全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 11 期 2015 年 6 月

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芍药 Actin 基因在大肠杆菌中的高效表达
徐 杰 1，高水平 2，张文婷 1，史国安 1，范丙友 1*
1. 河南科技大学农学院，河南 洛阳 471003
2. 河南科技大学林学院，河南 洛阳 471003
摘 要：目的 构建芍药 Paeonia lactiflora Actin（PlActin）基因原核表达载体，优化 PlActin 基因在大肠杆菌中的高效表达
体系。方法 基于 PlActin 基因 cDNA 序列及原核表达载体 pET-32a (+) 多克隆位点序列，设计一对 5’末端分别插入 BamH I
和 Hind III 酶切位点的特异性 PCR 引物，基于 RT-PCR 技术亚克隆 PlActin 基因；用 BamH I 和 Hind III 双酶切重组质粒
pMD18-T-PlActin 和原核表达载体 pET-32a (+)，胶回收纯化目的基因和空载体，连接、转化后应用菌落 PCR、质粒 PCR 和
双酶切鉴定出重组子 pET-32a (+)-PlActin，转化 BL21（DE3）菌株获得基因表达工程菌；分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代
半乳糖苷（IPTG）浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度，诱导 PlActin 基因在大肠杆菌中表达，SDS-PAGE
电泳、考马斯亮蓝 R250 染色后制备干胶并比较重组 Actin 蛋白的表达量。结果 亚克隆测序结果表明 PlActin 与目的序列完
全一致，且其编码区序列（CDS）上下游成功插入了 BamH I 和 Hind III 酶切位点；成功构建了芍药原核表达载体 pET-32a
(+)-PlActin；诱导剂 IPTG 的最佳浓度为 0.1 mmol/L，诱导的菌体起始密度（A600）为 0.4～0.6，最佳表达时间为 4 h。结论 构
建了 PlActin 基因原核表达载体 pET-32a (+)-PlActin，建立了 PlActin 基因在大肠杆菌中的高效表达体系。
关键词：芍药；Actin；大肠杆菌；SDS-PAGE 电泳；高效表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)11 - 1661 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.11.019
High-level expression of Actin of Paeonia lactiflora in Escherichia coli
XU Jie1, GAO Shui-ping2, ZHANG Wen-ting1, SHI Guo-an1, FAN Bing-you1
1. College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China
2. College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China
Abstract: Objective To construct the prokaryotic expression vector of Actin gene and to establish the high-level expression of Actin of
Paeonia lactiflora in Escherichia coli. Methods Based on cDNA sequence of Actin of P. lactiflora and the polyclonal sites on the
prokaryotic expression vector pET-32a (+), a pair of PCR primers whose 5’ end was inserted with BamH I and Hind III, respectively were
designed. Subcloning of Actin was carried out using RT-PCR technique. The recombinant plasmid pMD18-T-PlActin and the prokaryotic
expression vector pET-32a (+) was digested by BamH I and Hind III and the objective gene and the empty vector were purified. After ligation
and transformation, the recombinant pET-32a (+)-PlActin, which was characterized by colony PCR, plasmid PCR, and double enzyme
digestion, was transformed into BL21 (DE3), and the engineering expression strain was obtained. The expression of recombinant Actin
protein in E. coli was induced at different concentration of inducer IPTG, different bacteria density, and different expression time. After
SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue R250 staining, the dry gel was prepared and the expression level of recombinant Actin protein was
analyzed. Results Subcloning sequencing result showed that the sequence of PlActin was exactly same with the objective sequence and the
5’ and 3’ ends were successfully inserted with BamH I and Hind III sites. The prokaryotic expression vector of Actin gene pET-32a (+)-PlActin
was constructed successfully. The best concentration of IPTG was 0.1 mmol/L and the bacteria density A600 was 0.4 to 0.6. The optimal
expression time was 4 h. Conclusion The prokaryotic expression vector of Actin gene pET-32a (+)-PlActin is constructed and the high-level
expression of Actin of P. lactiflora in E. coli is established.
Key words: Paeonia lactiflora Pall.; Actin; Escherichia coli (Migula) Castellani et Chalmers; SDS-PAGE electrophoresis; high-level
expression

