药效物质基础。本研究拟建立 7个厂家生产
的雷公藤多苷片的指纹图谱，并用偏最小二乘回归
分析法，分析各雷公藤多苷片对小鼠脾淋巴细胞增
殖抑制作用以及细胞因子 γ 干扰素（IFN-γ）分泌抑
制率与其指纹图谱之间关系，以期初步确定与免疫
抑制作用药效有关的物质基础，为深入研究雷公藤
多苷片药效物质基础及建立全面可靠的质量控制
方法提供科学依据。
1 仪器与材料
Agilent 1200 型快速高效液相色谱仪，安捷伦公
司；Agilent XDB-CN色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），
安捷伦公司；KQ-800KDE型超声波清洗器，上海超声
波仪器有限公司；Sep-pak中性氧化铝柱，Waters公司；
Model 680型酶联免疫检测仪，Bio-rad公司；UV-2501
型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司。乙腈、甲醇
（色谱纯）、刀豆蛋白A（Con A），美国 Sigma公司；
CCK-8 试剂盒，上海翊圣生物科技有限公司；小鼠
IFN-γ 试剂盒，上海西塘生物技术有限公司；小鼠淋巴
细胞分离液，北京达科为生物技术有限公司；0.4%台
盼蓝染色液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI
1640培养基、胎牛血清，美国Gibco公司。
雷公藤多苷片分别购买自 A（湖南协力药业有
限公司，批号 120905）、B（湖北黄石制药有限公司，
批号 120917）、C（福建汇天生物药业有限公司，批
号 20120802）、D（上海复旦药业有限公司，批号
20120901）、E（浙江普洛天然药物有限公司，批号
120502）、F（江苏美通制药有限公司，批号 21202）、
G（安徽新陇药业有限公司，批号 120601）7个厂家。
对照品雷公藤甲素（质量分数≥ 99%，批号
111567-200502，中国食品药品检定研究院）、雷公藤
内酯酮（质量分数≥98%，批号 14022521，南京泽
朗医药科技有限公司），雷公藤次碱（南京景竹生物
科技有限公司，批号 14082933，质量分数≥99%）。
Balb/c小鼠，雄性，体质量 20～25 g，由南京
军区福州总医院比较医学科提供，许可证号 SCXK
（沪）2012-0002。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取雷公藤多苷片适量，研细，精密称取 0.2 g，
加醋酸乙酯 30 mL，超声提取 10 min，放冷，滤过，
取 15 mL滤液用中性氧化铝柱纯化，收集流出液。
再用 2倍柱体积醋酸乙酯洗脱，收集洗脱液，合并
流出液和洗脱液，氮气吹干，残渣用 2 mL甲醇溶
解，过 0.22 μm滤膜，得雷公藤多苷片提取物，即
指纹图谱所需的供试品溶液。
2.2 对照品溶液的制备
取雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱适
量置于 10 mL量瓶中，加乙腈溶液溶解并稀释至刻
度，制得混合对照品溶液。
2.3 细胞药效实验样品的制备
按“2.1”项下方法制备雷公藤多苷片提取物，
DMSO溶解，按一定比例用无血清 RPMI 1640培养
基稀释，0.22 μm 滤膜滤过除菌，即得不同质量浓
度雷公藤多苷片提取物样品溶液。
2.4 雷公藤多苷片提取物 HPLC指纹图谱的建立
2.4.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent XDB-CN 柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-
水（B）；梯度洗脱：0～15 min，25%～32% A；15～
35 min，32%～42% A；35～56 min，42%～82% A；
检测波长为 218 nm；柱温为 30 ℃；体积流量为 1.0
mL/min；进样 10 μL，记录 60 min色谱图。
2.4.2 方法学考察 对实验方法进行精密度、稳定
性、重复性考察，结果指纹图谱相似度 RSD 均小
于 5%，符合分析要求。
2.4.3 HPLC指纹图谱 按“2.4.1”项下色谱条件，
吸取供试品溶液和对照品溶液各 10 μL进行分析，
得到 7 个厂家生产的雷公藤多苷片指纹图谱。从 7
个 HPLC图谱中确定了 18个特征峰（图 1），通过
与对照品比对，鉴定其中 1、3、18 号峰分别为雷
公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱。
2.5 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
按文献方法[4]制备小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓
度为 5×106/mL，于 96孔细胞培养板上每孔加入细胞
悬液 100 μL。实验共设药物组、模型组、对照组及空
白对照组，具体处理如下：药物组加入Con A（终质
量浓度 3 μg/mL）10 μL 和不同质量浓度的雷公藤多
苷片提取物（终质量浓度分别为 17.00、8.50、4.25、
2.13、1.06 μg/mL）10 μL；模型组加入Con A（终质
量浓度 3 μg/mL）10 μL 和含适量DMSO（使DMSO
终体积分数小于 0.2%）的无血清 RPMI 1640培养基
10 μL；对照组加入含适量DMSO的无血清RPMI 1640
培养基 10 μL；再加入完全培养基至 200 μL，另设空
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 18期 2015年 9月 ·2757·

