全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1034 •
• 药材与资源 •
红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析
陶晨陈 1，马成通 1，吴耀生 1, 2*，周青鸟 1，苏荷玲 2，晁耐霞 2，罗 育 1
1. 广西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，广西 南宁 530021
2. 广西高校生物分子医学研究重点实验室，广西 南宁 530021
摘 要：目的 克隆红花栝楼鲨烯合酶（squalene synthase，SS）的基因并进行序列分析，为进一步研究葫芦科植物三萜合
成通路关键酶 SS 的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础。方法 根据绞股蓝与罗汉果 SS 基因 cDNA 比对分析的结果，
设计 SS 的 5’端简并引物，采用 3’RACE 扩增红花栝楼 SS 全长 cDNA 基因。结果 获得红花栝楼 SS cDNA 全长共 1 466 个
核苷酸，其中包括一个含有 1 254 个核苷酸的开放读码框，编码 417 个氨基酸残基。通过 NCBI 的 Blast 比对，发现红花栝
楼 SS 基因编码的氨基酸序列与已知植物 SS 基因编码的氨基酸序列同源性为 78%～94%，核苷酸的同源性为 74%～93%。
结论 成功克隆了红花栝楼 SS 的全长 cDNA，为进一步研究红花栝楼 SS 基因结构、基因表达、基因突变提供了基础，并
为葫芦科植物三萜合成通路关键酶 SS 的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。
关键词：红花栝楼；鲨烯合酶；RACE；基因克隆；序列分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)07 - 1034 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.07.018
Cloning and sequence analysis of squalene synthase gene from Trichosanthes rubriflos
TAO Chen-chen1, MA Cheng-tong1, WU Yao-sheng1, 2, ZHOU Qing-niao1, SU He-ling2, CHAO Nai-xia2, LUO Yu1
1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Nanning 530021, China
2. Key Laboratory of Biological Molecular Medicine Research of Guangxi High Education.Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
Abstract: Objective To clone the full length cDNA encoding squalene synthase (SS) from Trichosanthes rubriflos and to carry on its
sequence analysis, so as to lay the foundation for the further study on the positively selected sites and function correlation analysis of
SS which is the key enzyme for triterpene synthesis pathway. Methods According to the cDNA comparison on SS gene from
Gynostemma pentaphyllum and Siraitia grosvenorii, 5’-upstream degenerate primers of the cDNA of SS gene from T. rubriflos were
designed and the full length cDNA of SS gene from T. rubriflos was amplified by 3’RACE kit. Results The full length cDNA of SS
gene from T. rubriflos composed of 1 466 nucleotides was obtained. The open reading frame (ORF) of SS gene from T. rubriflos
was 1 254 bp in length, corresponding to a predicted polypeptide of 417 amino acid residues. The results of homologous alignment
analysis in GenBank demonstrated that the cDNA sequence of SS gene from T. rubriflos had 78%—94% similarity on the nucleotide
sequence compared with SS from known plant and 74%—93% similarity on the deduced amino acid sequence compared with SS gene
from other plants. Conclusion The full length cDNA of SS gene from T. rubriflos has been cloned, which not only lays a foundation for
the further study on the gene expression, gene structure, and gene mutation, but also provides the important data base for the association
study between the positively selected sites and function correlation analysis of which is the key enzyme for triterpene synthesis pathway.