收稿日期：2015-01-02
基金项目：国家自然科学基金资助项目（U1204323）；河南省科技厅国际合作项目（134300510052）
作者简介：徐 杰（1987—），男，河南沈丘县人，硕士生，从事植物分子学研究。E-mail: comdisc@163.com
*通信作者 范丙友（1974—），男，河南伊川人，博士，教授，从事植物分子生物学研究。E-mail: fanbingyou2005@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 11 期 2015 年 6 月

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芍 药 Paeonia lactiflora Pall. 为 芍 药 科
（Paeoniaceae）芍药属 Paeonia Pall. 芍药组（Sect.
Paeonia）多年生宿根草本植物；除观赏价值外，芍
药还具有重要的药用价值[1]。芍药富含芍药苷、丹皮
酚、鞣质、萜类、黄芪苷、没食子酸、除虫菊素、
丹皮花苷等药用成分，具有免疫调节、镇痛、镇静、
解痉、保肝、扩张血管和抗炎等作用[2]。Actin 是首
先在肌肉细胞中发现的一种重要的收缩蛋白，其后
的许多研究表明该蛋白也存在于非肌细胞中[3]。肌动
蛋白（Actin）是高度保守的古老蛋白之一，由 375
个氨基酸残基组成；不同物种 Actin 氨基酸序列的同
源性可高达 70%～100%[4]。Actin 主要存在于细胞质
中，是细胞骨架微丝的主要组成成分，参与细胞分
裂、细胞运动、细胞迁移、细胞形态维持、细胞生
长、内吞和外排作用以及其他重要生理事件[5]。低等
真核生物Actin常由单基因编码，高等真核生物Actin
则多由 Actin 基因家族编码[6]，从而产生多种 Actin
异型体，其结构上的多样性反映了其功能的多样性。
研究表明植物 Actin 基因的表达也具有组织和器官
的特异性[7]。本课题组克隆了 PlActin 基因 cDNA 序
列[8]和基因组 DNA 序列[9]，为进一步开展芍药 Actin
（PlActin）基因的功能奠定了一定基础。由于 Actin
异型体之间同源序列的存在，很难从植物中直接获
取大量特异的 Actin 异型体[10]。通过体外研究某一种
蛋白的理化特性进而推测其在体内的理化过程以及
生理功能是一种常用的研究手段[11]。由于大肠杆菌
的遗传学、生物化学和分子生物学方面的知识已被
人们逐步了解，又由于其具有低成本、高效率、易
操作等特点，因此成为外源基因表达的首选系统[12]。
因此，构建了 PlActin 基因原核表达载体并对 PlActin
蛋白在大肠杆菌中的高效表达体系进行了优化，为
下一步 PlActin 蛋白的功能研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品采自洛阳神州牡丹园，经神州牡丹园总园艺
师付正林鉴定为芍药 Paeonia lactiflora Pall.。DNase I
kit、Primer Script II 1st strand cDNA synthesis kit、DNA
凝胶回收试剂盒、克隆载体 pMD18-T、DNA Ligation
Kit Ver.2.1、限制性内切酶 BamH I 和 Hind III、DL
2000 DNA Marker、蛋白质 Marker、异丙基-β-D-硫代
半乳糖苷（IPTG）均购自宝生物工程（大连）有限公
司；高保真 KOD-Plus DNA 聚合酶为日本 TOYOBO
公司产品；大肠杆菌菌株 DH5α 和 BL21（DE3）及
原核表达载体 pET-32a (+) 由本实验室保存；其余试
剂均为国产或进口分析纯。
1.2 引物设计
根据本课题组克隆的 PlActin cDNA 序列
（JX310002）及原核表达载体 pET-32a (+) 的多克隆
位点序列，应用 Primer Premier 5.0 软件设计一对特
异性 PCR 引物用于扩增 PlActin 基因的编码区序列
（coding sequences，CDS），其中上下游引物分别插
入了 BamH I 和 Hind III 酶切位点，引物
5’-CGCGGATCCATGGCCGATGCTGAGGATATCC-3’
和 5’-CCCAAGCTTTTAAAAGCACTTCCTGTGG-
ACA-3’由北京华大基因研究中心合成。
1.3 PlActin 基因的 RT-PCR 扩增、克隆及测序
芍药花瓣总 RNA 提取、纯化及 cDNA 合成参
照文献方法进行[9]。RT-PCR 扩增总体积为 50 μL，
含 5 μL 10×缓冲液、5 μL 2.0 mmol/L each dNTP、4
μL 25 mmol/L MgCl2、10 pmol/μL 上下游引物各 1.5
μL、5 μL cDNA、1 μL KOD-plus DNA 聚合酶、27 μL
ddH2O。PCR 扩增程序为 94 ℃预变性 2 min，随后
98 ℃、10 s，54 ℃、30 s，68 ℃、40 s，共 35 个循
环，后进行 72 ℃、7 min 延伸；1%琼脂糖凝胶电泳
检测 PCR 扩增产物。
目的基因经纯化后与 pMD18-T 载体连接并转
