全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 24 期 2014 年 12 月 ·3579·

黄连解毒汤醋酸乙酯提取物对白色念珠菌毒力因子的作用
汪天明 1, 2，严园园 1, 2，夏 丹 1, 2，施高翔 1, 2，邵 菁 1, 2，汪长中 1, 2*
1. 安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽 合肥 230038
2. 安徽省中医药科学院 中西医结合研究所，安徽 合肥 230038
摘 要：目的 探讨黄连解毒汤醋酸乙酯提取物（ethyl acetate extract of Huanglianjiedu Decoction，EAHJD）对白色念珠菌毒
力因子的作用。方法 分别采用卵黄培养基法检测磷脂酶（PL）活力、牛奶平板法检测天冬氨酸蛋白酶（Sap）活力、橄榄
油乳化法检测脂肪酶（Lip）活力；水-烃两项测定实验检测细胞表面疏水性（CSH）；RT-PCR 法检测毒力因子相关基因的表
达。结果 EAHJD 对 PL 的活力无影响；1 250 μg/mL EAHJD 可显著抑制 Sap 与 Lip 的活力，312 μg/mL EAHJD 效果次之；
EAHJD 对 CSH 呈现剂量依赖性抑制，CSH1 分别下调了 7.69、3.57、2.95 倍；分泌型酶相关基因在 EAHJD 作用下呈现不同
倍数的变化，其中 PLC1、Sap2、Sap3、Sap9、Lip3、Lip4、Lip6 下调，PLB1、PLC2、Sap10、Lip5 无明显变化。结论 EAHJD
可抑制白色念珠菌毒力因子的活力。
关键词：黄连解毒汤；白色念珠菌；毒力因子；磷脂酶；天冬氨酸蛋白酶；脂肪酶；细胞表面疏水性
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)24 - 3579 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.24.015
Effect of ethyl acetate extract from Huanglian Jiedu Decoction on virulence
factors of Candida albicans
WANG Tian-ming1, 2, YAN Yuan-yuan1, 2, XIA Dan1, 2, SHI Gao-xiang1, 2, SHAO Jing1, 2, WANG Chang-zhong1, 2
1. School of Integrated Traditional and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230038, China
2. Institute of Integrated Traditional and Western Medicine, Anhui Academy of Chinese Medicine, Hefei 230038, China
Abstract: Objective To observe the effects of ethyl acetate extract from Huanglian Jiedu Decoction (EAHJD) on the virulence
factors of Candida albicans. Methods Egg-yolk medium, milk-plate medium, and olive oil emulsification were used respectively to
test the activities of phospholipase (PL), aspartic protease (Sap), and lipase (Lip) of C. albicans. The water-hydrocarbon two-phase
assay was applied to measure the cell surface hydrophobicity (CSH) of C. albicans. qRT-PCR was adopted to observe the expression of
virulence factors related genes. Results EAHJD had no effect on the activity of PL. EAHJD (1 250 μg/mL) could significantly inhibit
the activity of PL and Lip better than that by 312 μg/mL EAHJD. EAHJD could reduce CSH of C. albicans in a dose-independent
manner and CSH1 was down-regulated by 7.69, 3.57, and 2.95 folds by 1 250, 312, and 78 μg/mL EAHJD, respectively. The
expression of secretory enzyme related genes displayed different changing folds: PLC1, Sap2, Sap3, Sap9, Lip3, Lip4, and Lip6 were
down-regulated; PLB1, PLC2, Sap1, Sap10, and Lip5 had no distinct change treated by EAHJD. Conclusion EAHJD could inhibit
the activities of virulence factors of C. albicans.