白对照组（不加细胞，其他处理同对照组）。每组设 6
个复孔，于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 48 h，实验
结束前 4 h加入CCK-8试剂 10 μL，结束后使用酶标
仪在 450 nm处检测吸光度（A）值，计算细胞增殖抑
制率［抑制率＝1－(A 对照－A 空白)/(A 药物－A 空白)］；使用
SPSS 17.0软件处理数据，计算各厂家雷公藤多苷片提






1-雷公藤甲素 3-雷公藤内酯酮 18-雷公藤次碱
1-triptolide 2-triptonide 18-wilforine
图 1 不同厂家雷公藤多苷片供试品 (a) 及混合对照品 (b)
HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC fingerprints of LDT (a) and mixed reference
substances (b)
取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的半数抑制浓度（IC50）
值。结果表明，与模型组比较，在 2.13～17.00 μg/mL
时，所有厂家雷公藤多苷片提取物对小鼠脾淋巴细胞
的增殖均有显著抑制作用（P＜0.05），并呈剂量依赖
性；A～G 7个厂家生产的雷公藤多苷片提取物对小
鼠脾淋巴细胞增殖的 IC50值（n＝6）分别为（3.86±
0.09）、（17.43±0.19）、（6.35±0.16）、（13.45±0.13）、
（10.56±0.11）、（3.70±0.08）、（11.25±0.12）μg/mL。
其中A和F厂家生产的雷公藤多苷片提取物对小鼠脾
细胞增殖抑制作用最强，B 厂家生产的雷公藤多苷片
提取物对小鼠脾细胞增殖抑制作用相对较弱。
2.6 对小鼠脾淋巴细胞分泌 IFN-γ的影响
按文献方法[4]制备小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓
度为 1×107/mL，于 96孔细胞培养板上每孔加入细
胞悬液 100 μL。实验分组及处理同“2.5”项，其中
药物组加入雷公藤多苷片提取物的终质量浓度分别
为 4.25、2.13、1.06 μg/mL，每组设 6个复孔，于 37 ℃、
5% CO2培养箱中培养 48 h，吸出上清，使用 ELISA
试剂盒检测 IFN-γ 的量。结果见图 2。由结果可知，
模型组 IFN-γ 的量显著高于对照组，为对照组的 26
倍，说明造模成功。给予 4.25、2.13、1.06 μg/mL雷
公藤多苷片提取物处理后，均显示出对 IFN-γ 具有
显著的抑制作用，且呈剂量依赖性，但不同厂家生
产的雷公藤多苷片对 IFN-γ 的抑制作用存在差异。



与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs model group
图 2 7个厂家生产的雷公藤多苷片提取物对 ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞分泌 IFN-γ的影响 ( x±s, n = 6)
Fig. 2 Effect of LDT extracts in LDT from seven manufactures on secretion of IFN-γ in mice spleen cells induced by Con A ( x±s, n = 6)
2.7 谱效关系的偏最小二乘回归分析
由指纹图谱可知不同厂家雷公藤多苷片中所
含成分种类和量不同，而体外实验结果显示不同厂
家生产的雷公藤多苷片在免疫抑制药效方面也存
在着差异，为了明确成分的差异与药效差异是否有
关联，进一步采用偏最小二乘回归分析进行谱效关
系分析，探讨各色谱峰与药效的关系。
偏最小二乘法采用成分提取的方法，是同时对
因变量和自变量进行主成分分解，并从中提取成
分，使两者的协方差达到最大，然后选择因子参与
建模，最终转换成包含所有原始变量的回归方程[4]。
得到的回归系数的正负表明自变量与因变量是正
相关或负相关，回归系数绝对值的大小表明自变量
对因变量贡献的大小。
a

b

1

2 3
4
5

6

7

8 9
10
11

12

13

14

15

16

17
18

1

18
3

0 10 20 30 40 50 60
t/min

A
B
C
D
E
F
G
IF
N
-γ/
(p
g·
m
L−
1 )
150
100
50
0
对照
雷公藤多苷片提取物 4.25 μg·mL−1
雷公藤多苷片提取物 2.13 μg·mL−1
雷公藤多苷片提取物 1.06 μg·mL−1
模型
A B C D E F G
**

**

*

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·2758· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 18期 2015年 9月