化大肠杆菌 DH5α，应用菌落 PCR、质粒 PCR 及
BamH I 和 Hind III 双酶切鉴定出阳性重组子，并进
一步进行序列测定验证。
1.4 PlActin 基因原核表达载体的构建
应用限制性内切酶 BamH I 和 Hind III 对阳性重
组子 pMD18-T-PlActin 和原核表达空载体 pET-32a (+)
进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒纯
化目的基因 PlActin 和原核表达空载体 pET-32a (+)，
然后将二者用连接试剂盒连接并转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，涂布在含有 100 μg/mL 氨苄青霉素
（Amp）试剂的固体 LB 平板上进行过夜培养。经菌落
PCR 初步检测后，挑取阳性单菌落过夜培养，提取质
粒进行质粒PCR检测，再进一步用BamH I和Hind III
双酶切鉴定，鉴定出的阳性重组子pET-32a (+)-PlActin
转化 DE3 菌株感受态细胞，获得基因表达工程菌。
1.5 PlActin 重组蛋白的原核表达、电泳检测及干
胶制备
挑取 1 个基因表达工程菌的单菌落，接种在 5
mL 含 100 μg/mL Amp 的 LB 培养基中，37 ℃过夜
培养；吸取 1 mL 过夜培养的表达工程菌菌液，加
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入 49 mL 含 100 μg/mL Amp 的 LB 培养基中，37 ℃培
养至菌体密度（以 600 nm 处吸光度表示，A600）达
0.6，在 LB 培养基中加入 IPTG，使其终浓度为 0.6
mmol/L。继续培养 4 h，取 1.5 mL 菌液，10 000 r/min
离心 2 min，收获菌体用于 SDS-PAGE 电泳检测。
用 200 μL 2×SDS 上样缓冲液悬浮菌体细胞，
100 ℃煮沸 5 min；取 10 μL 用于电泳检测。
SDS-PAGE 电泳的浓缩胶为 4%、分离胶为 10%，
上样后 60 mA 恒流 1 h。电泳完毕后剥胶，在 60 ℃
水浴中用考马斯亮蓝 R250 染色 30 min；60 ℃水浴
中脱色 3 h，待完全脱色后制备干胶。将 SDS-PAGE
电泳凝胶和 2 张比电泳玻璃板略大的玻璃纸置于含
微量甘油的去离子水中浸泡约 5 min，然后取一张
玻璃纸置于玻璃板上，赶尽气泡，将 SDS-PAGE 电
泳凝胶置于玻璃纸上，其上再放置一张玻璃纸，赶
尽气泡，将玻璃纸的多余部分包裹在玻璃板放置凝
胶的背面，置于室温下阴干 3～5 d，待胶完全干燥
后扫描干胶并永久保存。
1.6 IPTG 浓度对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
当扩大培养的 50 mL 基因工程菌菌体密度达
0.6 时，添加 IPTG 至终浓度分别达 0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol/L。37 ℃诱导表
达 4 h，取出 1.5 mL 菌液用于 SDS-PAGE 电泳，分
析基因工程菌总蛋白中重组 Actin 蛋白的表达量。
1.7 菌体密度对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
当扩大培养的 50 mL 基因工程菌菌体密度达
0.1～1.1 时添加 IPTG 至终浓度为 0.4 mmol/L，37 ℃
诱导表达 4 h，取出 1.5 mL菌液用于SDS-PAGE电泳，
分析基因工程菌总蛋白中重组 Actin 蛋白的表达量。
1.8 诱导时间对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
当扩大培养的 50 mL 基因工程菌菌体密度达
0.6 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.4 mmol/L 诱导，分
别在 2、5、10、20、40 min 及 1、2、4 h 时各取出
1.5 mL 菌液用于 SDS-PAGE 电泳，分析基因工程菌
总蛋白中重组 Actin 蛋白的表达量。
2 结果与分析
2.1 PlActin 基因的亚克隆及测序
应用 RT-PCR 技术成功扩增出了 PlActin 基因
PCR 产物（图 1-A），PCR 产物大小与预期值一致，
命名为 PlActin。PCR 产物经纯化后与克隆载体
pMD18-T 连接，经菌落 PCR 和质粒 PCR 初筛后的阳
性重组子 pMD18-T-PlActin 进一步用 BamH I 和 Hind
III 双酶切鉴定，双酶切电泳结果与预期结果完全一致
（图 1-B），表明成功亚克隆了 PlActin 基因。测序结果
表明 PlActin 与 PlActin cDNA 序列（JX310002）完全
一致，且 CDS 上下游成功插入了 BamH I（GGATCC）
和 Hind III（AAGCTT）酶切位点，能够用于下一步
PlActin 基因原核表达载体的构建。