Key words: ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu Decoction; Candida albicans; virulence factors; phospholipase; aspartic protease;
lipase; cell surface hydrophobicity

白色念珠菌是一种重要的条件致病性真菌，其
毒力因子除了黏附素、菌丝形成及表型转换之外，
还包括磷脂酶（phospholipase，PL）、天冬氨酸蛋白
酶（aspartic protease，Sap）、脂肪酶（lipase，Lip）、
细胞表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）
等[1]。白色念珠菌通过黏附素识别宿主细胞，继而
分泌侵袭性酶促进其在细胞中扩散，同时通过形态
发生及酵母-菌丝相转换使其利于侵入宿主，适应宿

收稿日期：2014-07-29
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81073127）；安徽省自然科学基金项目（1408085MH165）；安徽中医药大学校级科研项目（2014zr026）
作者简介：汪天明（1978—），男，讲师，从事抗真菌研究。E-mail: wtm1818@163.com
*通信作者 汪长中，教授，从事抗真菌研究。Tel: (0551)65169204 E-mail: ahwcz63@sina.com
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主环境，造成白色念珠菌感染。因此，有效抑制毒
力因子的活性成为治疗白色念珠菌感染的有效手
段。本课题组前期研究发现黄连解毒汤醋酸乙酯提
取物（ ethyl acetate extract of Huanglian Jiedu
Decoction，EAHJD）可一定程度抑制白色念珠菌的
早期黏附及菌丝形成[2]，在此基础上，本研究拟进
一步探讨 EAHJD 对白色念珠菌分泌酶等毒力因子
的作用，为黄连解毒汤临床用于抗真菌感染提供重
要的实验依据。
1 材料
1.1 菌株
白色念珠菌 Candida albicans 17 株临床株由第
二军医大学药学院姜远英教授惠赠。
1.2 药物
阳性对照药氟康唑（fluconazole，FLZ）对照
品（中国食品药品检定研究院）；黄连解毒汤按国
家中医药管理局统一组织编审的普通高等类教育
中医类规划教材《方剂学》中的药物组成，具体包
括黄连、黄芩、黄柏和栀子，药材均购于安徽中医
药大学第一附属医院中药房，并经高家荣主任药师
鉴定。使用 80%甲醇 70 ℃回流 2 h 后滤过，收集
滤渣，共重复回流 3 次后，滤液用醋酸乙酯萃取 3
次，萃取液 65 ℃旋转蒸发至结晶干燥，得到
EAHJD。
1.3 试剂
pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS），氨基黑 10B
（Aladdin 公司），冰乙酸（上海化学试剂有限公司），
正辛烷（国药集团化学试剂有限公司），无水乙醇
（上海苏懿化学试剂有限公司），溶壁酶（Sigma 公
司），Total RNA 提取试剂、PCR 反应试剂（日本
ToyoBo 公司），引物（上海生工生物工程有限公司）。
1.4 培养基
RPMI 1640 液体培养基（Gibco 公司），用 1 mol/L
NaOH 溶液调整该液体培养基在 25 ℃的 pH 为 7.0±
0.1，滤过灭菌，4 ℃保存备用。沙氏液体培养基、沙
氏琼脂培养基（青岛高科技海博生物技术有限公司）。
蛋黄培养基（100 mL）：葡萄糖 2.0 g、蛋白胨
1.0 g、营养琼脂 2.0 g、5 mol/L NaCl 20 mL、25
mmol/L CaCl2 20 mL，补蒸馏水至 100 mL，115 ℃
灭菌 30 min，冷却至 50 ℃左右，取新鲜鸡蛋 1 个，
酒精浸泡 30 min后严格无菌操作取出蛋黄液，每 100
