全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 24 期 2014 年 12 月

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甜叶菊甲基磺酸乙酯离体诱变及耐盐变异体的 SRAP 检测
周玉丽 1，崔广荣 2*，胡能兵 2，何克勤 2，林 平 2，舒英杰 2
1. 安徽科技学院生命科学学院，安徽 凤阳 233100
2. 安徽科技学院农学院，安徽 凤阳 233100
摘 要：目的 建立甜叶菊甲基磺酸乙酯（EMS）离体诱变体系，通过 SRAP 检测鉴定获得甜叶菊耐盐突变体。方法 将
“皖甜 1 号”-B1 甜叶菊组培苗茎段接种在含有不同质量浓度 NaCl 的 MS 培养基中，进行耐盐临界 NaCl 质量浓度的筛选；
用不同浓度的 EMS 处理甜叶菊组培苗茎段不同时间，筛选 EMS 诱变甜叶菊的适宜浓度和时间；将经过 EMS 诱变过的甜叶
菊组培苗茎段接种在含有临界 NaCl 质量浓度的 MS 培养基上进行耐盐变异体的筛选，对存活的变异株通过 SRAP 标记进行
耐盐性鉴定。结果 甜叶菊组培苗耐盐临界 NaCl 质量浓度为 1.0%；EMS 诱变甜叶菊组培苗茎段的适宜浓度和时间范围为
0.8%～1.0% EMS 处理 8～10 h；筛选出 41 株甜叶菊耐盐变异株，SRAP 分子标记表明，4 株在 DNA 水平上发生了变异，突
变比率为 9.76%。结论 初步建立了甜叶菊 EMS 离体诱变体系，为甜叶菊高产耐盐新品种的选育提供了一种新的育种途径。
关键词：甜叶菊；EMS 诱变；耐盐变异体；SRAP 标记；皖甜 1 号
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)24 - 3612 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.24.021
In vitro mutation induced by ethylmethane sulfonate in Stevia rebaudiana and
SRAP identification of salt-tolerant mutants
ZHOU Yu-li1, CUI Guang-rong2, HU Neng-bing2, HE Ke-qin2, LIN Ping2, SHU Ying-jie2
1. College of Life Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China
2. College of Agronomy, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China
Abstract: Objective The in vitro mutation system of Stevia rebaudiana induced by ethylmethane sulfonate (EMS) was established , and
the salt-tolerant mutants were identified by SRAP. Methods S. rebaudiana plantlets were inoculated on MS media containing NaCl with
different concentration to screen the salt-tolerant critical concentration. Plantlets were treated with EMS at different concentration and for
different time periods, and EMS mutagenized stems were inoculated on MS medium containing critical NaCl concentration to screen the
tolerant variants by SRAP markers. Results The critical salt concentration of S. rebaudiana plantlets was 1.0%, and the suitable
concentration and time of EMS were 0.8%—1.0% and 8—10 h. Among the screened 41 S. rebaudiana tolerant mutants by SRAP
molecular markers, four were mutated at DNA level, and the mutation rate was 9.76%. Conclusion The in vitro mutagenesis system of S.
rebaudiana with EMS has been established, which provides a new breeding way for high-yield salt-tolerant S. rebaudiana.
Key words: Stevia rebaudiana Bertoni; EMS mutagenesis; salt-tolerant mutant; SRAP marker; S. rebaudiana plantlets

甜叶菊 Stevia rebaudiana Bertoni 又名“甜菊”、
“甜草”，菊科甜叶菊属，原产南美洲巴拉圭的
Amambay 及 Mbaxacayu 山脉[1]，甜叶菊糖苷有控
制血糖、降低血压、促进新陈代谢的作用，具有治
疗糖尿病、肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳之功
效[2-3]，可用于医药工业作矫味剂和辅料，因此，甜
叶菊逐渐成为医药领域研究和开发的热点。但甜叶
菊是一种盐敏感植物，土壤的盐碱化对甜叶菊的生
长及品质影响较大，而我国的耕地随着化肥的大量
使用盐碱化现象越来越严重，因而选育耐盐性强、
适应性广的甜叶菊新品种就显得尤为重要。鉴于常
规育种周期长，加之甜叶菊属于异花授粉植物，不
利于杂交种后代的纯合及优良品种的防杂保纯，采
用诱变与组织培养技术相结合的离体化学诱变方法
可以提高突变频率，因此化学诱变不失为甜叶菊育
种中一种行之有效的技术手段。