1-PlActin 的 RT-PCR 扩增 2～3-阳性重组子 pMD18-T-PlActin/
BamH I＋Hind III 双酶切鉴定 M-Marker
1-RT-PCR amplification of PlActin 2—3-characterization of
positive recombinant by BamH I and Hind III M-Marker
图 1 PlActin 的 RT-PCR 扩增 (A) 及阳性重组子 pMD18-
T-PlActin/BamH I＋Hind III 双酶切鉴定 (B)
Fig. 1 RT-PCR amplification of PlActin (A) and
characterization of positive recombinant by BamH I and
Hind III (B)
2.2 原核表达载体 pET-32a (+)-PlActin 的构建
pMD18-T-PlActin 和 pET-32a (+) 经 BamH I 和
Hind III 双酶切后，回收目的基因 PlActin 和空载体，
纯度及浓度（图 2-A、B）达到连接的要求，可以用
于下一步的连接反应。二者的连接产物转化大肠杆
菌 DH5α 感受态细胞，经菌落 PCR 初筛后，提取
质粒进行质粒 PCR 检测（图 3-A），再进一步用

1-原核表达空载的纯化回收 2-目的基因 PlActin 的纯化回收
1-purification of empty prokaryotic expression vector 2-purification of
objective gene PlActin
图 2 原核表达空载体及目的基因的纯化回收
Fig. 2 Purification of empty prokaryotic expression vector
and objective gene PlActin
M 1 M 2 3
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
A B
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp

500 bp
250 bp
2 000 bp

1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 M 2
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BamH I 和 Hind III 双酶切鉴定（图 3-B），电泳结果
表明相对分子质量较大的酶切产物与原核表达载体
大小一致，相对分子质量较小的酶切产物与目的基
因 PlActin 的大小一致，表明原核表达载体 pET-32a
(+)-PlActin 构建成功。

1～2-原核表达载体的质粒 PCR 鉴定 3～4-原核表达载体的
BamH I 和 Hind III 双酶切鉴定
1—2-plasmid PCR characterization of prokaryotic expression vector
3—4-double enzymes digestion of prokaryotic expression vector by
BamH I + Hind III
图 3 原核表达载体的质粒 PCR (A) 及 BamH I 和 Hind III
双酶切鉴定 (B)
Fig. 3 Plasmid PCR characterization (A) and double
enzymes digestion of prokaryotic expression vector (B)
2.3 PlActin 基因在大肠杆菌中的诱导表达
鉴定出的阳性重组子 pET-32a (+)-PlActin 转
化 DE3 菌株感受态细胞，获得基因表达工程菌。
挑取 1 个表达工程菌单菌落，37 ℃过夜培养后
按 2%体积比扩大培养，待菌体密度达 0.6，在
LB 培养基中加入 IPTG，使其终浓度为 0.6
mmol/L。继续培养 4 h，SDS-PAGE 电泳检测诱
导结果。由图 4 可以看出，与未诱导的阴性对照
相比，诱导的工程菌总蛋白中增加了一个相对分
子质量约为 60 000 的新蛋白，表明 PlActin 重组
蛋白诱导表达成功。

1-阴性对照 2-IPTG 诱导
1-not induced 2-IPTG induced
图 4 SDS-PAGE 电泳检测PlActin 基因在大肠杆菌中的表达
Fig. 4 Expression of PlActin in E. coli detected by
SDS-PAGE
2.4 IPTG 浓度对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
从图 5 可以看出，设置的所有 IPTG 浓度均能
有效诱导 PlActin 重组蛋白的表达。从节约成本的
角度选择诱导剂 IPTG 的浓度为 0.1 mmol/L。