毫升上述培养基加入无菌蛋黄 4 mL，充分混匀。
YGM-牛奶培养基（100 mL）：葡萄糖 2.0 g、
酵母粉 0.2 g、KH2PO4 1.0 g、营养琼脂 2.0 g，115 ℃
灭菌 30 min，冷却至 50 ℃左右，加入 1.0%灭菌脱
脂奶粉，充分混匀。
平板筛选培养基（100 mL）：橄榄油 2.0 mL、
蛋白胨 1.0 g、牛肉膏 0.5 g、葡萄糖 0.3 g、聚乙烯
醇（PVA）1.0 g、氯化钠 0.5 g、聚山梨酯 80 0.5 mL、
琼脂 1.5 g、溴百里香酚蓝 0.01 g。
发酵产酶培养基（1 L）：葡萄糖 100 g、蛋白胨
1.8 g、酵母膏 0.5 g、KH2PO4 2.0 g、橄榄油 8.5 mL、
聚山梨酯 804.6 mL。
橄榄油乳化液：取 2.0 g PVA 加热溶解，冷却
定容至 100 mL，橄榄油与 PVA 溶液按 1∶3 混合。
1.5 仪器
16EWRi 游标卡尺（Mahr 公司），DPH—9162
型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），血
细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司），
AB SpectraMax M2e 多功能酶标仪［美谷分子仪器
（上海）有限公司］，KQ5200B 超声波（昆山市超声
仪器有限公司），I7000 荧光定量 PCR 仪（美国生
物应用系统公司）。
2 方法
2.1 菌悬液配制
从 4 ℃保存的沙氏培养平板上挑取单菌落白
色念珠菌，接种至液体沙氏培养液，37 ℃、 200
r/min 过夜培养，离心收集菌体，血细胞计数板计数，
以 RPMI 1640 培养液稀释至 2×107 CFU/mL。
2.2 分泌型酶阳性菌株的筛选及其酶活力测定
2.2.1 分泌型酶阳性菌株的筛选 ①PL 阳性菌株
筛选[3]：取 10 μL 菌悬液滴加于蛋黄培养基表面，
使其呈圆形，37 ℃培养 48 h，菌落周围出现沉淀
圈即为 PL 阳性菌株。②Sap 阳性菌株筛选[4]：取
10 μL 菌悬液滴加于 YGM-牛奶培养基表面，使其
呈圆形，37 ℃培养 72 h 后，再将适量氨基黑染色
液缓慢倾入培养基表面，室温染色 24 h，洗脱液脱
色 15 min，吸去洗脱液，重新加入洗脱液，如此反
复脱色，直至不含蛋白质部分的琼脂褪色为止，底
部出现透明圈即为 Sap 阳性菌株。③Lip 阳性菌株
筛选[5]：取 10 μL 菌悬液滴加于平板筛选培养基表
面，使其呈圆形，37 ℃培养 48 h 后，菌落周围出
现黄色环即为 Lip 阳性菌株。
2.2.2 EAHJD 对酶活力的影响 取充分混匀的蛋
黄、YGM-牛奶、发酵产酶培养基，分别加入终质
量浓度为1 250、312、78 μg/mL EAHJD及256 μg/mL
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FLZ 作为给药组，另设正常培养基为阴性对照组。
各组按“2.2.1”项方法接种菌种，分别培养不同时
间后进行 PL、Sap 和 Lip 酶活力的测定。具体如下：
①PL 活力测定，操作步骤同“2.2.1”项，测定菌落
及沉淀圈直径。②Sap 活力测定，操作步骤同“2.2.1”
项，测定菌落及透明圈直径，结果测定以 Pz 值表
示酶的活力，Pz 值＝菌落直径/总直径（菌落＋菌
落周围圈），Pz 值愈小，酶活力愈强。③Lip 活力测
定，取菌悬液按 10%接种于发酵产酶培养基中，30
℃，160 r/min 摇床培养 16 h，10 000 r/min 离心 10
min 收集菌体，10 mL，pH 6.8 无菌 PBS 冲洗 2 次，
称取 0.5 g 离心压积细胞与 25 mL 无菌 PBS 混合于
冰水中超声破碎（输出功率 500 W，每次辐射时间
6 s，间歇时间 5 s，总时间 5 min），10 000 r/min 离
心 10 min 收集上清液得到粗酶液。取 6 个 100 mL
三角烧瓶，依次标为阴性对照组（只加 95%乙醇 15