收稿日期：2014-04-19
基金项目：安徽科技学院自然科学基金项目（ZRC2013379）；安徽省甜叶菊工程技术研究中心建设项目
作者简介：周玉丽（1975—），女，甘肃敦煌人，硕士，实验师，主要从事园艺植物生物技术研究和实验室管理工作。E-mail: zhouyuli051010@163.com
*通信作者 崔广荣，教授，硕士生导师。E-mail: cuigr64@sina.com
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作为一种应用较多的化学诱变剂，甲基磺酸乙
酯（EMS）在植物诱变育种中得到广泛的应用[4]。通
过组织培养技术有目的筛选耐盐变异体是获得耐盐
品种的有效途径之一，目前人们已在多种植物中通
过离体培养筛选耐盐突变体获得成功，如番茄[5]、草
莓[6]、百合[7]、猕猴桃[8]等。国内外有关甜叶菊组织
培养方面的研究已开展了 30 多年，无论在理论上还
是技术上都取得了长足发展[9]，但有关甜叶菊 EMS
离体诱变的研究尚未见报道。本研究以甜叶菊无菌
组培苗带腋芽（腋芽未萌发）茎段为试验材料，以
EMS 为诱变剂进行耐盐变异体的诱变和筛选，并通
过相关序列扩增多态性（sequence-related amplified
polymorphism，SRAP）标记进行鉴定，以期为甜叶
菊耐盐突变体的应用提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为安徽科技学院农学组培室提供的甜
叶菊“皖甜 1 号”组培苗。化学诱变剂 EMS 无色
油状透明液体为美国 Sigma 公司生产。本实验基本
培养基为 MS 培养基，诱变培养基采用 MS＋蔗糖
30 g/L＋琼脂 5.5 g/L 的普通培养基。培养条件为温
度（25±2）℃，光照 2 000～4 000 lx、14 h/d，相
对湿度 60%左右。
1.2 方法
1.2.1 甜叶菊组培苗耐盐性适宜 NaCl 浓度的筛选
配制含 NaCl 为 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%
和 1.2%的 MS 培养基，将生长良好的甜叶菊组培
苗，接种于上述培养基中。40 d 后观察甜叶菊组培
苗生长状况，统计甜叶菊的存活率和生根率，以存
活率 0～10%为甜叶菊耐盐性筛选的临界浓度[10]。
1.2.2 甜叶菊 EMS 诱变适宜浓度和时间的筛选
取生长健壮的甜叶菊组培苗，剪去叶片，剪成含 2
个腋芽的茎段（长 1～1.5 cm），置于装有不同质量
分数 EMS（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和
1.2%）的无菌三角瓶中，在转速为 60 r/min 的摇床
上分别浸泡 2、4、6、8、10、12 h，共 42 个处理。
处理完毕后用无菌水冲洗 4～5 次、无菌滤纸吸干表
面水分，接种于 MS 培养基上，每处理 9 瓶，每瓶
4 个外植体，接种 45 d，考察组培苗的存活率，选
成活率约为 50%时的处理时间和质量分数为 EMS
适宜的诱变质量分数和时间。
1.2.3 甜叶菊耐盐变异体的筛选 在筛选出甜叶
菊 EMS 诱变适宜的时间和质量分数基础上，建立
约含 300 个左右腋芽的诱变群体。将腋芽剪下接种
于含 1.0% NaCl 的 MS 培养基上进行耐盐性变异体
的初步筛选。接种 45 d 观察甜叶菊组培苗生长状
况，并将存活的单株编号，继代培养后用于后续的
SRAP 分子鉴定。
1.2.4 甜叶菊耐盐变异体的 SRAP 分子鉴定 将经
诱变后在 1.0% NaCl 质量分数下存活的单株进行扩
繁，用胡能兵等[11]改良的 CTAB 法提取甜叶菊叶片
DNA，通过 SRAP 分子标记对耐盐变异体进行分子
鉴定。首先以未作任何处理的甜叶菊组培苗为材料，
对 36 个引物组合进行引物筛选（引物具体序列见表
1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成），
以条带清晰的 8 对引物（F2R2、F2R5、F3R3、F4R4、
F4R5、F4R6、F5R1 和 F5R4）对 41 个变异株进行
SRAP 检测。SRAP 反应体系为：Taq DNA 聚合酶
（5 U/μL）1.0 μL，10×DNA 缓冲液（含 15 mmol/L
MgCl2）3.0 μL，2.5 mmol/L 的 dNTPs 1.2 μL，DNA
模板 0.5 μL，10 μmol/L 正、反引物各 0.75 μL，双
蒸水 12.8 μL。PCR 反应程序为：94 ℃变性 1 min，
35 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，5 个循环；接
着 94 ℃变性 1 min，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸
1 min，35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保
存。银染方法参照文献方法[12]。
表 1 选用 SRAP 引物代号及序列
Table 1 Code numbers and sequences of Selected SRAP primers
正向引物 序列 (5’→3’) 反向引物 序列 (5’→3’)
F1 TGAGTCCAAACCGGAAA R1 GACTGCGTACGAATTAAA
F2 TGAGTCCAAACCGGAAT R2 GACTGCGTACGAATTAAT
F3 TGAGTCCAAACCGGAAC R3 GACTGCGTACGAATTAAC
F4 TGAGTCCAAACCGGAAG R4 GACTGCGTACGAATTAAG
F5 TGAGTCCAAACCGGATA R5 GACTGCGTACGAATTATA
F6 TGAGTCCAAACCGGATT R6 GACTGCGTACGAATTATT
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2 结果与分析
2.1 甜叶菊组培苗耐盐性临界NaCl 质量分数的确定
由图 1 可知，随着 NaCl 质量分数的升高，甜
叶菊组培苗长势逐渐变弱；当 NaCl 为 0.8%时，
甜叶菊组培苗生长受到明显抑制，植株变矮，叶
片瘦弱并伴有黄化现象，接近培养基的叶片变褐，
部分茎段出现生长缓慢；当 NaCl 增加到 1.0%时，
甜叶菊组培苗停止生长，叶片变小变黄，随着胁
迫时间延长叶片开始脱落，几乎所有植株都不能
生根；当 NaCl 增加到 1.2%时，甜叶菊组培苗全
部出现焦化现象，生长受到绝对抑制，全部死亡，
致死率达 100%。