2.7.1 指纹图谱与细胞增殖抑制 IC50值的相关分析
以标准化处理的指纹图谱中各特征峰峰面积为 X、
以雷公藤多苷片提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的
IC50 值为 Y，采用偏最小二乘法进行相关分析，得
到 18 个色谱峰的回归系数。其中系数绝对值反映
色谱峰对 IC50贡献的大小，回归系数绝对值越大，
说明相关性越大；回归系数的符号反映与 IC50相关
性，由于 IC50与药效是负相关，因此回归系数为负
的峰是对药效有贡献的色谱峰。拟合出指纹图谱中
各共有峰峰面积与 IC50 值之间的回归方程：Y＝
−0.35 X1－0.54 X2＋0.17 X3－0.01 X4＋0.11 X5－0.33
X6－0.16 X7－0.08 X8－0.004 X9＋0.04 X10＋0.16 X11＋
0.25 X12＋0.04 X13＋0.002 X14－0.02 X15＋0.06 X16－
0.21 X17－0.26 X18。由此得出第 1、2、4、6、7、8、
9、15、17、18号峰是药效峰，其中第 4、8、9、15
号峰系数绝对值太小，故删去。因此与 IC50值有关
的主要药效峰为第 1、2、6、7、17、18号峰。
2.7.2 指纹图谱与 IFN-γ 抑制率的相关分析 以标
准化处理的指纹图谱中各特征峰峰面积为 X、雷公
藤多苷片提取物对小鼠脾淋巴细胞 IFN-γ 的抑制
率为 Y，采用偏最小二乘法进行相关分析，拟合出
指纹图谱中各共有峰峰面积与 IFN-γ 抑制率之间
的回归方程为 Y＝0.37 X1＋0.37 X2－0.21 X3＋0.03
X4－0.12 X5＋0.14 X6＋0.15 X7＋0.21 X8＋0.10 X9－
0.15 X10－0.3 X11＋0.29 X12＋0.16 X13－0.31 X14－0.16
X15－0.13 X16－0.08 X17＋0.04 X18。由于 IFN-γ 抑制
率与药效是正相关，即 IFN-γ 抑制率越大，说明雷
公藤多苷片的免疫抑制作用越强。因此对药效有贡
献的峰应当是回归系数为正数的峰，第 1、2、4、6、
7、8、9、12、13、18 号峰回归系数为正，即为药
效峰。另第 18 号峰系数过小，故不予考虑。因此
与抑制 IFN-γ 有关的主要药效峰为第 1、2、6、7、
8、9、12、13号峰。
3 讨论
本研究建立了 7个厂家生产的雷公藤多苷片的
指纹图谱。发现不同厂家的雷公藤多苷片指纹峰数
量与峰面积均不同，提示不同厂家生产的雷公藤多
苷片成分差异显著。
本研究选择偏最小二乘法分析雷公藤多苷片色
谱峰面积与免疫抑制药效之间的关系。该方法集多
元线性回归分析、典型相关分析和主成分分析的基
本功能于一体，在一个算法下，同时通过主成分分
析实现数据简化，通过典型相关分析分析变量间的
相关关系，使用多元线性回归建立回归模型，能够
较为准确地给出各色谱峰与药效的相关性以及贡献
大小，能够最大限度地利用数据信息，具有预测精
度较高以及模型易于解释等特点，能够体现中药成
分对药效指标的综合作用，具有较强的可操作性和
稳定性[5]，是构建中药谱效关系的一种有效方法。
雷公藤多苷片通过诱导淋巴细胞凋亡、抑制炎
性细胞因子的释放等发挥免疫抑制作用，治疗自身
免疫疾病[6-8]。本研究选择 Con A刺激的小鼠脾淋巴
细胞模型考察不同厂家生产的雷公藤多苷片的免
疫抑制作用，在 1.06～17.00 μg/mL 内，雷公藤多
苷片提取物可显著抑制小鼠脾淋巴细胞增殖。根据
谱效分析结果，雷公藤多苷片中与小鼠脾淋巴细胞
增殖抑制 IC50值有关的色谱峰为 1、2、6、7、17、
18号峰。而与抑制 IFN-γ 分泌有关的色谱峰为第 1、
2、6、7、8、9、12、13号峰，1、2、6、7为对小
鼠脾淋巴细胞增殖和 IFN-γ 分泌均有关的色谱峰，
这些色谱峰可能为雷公藤多苷片发挥免疫抑制作
用的主要有效成分，其中第 1号峰通过对照品鉴定
为雷公藤甲素。本研究初步探索了雷公藤多苷片指
纹图谱与免疫抑制药效的关系，为研究雷公藤药效
物质基础提供了科学依据，但具体发挥免疫抑制作
用的药效成分尚未阐明，仍需深入研究，以便更好
地控制雷公藤多苷片的质量。
参考文献
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