mL，38 ℃水浴 5 min）；1 250 μg/mL EAHJD 组；
312 μg/mL EAHJD 组；78 μg/mL EAHJD 组；256
μg/mL FLZ 组；空白对照组。各瓶均加入 4 mL 橄榄
油乳化液与 5 mL pH 6.8 的 0.067 mol/L PBS 混匀，
所有组均加入 1 mL 酶液，立即混匀反应 10 min，除
阴性对照瓶外，其他均加入 15 mL 95%乙醇终止反
应。各瓶均加入 2 滴酚酞，用 0.01 mol/L NaOH 滴定。
计算酶活力（U/g）。
酶活力＝NaOH 消耗量×0.05×40×1 000 / 10
2.3 CSH 的测定[6]
取菌悬液于 6 孔培养板中，加入终质量浓度
为 1 250、312、78 μg/mL EAHJD 及 256 μg/mL FLT，
37 ℃培养 48 h 后，弃去培养基，无菌 PBS 分别刮
取细胞，离心，弃上清，加入沙氏培养基制备成菌
悬液［600 nm 处吸光度值（A600）＝1］，每组取 1.2
mL 置于洁净玻璃管内，加入 0.3 mL 正辛烷，涡旋
混匀 3 min，静置 15 min 两相分离，分离后立即测
定水相 A600，以不加正辛烷测得的 A600作为对照。
计算 CSH。
CSH＝(A600 对照－A600 实验) / A600 对照
2.4 PL、Sap、Lip 相关基因的检测
将标准菌悬液稀释成 2×106 CFU/mL，每孔 1
mL加入 24孔板，然后分别加入终质量浓度为 1 250、
312、78 μg/mL EAHJD 及 256 μg/mL FLZ 各 1 mL 混
匀，37 ℃培养 24 h 后，吸取培养液；3 000 r/min 离
心 5 min，弃上清后用无菌 PBS 洗 3 次。加入溶壁酶
水浴 20 min 后进行 RNA 提取，并调节 RNA 浓度，
使菌体模板量一致。具体操作方法参照 ToyoBo 公司
MagExtractor-RNA 提取试剂说明书进行。
2.4.1 引物的设计与合成 根据 NCBI 基因库查得
所需基因序列，并用Premier 5.0软件设计所需引物，
委托上海生工生物有限公司合成引物，各引物情况
见表 1。
表 1 PCR 反应引物序列
Table 1 Primer sequences of PCR reaction
引物 序列 (5’→3’) 长度 / bp
CSH1-F ATTCATCTCCATGCAAAGTC 20
CSH1-R ACCACCGTTTGGAGACCAAG 20
PLB1-F GCAATACCATTACCCTGTG 19
PLB1-R GCAATACCATTACCCTGTG 19
PLC1-F TGATGTTGCTATTGCTGGT 19
PLC1-R TGATGTTGCTATTGCTGGT 19
PLC2-F GAATTTGCCGTGAATAACC 19
PLC2-R GAATTTGCCGTGAATAACC 19
Sap1-F GGTTGACCGTTAGCGTAGC 19
Sap1-R GGTTGACCGTTAGCGTAGC 19
Sap2-F GTGGCAGCATCTGGAGAAT 19
Sap2-R GTGGCAGCATCTGGAGAAT 19
Sap3-F GAGAATCAGGAACCCATAA 19
Sap3-R GAGAATCAGGAACCCATAA 19
Sap9-F CCTCGTCGGTTTCTATGGT 19
Sap9-R CCTCGTCGGTTTCTATGGT 19
Sap10-F TTACAACGAAGACCACCAG 19
Sap10-R TTACAACGAAGACCACCAG 19
Lip3-F TAATCCCAAACGCACTAAA 19
Lip3-R GAGCAATCCATAACCCTGT 19
Lip4-F TGCTGCTTTAGGTGGATTT 19
Lip4-R CTGTTTGTCGGTGTCGTTT 19
Lip5-F TCTATCACTGGTGGGTTCA 19
Lip5-R GAAGAGCATAGGAAGGAGC 19