图 1 不同质量分数 NaCl 处理甜叶菊组培苗生长情况
Fig. 1 Growth situation of S. rebaudiana tissue culturing seedlings under different NaCl concentration
甜叶菊组培苗接种至含有不同 NaCl 质量分
数的 MS 培养基 40 d 统计存活率和生根率。随着
NaCl 处理质量分数的增加，甜叶菊组培苗存活
率和生根率逐渐下降；当 NaCl 质量分数小于
0.4%时，甜叶菊组培苗的存活率与 CK 无显著差
异，NaCl 质量分数大于 0.6%时差异显著；当 NaCl
质量分数小于 0.2%时，甜叶菊组培苗的生根率
与 CK 无显著差异，NaCl 质量分数大于 0.4%时
差异显著；当 NaCl 质量分数为 0.8%时，存活率
（32.50%）和生根率（27.50%）均低于 50%；当
NaCl 质量分数为 1.0%，存活率为 3.13%，生根
率为 0；当 NaCl 质量分数为 1.2%时组培苗全部
死亡。刘艳萌等[10]研究认为，筛选真正的耐盐变
异体，选择压力必须达到足以能够使绝大多数个
体不能正常生长发育，因此，本实验结合甜叶菊
组培苗的长势、存活率、生根率，初步确定甜叶
菊（“皖甜 1 号”）耐盐胁迫的临界 NaCl 质量分
数为 1.0%。
2.2 EMS 诱变甜叶菊组培苗适宜质量分数和时间的
确定
甜叶菊组培苗在 EMS 不同质量分数和处理时
间下的生长情况有很大区别，随着 EMS 质量分数
的增大和处理时间的延长，甜叶菊组培苗长势逐渐
变弱，株高逐渐变小，顶芽和腋芽生长速度较慢；
与未经 EMS 处理的甜叶菊组培苗（CK）相比茎较
细，叶片数量减小，茎叶失绿黄化，甚至死亡。CK
在基本培养基中生长旺盛，苗较粗，叶片肥大，叶
色深绿且有光泽，根较长（图 2-A）；当 EMS 质量
分数超过 0.8%，处理时间超过 8 h 时后，有约一半
的甜叶菊茎段死亡，甜叶菊生长缓慢，叶片黄化（图
2-B～C）；当 EMS 质量分数达到 1.2%和处理时间
为 12 h，甜叶菊茎段全部死亡（图 2-D）。
表 2 为 EMS 处理后的甜叶菊组培苗存活率。由
表 2 可知，低质量分数 EMS、短时间的处理，对甜叶