1-阴性对照 2～10-IPTG 浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、
0.7、0.8、0.9 mmol/L
1-not induced 2—10-IPTG at concentration of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5,
0.6, 0.7, 0.8, and 0.9 mmol/L
图 5 IPTG 浓度对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
Fig. 5 IPTG concentration on effect of expression level of
recombinant Actin
2.5 诱导起始菌体密度对 PlActin 重组蛋白表达量
的影响
从图 6 可以看出，当诱导时宿主菌菌体密度在
0.1～1.1 时，PlActin 重组蛋白均可高效表达，当宿
主菌菌体密度值从 0.1 增加至 0.4 时，重组 Actin 蛋
白的表达量也相应增加，当宿主菌菌体密度从 0.4
增加至 1.2 时，Actin 蛋白表达量基本保持恒定。因
此，优化的诱导起始菌体密度为 0.4～0.6。

1-阴性对照 2～13-A600 值分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、
0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2
1-negative control 2—13-A600 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9,
1.0, 1.1, and 1.2
图 6 诱导起始菌体密度对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
Fig. 6 Bacteria density on effect of expression level of
recombinant Actin
M 1 2 M 3 4
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
A B
M 1 2
97 200

66 400

44 300

29 000
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

97 200
66 400
44 300
29 000
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
97 200
66 400
44 300
29 000
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2.6 诱导时间对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
从图 7 可以看出，加入 IPTG 诱导 2 min 后，
PlActin 重组蛋白即高效表达；在检测的 2 min 至 4 h
内，其表达量占宿主菌总蛋白的比例基本保持一致。
但由于培养时间越长，收获的宿主菌相对更多，因
此优化的诱导表达时间为 4 h。由于 PlActin 重组蛋
白在 2 min 内即高效表达，推测该重组蛋白的主要
形式为包涵体。

1-阴性对照 2-2 min 3-5 min 4-10 min 5-20 min 6-40 min
7-1 h 8- 2h 9-4 h
1-negative control 2-2 min 3-5 min 4-10 min 5-20 min 6-40
min 7-1 h 8-2 h 9-4 h
图 7 诱导时间对 PlActin 重组蛋白表达量的影响
Fig. 7 Induced time on effect of expression level of
recombinant Actin
3 讨论
当蛋白质在细菌中高效表达时，经常会形成包涵
体。不溶性包涵体的形成虽然为后续的分离纯化带来
方便，但通常要采用强变性剂才能溶解包涵体，溶解
后还需复性才能回收正确折叠的重组蛋白。通常先用
尿素、Triton X-100、EDTA 等洗去包涵体中的杂质，
再用尿素等变性剂溶解包涵体。在变性剂溶液中，溶
解的蛋白质呈变性状态[13]。一般来说，包涵体中含有
超过 50%的重组蛋白，在优化条件下重组蛋白可占包
涵体的 90%以上[14]。溶解的包涵体复性的第 1 步是透
析或稀释除去变性剂。为了降低蛋白质重折叠的进
程，复性通常在低浓度蛋白条件下进行[13]。
通过体外研究某一种蛋白的理化特性进而推测
其在体内的理化过程以及生理功能是一种常用的研
究手段[11]。本研究亚克隆了 PlActin 基因，在其 CDS
上下游成功插入了 BamH I（GGATCC）和 Hind III
（ AAGCTT ）酶切位点；基于鉴定的重组子
pMD18-T-PlActin 构建了 PlActin 原核表达载体
pET-32a (+)-PlActin 并转化 DE3 受体细胞获得了基
因表达工程菌；获得的 PlActin 基因原核高效表达
体系为最优 IPTG 浓度为 0.1 mmol/L、菌体诱导起
始密度为 0.4～0.6、诱导表达 4 h。pET-32a (+) 载
体上含有 Trx（硫氧还蛋白）标签、S（RNase S 前
15 个氨基酸）标签和 His 标签，已经建立的 PlActin
原核高效表达体系为下一步基于变复性和亲和色谱
技术纯化 PlActin 重组蛋白及其理化性质的鉴定奠
定了一定基础。
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97 200


66 400




44 300



29 000