Lip6-F AGCCACCCAGCCAAGATGA 19
Lip6-R TTCCGACCTGACCAAGAGC 19
actin-F TTGATTTGGCTGGTAGAG 18
actin-R ATGGCAGAAGATTGAGAA 18

2.4.2 反转录为 cDNA 6 μL RNA 变性后加入试
剂 [4×DNA Master（55 μL）和 gDNA Remover（1.1
μL）] 2 μL，37 ℃水浴 5 min 后加入 5RT-Master
MixII 2 μL 混合后 50 ℃、5 min；98 ℃、5 min；4
℃、1 min 反转录。反应完成后将 cDNA 稀释 10 倍
备用。
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2.4.3 实时荧光定量PCR反应 配制 25 μL总反应
体系：2×SYBR Green Realtime PCR 12.5 μL，PCR
正、反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，cDNA 0.5 μL，
ddH2O 10 μL。反应条件：95 ℃预变性 60 s；扩增
定量程序 40 个循环，循环参数：变性 95 ℃、15 s；
退火 55 ℃、15 s；延伸 72 ℃、45 s；熔解曲线：
60～95 ℃，加热速率为 0.1 ℃/s。内参基因为 actin。
每个样品均设置 3 个重复，重复实验 2 次。
2.4.4 定量分析 实时荧光定量 PCR 分别测定目
的基因及内参的 Ct 值，结果取其平均值。基因表达
水平用倍数变化（2−ΔΔCt）来表示。
2.5 统计学处理
所有数据应用 SPSS 17 统计软件分析处理，计
量资料以 ±x s 表示，组间差异比较采用单因素方差
分析。
3 结果
3.1 分泌型酶阳性菌株筛选结果
3.1.1 PL 阳性菌株 17 株白色念珠菌中，PL 阳性菌
株共 15 株，占 88.2%。其中 PL 活性较高菌株 5 株，
蛋黄培养基上形成较宽的沉淀圈；PL 活性较低菌株
10 株，形成较窄沉淀圈；PL 阴性无沉淀圈。见图 1。

PL 阳性菌株 PL 阴性菌株
图 1 PL 阳性菌株筛选结果
Fig. 1 Screening of PL positive C. albicans strain
3.1.2 Sap 阳性菌株 17 株白色念珠菌中，Sap 阳
性菌株共 13 株，占 76.5%。其中 Sap 活性较高菌株
7 株，透明圈较宽；Sap 活性较低菌株 6 株，透明
圈较窄；Sap 阴性的无透明圈。见图 2。

Sap 阳性菌株 Sap 阴性菌株
图 2 Sap 阳性菌株筛选结果
Fig. 2 Screening of Sap positive C. albicans strain
3.1.3 Lip 阳性菌株 17 株白色念珠菌中，Lip 阳
性菌株共 10 株，占 58.8%。其中 Lip 活性较高菌株
6 株，黄色环较宽；Lip 活性较低菌株 4 株，黄色环
较窄；Lip 阴性的无黄色环。见图 3。
17 株白色念珠菌中 3 种分泌型酶均呈阳性 3
株，占 17.6%。


Lip 阳性菌株 Lip 阴性菌株
图 3 Lip 阳性菌株筛选结果
Fig. 3 Screening of Lip positive C. albicans strain
3.2 EAHJD 对分泌型酶活力的影响
3.2.1 EAHJD 对 PL 分泌的影响 结果发现，用药
组均未能抑制 PL 的分泌，菌落周围仍呈现沉淀圈。
3.2.2 EAHJD 对 Sap 分泌的影响 1 250 μg/mL
EAHJD 作用组，透明圈几乎消失；312 μg/mL
EAHJD 作用组透明圈稍大；78 μg/mL EAHJD 作用
组同空白对照组比较透明圈接近。见表 2。
表 2 EAHJD 对白色念珠菌 Sap 活力的影响 ( ± = 6x s , n )
Table 2 Effect of EAHJD on Sap activity of C. albicans