A-CK B-1.0% EMS, 8 h C-0.8% EMS, 10 h D-1.2% EMS, 12 h
图 2 EMS 处理质量分数和时间组合对甜叶菊组培苗生长的影响
Fig. 2 Effect of combination of EMS concentration and treatment time on growth of S. rebaudiana tissue culturing seedlings
A B C D
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
NaCl / %
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表 2 不同 EMS 质量分数和处理时间对甜叶菊组培苗存活率的影响
Table 2 Effect of different EMS concentration and treatment time on survival rate of S. rebaudiana tissue culturing seedlings
存活率 / % 处理时间 / h
0 0.2% EMS 0.4% EMS 0.6% EMS 0.8% EMS 1.0% EMS 1.2% EMS
2 100.00 96.67 95.00 95.00 95.00 95.00 91.67
4 100.00 98.33 98.33 96.67 93.33 93.33 71.67
6 100.00 96.67 95.00 93.33 91.67 91.67 41.67
8 98.33 95.00 91.67 68.33 68.33 48.33 16.67
10 93.33 93.33 91.67 68.33 51.67 41.67 10.00
12 98.33 86.67 75.00 60.00 43.33 38.33 0.00

菊组培苗存活率影响相对较小，随着 EMS 质量分数
的升高和处理时间的延长，甜叶菊组培苗存活率明显
降低。当 EMS 质量分数在 1.0%以内，处理时间
在 2～6 h，甜叶菊组培苗存活率均保持在 90%以
上；当 EMS 质量分数大于 1.0%，处理时间长于 8
h 或质量分数大于 0.8%，处理时间长于 10 h，甜
叶菊组培苗的存活率均在 50%以下。通常以组培
苗的半致死剂量作为 EMS 处理的最适宜剂量，综
合考虑诱变效果及组培苗的存活率，本实验初步
确定 EMS 诱变甜叶菊（“皖甜 1 号”）组培苗茎段
（带腋芽）的适宜质量分数和时间范围为 0.8%～
1.0% EMS 处理 8～10 h。
2.3 甜叶菊组培苗耐盐变异体的初步筛选
挑选培养 25 d 左右生长健壮的甜叶菊生根组
培苗，剪成长约 1 cm 带腋芽的茎段（剪去叶片），
经 1%～1.0% EMS 处理 8～10 h 后接种在 MS 继
代培养基上，将存活的组培苗继代 3 次后，再接
种在含 1.0% NaCl 的 MS 培养基上进行诱变苗的
耐盐性筛选，反复筛选 3 代后，利用非突变体的
不可遗传性，去除生理适应性甜叶菊苗，存活的
植株即为耐盐变异株。将耐盐变异株接种到 1.0%
NaCl 的 MS 培养基上（处理和对照各接种 300 个
茎段），45 d 统计存活率，经过 EMS 处理过的甜
叶菊茎段存活 41 株，存活率为 13.67%，对照存
活 10 株，存活率为 3.33%。
2.4 甜叶菊耐盐变异体的 SRAP 鉴定
为进一步确定经 EMS 处理后植株的耐盐性，
将经过1.0% NaCl反复筛选出来的41株甜叶菊组培
苗分别编号扩繁后提取 DNA 并进行 SRAP 分子标
记鉴定。图 3 为部分引物对甜叶菊变异株 SRAP 扩
增图谱。在所用的引物对中，F2R2、F4R4、F5R5
可以从 DNA 水平检测突变体，引物 F2R2 可检测出
2 个变异单株，分别为第 16、25 号，与 CK 相比，
16 号单株共缺失 4 条带（箭头所示），但在 100～200
bp 比其他单株多扩增 1 条带，25 号单株则在 1 000
bp 的位置缺失 1 条带。引物 F4R4 能够检测出 3 个
变异单株，分别为 25、32 和 34 号，与 CK 相比，3


图 3 部分引物的甜叶菊变异株 SRAP 扩增图谱
Fig. 3 SRAP amplification map of S. rebaudiana mutants
by several primers
M CK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
M CK 21 22 23 2425 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
1000 bp
500 bp


100 bp

1000 bp
500 bp


100 bp
M CK 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
M CK 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
1000 bp

500 bp




100 bp


1000 bp

500 bp





100 bp
引物F4R4的扩增
引物F2R2的扩增
引物F5R5的扩增
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个单株都是在约 600 bp 处缺失 1 条带。引物 F5R5
能检测出 32 号变异单株，具体表现为在 200～300
bp 和 300～400 bp 处各缺失 1 条带。由此可知，EMS
可以引起甜叶菊组培苗在 DNA 水平发生变异，经
SRAP 分子标记检测，其特征主要表现为部分扩增
带的缺失或增加。基于上述结果，41 株变异株有 4
个单株在 DNA 水平发生了序列的改变，突变率为
9.76%。
3 讨论
3.1 甜叶菊组培苗耐盐临界质量分数的确定
不同植物、不同品种的耐盐性一般存在一个阈
值，这主要是由于基因型和植物起源地的生境所决
定的。研究表明，草莓离体叶片再生植株耐盐的临
界质量分数为 0.8%[10]，猕猴桃组培苗的耐盐阈值为
1.2 g/L[8]，百合组培苗耐盐阈值以 1.0%为宜[13]。本
实验综合考虑不同盐质量分数胁迫下的长势、存活
率和生根率认为，甜叶菊组培苗耐盐阈值为 1.0%较
合适，此结论与在铁皮石斛上研究结果有所不同，
高于铁皮石斛茎叶分化耐盐筛选的临界质量分数为
0.5%[14]。有关不同品种甜叶菊组培苗的耐盐性临界
质量分数的确定还需进一步广泛系统研究。
3.2 甜叶菊组培苗 EMS 诱变适宜质量分数和时间的
确定
目前 EMS 已在多种植物的诱变育种中得到了
广泛应用，并获得了有研究或利用价值的突变体。
但是在药用植物上的应用却相对较少。周立名等[8]
研究表明，当诱变率达 50%致死剂量时，EMS 处
理质量分数为 6%、处理时间为 2 h 时，对猕猴桃
的处理效果最佳。郑文娟等[15]用 EMS 诱变越橘时
表明，诱变处理的最佳组合为 3% EMS 处理 4 h。
薛惠丹等[16]用 EMS 诱变花椒愈伤组织的 LD50 为
0.3% EMS 处理 6 h、0.5% EMS 处理 4 h、0.7% EMS
处理 2 h。从上述的研究结果可知，不同的植物材
料 EMS 诱变适宜质量分数和时间差异较大，一般
即愈伤组织和叶片诱变所需的 EMS 质量分数较小
（0.2%～0.4% EMS）、时间短（2～4 h），茎段和种
子诱变所需的 EMS 质量分数约为 0.6%～1.0%，诱
变时间短 6～10 h。本实验结果表明，随着 EMS
质量分数的升高和处理时间的加长，甜叶菊茎段组
培苗存活率逐渐下降，考虑到高质量分数的 EMS
会对植株造成很大的损伤，综合考虑诱变效果与植
株存活率，本实验最终确定 EMS 诱变甜叶菊（“皖
甜 1 号”）组培苗茎段的适宜质量分数和 LD50 组合
为 0.8%～1.0%EMS 处理 8～10 h。
3.3 甜叶菊组培苗耐盐变异体的分子鉴定
突变体鉴定中目前应用较多的分子标记有随机
扩增多态性 DNA（RAPD）、限制性片段长度多态
性（RFLP）、简单重复系列（SSR）及 SRAP 等，
与其他标记相比，SRAP 标记具有简便、高效、产
率高、高共显性、重复性好、易测序、便于克隆目
标片段的特点，到目前为止，已成功应用于丹参[17]、
灵芝[18]、川续断[19]、忍冬[20]等药用植物的分子鉴定。
本实验 SRAP 标记结果表明，从 41 株存活的甜
叶菊组培苗耐盐变异体中检测出 4 个 DNA 序列
发生改变的单株，单株变异率为 9.75%，高于李彩
华等[21]运用 EMS 在唐菖蒲中的报道，但低于何克
勤等[22]运用 NaN3 在甜叶菊的研究。
由于本研究的主要目的是建立甜叶菊 EMS 离
体诱变体系，并通过 SRAP 鉴定获得甜叶菊耐盐突
变体。为了更全面、系统地鉴定甜叶菊组培苗耐盐
突变体，还需从形态、细胞学以及田间表现等方面
综合鉴定；变异株与非变异株的抗性、解剖结构与
化学成分（糖苷）等的比较是今后研究的重点。
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