( ± = 6x s , n )
组别 ρ / (μg·mL−1) Sap 活力（Pz 值）
对照 — 0.21±0.06
EAHJD 78 0.26±0.04
312 0.47±0.12**
1 250 0.93±0.11**
FLZ 256 0.52±0.07**
与对照组比较：**P＜0.01，下同
**P < 0.01 vs control group, same as below
3.2.3 EAHJD 对 Lip 分泌的影响 对照组 Lip 活力
较强，达 104 U/g，EAHJD 从 78 μg/mL 增加至 1 250
μg/mL 时，酶活力依次降至 99、68、23 U/g，256
μg/mL FLZ 作用后酶活力为 55 U/g。见图 4。
3.3 EAHJD 对 CHS 的影响
对照组的细胞 CSH 较高，经 EAHJD 处理后其
CSH明显降低，EAHJD为 78 μg/mL时CHS为 0.92，
随着药物质量浓度迅速升高其 CHS 迅速降低，
EAHJD 为 312 μg/mL 时 CHS 为 0.43，略低于 256
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 24 期 2014 年 12 月 ·3583·




图 4 EAHJD 对白色念珠菌 Lip 活力的影响
Fig. 4 Effect of EAHJD on Lip activity in C. albicans
μg/mL FLZ 作用后的 CSH（0.49），1 250 μg/mL
EAHJD 作用后降至 0.15。见图 5。
3.4 EAHJD 对毒力因子相关基因的影响
检测所有基因发现，随着 EAHJD 质量浓度的
降低，CSH1 分别下调了 7.69、3.57、2.95 倍；分


图 5 EAHJD 对白色念珠菌 CHS 的影响
Fig. 5 Effect of EAHJD on CSH of C. albicans
泌型酶相关基因的表达呈现不同倍数变化，PLC1、
Sap1、Sap2、Sap3、Sap9、Lip3、Lip4、Lip6 表达
均下调，其中 1 250 μg/mL EAHJD 使 Sap2、Lip3
分别下调 8.29、9.24 倍，效果显著；PLB1、PLC2、
Sap10、Lip5 表达无变化。见表 3。
表 3 EAHJD 对白色念珠菌毒力因子合成相关基因表达的影响
Table 3 Effect of EAHJD on expression of virulence factors synthesis related gene of C. albicans
基因相对表达 (2−ΔΔCt)
组别
ρ /
(μg·mL−1) CSH1 PLB1 PLC1 PLC2 Sap1 Sap2 Sap3 Sap9 Sap10 Lip3 Lip4 Lip5 Lip6
EAHJD 1 250 −7.69 −2.01 −4.30 −2.11 −1.28 −8.29 −4.52 −4.98 −2.44 −9.24 −5.16 −2.19 −4.23
312 −3.57 −1.08 −3.10 −1.98 −1.09 −3.21 −3.24 −1.98 −1.39 −4.22 −3.28 −2.08 −2.93
78 −2.95 −1.02 −1.70 −1.20 −1.02 −2.25 −1.23 −1.02 −1.15 −1.20 −2.09 −1.03 −1.24
FLZ 256 −5.63 −3.23 −4.14 −4.20 −2.38 −1.28 −1.79 −4.28 −1.47 −6.23 −2.57 −1.98 −6.32

4 讨论
白色念珠菌是一种重要的条件致病菌，在菌群
失调或机体免疫功能下降时可引发机会性感染。随
着分子免疫学、分子生物学的发展，对于该菌感染
人类宿主的研究取得了很大进展，对白色念珠菌的
毒力因子有了进一步的认识。
本实验从白色念珠菌几种常见的主要毒力因
子方面探讨 EAHJD 抗白色念珠菌作用。PL 作为一
种重要的毒力因子，其中磷脂酶 B、C、D（PLB、
PLC、PLD 研究较多。Barrett-Bee 等[7]证实 PL 活
力高的白色念珠菌对颊膜上皮黏附力及小鼠的致
病性均上升。PLB 是一种分泌型糖蛋白，糖基化磷
脂酰肌醇（GPI）结合位点与 PLB1 结合后，将 PLB1
与细胞膜或细胞壁上的几丁质结合，使其固定于细
胞壁上。PLC 在膜受体的传递中扮演重要角色，其
中 PLC1 可能涉及白色念珠菌细胞生长过程，PLC1
突变株未能形成菌丝；而 PLC2 与 PLC3 经证实并
非白色念珠菌毒力所必需的[8]。本实验 17 株临床株
中 PLB 阳性 15 株，其中活性较高有 5 株。EAHJD
干预下，仅从沉淀圈观察，PLB 的分泌并未发现明
显变化。RT-PCR 检测基因发现 EAHJD 作用后，
PLB1 与 PLC2 表达未见明显变化，1 250、312 μg/mL
EAHJD 分别使 PLC1 表达下降 4.3、3.1 倍。结合表
型及基因变化推测，EAHJD 引起 PLC1 下调但未能
造成表型变化推测可能还作用于其他 PLB 相关基
因，共同调节基因变化，造成 PLB 分泌无明显差异。
Sap 作为白色念珠菌另一个重要的毒力因子，不仅
有较高的蛋白水解活性，而且对感染鼠有较高的致
死性。研究证明 Sap1～3 无效突变体丧失了大部分
毒性；Sap9 和 Sap10 通常存在于共生和感染过程
中[9]。17 株临床株筛选出 13 株 Sap 阳性菌株，其
中活性较高有 7 株。EAHJD 干预后，Sap 分泌显著
降低。与对照组相比，78、312、1 250 μg/mL EAHJD
作用后 Sap 活力 Pz 值依次上升了 19.2%、55.3%、
77.4%。RT-PCR 检测基因发现 EAHJD 作用后，
Sap2、Sap3、Sap9 均下调；Sap1、Sap10 无明显变
150
100
50
0
Li
p
/ (
U
·g
−1
)
对照 78 312 1 250 FLZ
EAHD / (μg·mL−1)
C
H
S
1.5
1.0
0.5
0
对照 78 312 1 250 FLZ
EAHD / (μg·mL−1)
**
**
** **
**
**
·3584· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 24 期 2014 年 12 月

化，推测 EAHJD 对 Sap 基因的下调效应起主导作
用，从而抑制了 Sap 的分泌。Lip 也是白色念珠菌
的重要毒力因子之一，1965 年首次提出白色念珠菌
细胞外 Lip 活性。Hube 等[10]实验发现 Lip3～6 在多
种培养及各生长阶段均表达。17 株临床株筛选出
10 株 Lip 阳性菌株，其中活性较高有 6 株。EAHJD
干预后，与对照组相比，78、312、1 250 μg/mL
EAHJD 作用组分别使 Lip 活性下降 0.05%、34.6%、
77.9%。RT-PCR检测基因发现EAHJD作用后，Lip3、
Lip4、Lip6 均下调，Lip5 无显著变化。这与 Lan
等[11]的研究一致，即 Lip5 属于冷活性酶，最适环
境为 15～25 ℃，而本实验作用温度为 37 ℃，推
测该基因表达受到抑制，导致 EAHJD 难于无法作
用该靶点。而其他 3 个基因表达下调引起 Lip 分泌
大大降低。
CSH 有助于菌体黏附于上皮细胞、内皮细胞和
胞外基质蛋白，以及抵抗吞噬细胞的杀伤，因而是
白色念珠菌的一种重要毒力因子[12]。同时，CSH 也
参与了生物膜的形成，后者不仅参与了白色念珠菌
的耐药性，同时也是重要的致病因素。本实验检测
了经不同质量浓度 EAHJD 处理的白色念珠菌 CSH
值，结果表明，EAHJD 浓度越大，CSH 值越小，
CSH1 基因表达也相应越低，推测 CSH1 表达下降
而导致 CSH 降低可能是 EAHJD 降低毒力的分子机
制之一。
综上所述，EAHJD 的抗白色念珠菌作用可能与
其抑制 PL、Sap、Lip 和 CSH 等密切相关。
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