Key words: Trichosanthes rubriflos Thoms. ex Cayla; squalene synthase; rapid amplificatiion of cDNA ends; gene cloning; sequence analysis

三萜皂苷是一类重要的植物次生代谢产物，广
泛分布于植物组织中，具有抗菌和抗虫害的作用，
可以用作药物，具有重要的商业价值[1]。例如，人
参皂苷是人参的主要活性成分之一，其各单体成分
普遍具有调节免疫系统、降低血清中胆固醇的量、
防治心血管疾病、抗炎、解毒、抗癌等生理功效[2]。
研究表明，三萜皂苷合成途径中的一些关键酶对组
织中三萜皂苷的量和组成具有重要的调节作用[3]。

收稿日期：2014-11-30
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31260069）；广西高等学校科研项目（201203YB038）
作者简介：陶晨陈（1985—），男，安徽合肥人，在读硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。
Tel: 18376645670 E-mail: 332931654@qq.com
*通信作者 吴耀生，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事植物分子生物学和基因工程方面的研究。
Tel: 15177171863 E-mail: wuyaosheng2012@gxmu.edu.cn
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1035 •
鲨烯合酶（squalene synthase，EC 2.5.1.21，简称
SS）是三萜类化合物生物合成途径中的一个重要
调控酶[4]。SS 能催化 2 分子的法呢基焦磷酸（farnesyl
pyrophosphate，FPP）缩合生成 1 分子鲨烯，是三萜、
甾醇、胆固醇等萜烯类重要物质生物合成的共同前
体[5]。因此，SS 的研究对了解三萜皂苷合成途径具
有重要的参考价值。目前，三萜生物合成通路关键
酶 SS 的基因克隆、进化分析已有相关报道，如陆生
植物 SS 适应性进化正选择位点分析[6]，绞股蓝鲨烯
环氧酶基因的克隆与序列分析[7]，以及人参、金铁锁、
青蒿、丹参[8-13]等。葫芦科植物三萜生物合成通路关
键酶SS基因序列在GenBank中已收录的目前只有罗
汉果（HQ128565）和绞股蓝（FJ906799）。
红花栝楼 Trichosanthes rubriflos Thoms. ex
Cayla为葫芦科（Cucurbitaceae）栝楼属Trichosanthes
L. 植物，具有一定的药用价值，国内主要分布在广
东、广西、贵州等省区，国外主要分布于印度东北
部、缅甸、泰国等地区。根据《中国药典》2010 年
版所收载，中药瓜蒌的植物基原是葫芦科植物栝楼
Trichosanthes kirilowii Maxim. 及 双 边 栝 楼
Trichosanthes rosthornii Harms 的干燥成熟果实，而
红花栝楼等其他栝楼属植物的果实则是混杂品。但
也有一些本草记载，红花栝楼的根部也可药用，其
味甘、微苦，性寒，有小毒；主要功能为清肺化痰、
解毒散结；主肺热咳嗽、胸闷胸痛、便秘、疟疾、
疮疖肿毒[14]。有研究表明，在栝楼属植物中可分离
得到葫芦素[15]，但有关红花栝楼的研究仍未见报
道，亦未知是否含有葫芦素。SS 是三萜合成通路关
键酶，因此红花栝楼 SS 基因序列的克隆分析对了
解其三萜生物合成通路具有重要意义。
cDNA 末端快速扩增技术（rapid amplificatiion of
cDNA ends，RACE）是一种始于 mRNA 的 3’或 5’端，
最终获得目的基因全长 cDNA 的分子生物学技术[16]。
本课题组已运用RACE技术成功克隆出了绞股蓝SS、
SE、FPS 等基因[7,17]，现继续运用该技术对红花栝楼
三萜合成途径关键酶 SS 基因进行克隆及分析。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品于2013年9月采集自广西南宁市广西中医
药大学药圃。经广西中医药大学朱意麟讲师鉴定为
红花栝楼 Trichosanthes rubriflos Thoms. ex Cayla，
存放于广西医科大学分子医学实验室−80 ℃超低
温冰箱。大肠杆菌 DH5α 感受态细胞、LATaq DNA
聚合酶限制性内切酶、3’-Full RACE Core Set Ver
2.0、柱式胶回收试剂盒及质粒小量提取试剂盒等为
TaKaRa 公司产品；DNA 寡核苷酸引物由上海生物
工程有限公司合成；PEASY-T1 载体为全式金公司
产品；RCR 仪为 Biometra An Analylik Jena Company
公司产品；其他试剂均为国产分析纯产品；本研究
利用的不同植物 SS 的相关信息见表 1。
1.2 红花栝楼总 RNA 提取
参照蒋军富等[7]的异硫氰酸胍法，提取红花括
楼叶片总 RNA。
1.3 3’RACE PCR 克隆
以绞股蓝和罗汉果的 SS 基因为基础，经比对
分析找同源区，设计出扩增红花栝楼 SS cDNA 全长
所需的 5’端简并引物 ssjbf2 和 ssjbf3（表 2），由上
海生物工程有限公司合成。以红花栝楼总 RNA 为
模板，加入 3’RACE Adaptor 等试剂，按试剂盒说明
书操作反转录合成第一链 cDNA。反应体系包括红
花栝楼总 RNA 1 μL、3’RACE Adaptor（5 μmol/L）
1 μL、5×Prime Script Buffer 2 μL、dNTP Mixture
（10 mmol/L each）1 μL、RNase Inhibitor（40 U/μL）
0.25 μL、PrimeScript RTase（200 U/μL）0.25 μL，
用 RNase Free dH2O 补至总体积 10 μL。42 ℃反转
录 60 min，70 ℃作用 15 min，反应产物用于巢式
PCR。以反转录得到的第一链 cDNA 为模板，分别
以 ssjbf2、ssjbf3 与 3’RACE 试剂盒中的 3’RACE
Outer Primer、3’RACE Inner Primer 为引物，按照
3’-Full RACE Core Set Ver 2.0 说明进行 3’RACE 外
侧、内侧 2 轮巢式 PCR 扩增反应。第 1 轮 PCR 反
应条件为94 ℃预变性3 min，然后以94 ℃变性30 s、
55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 100 s 运行 20 个循环，
72 ℃延伸 10 min。以第 1 轮 PCR 产物为模板进行
第 2 轮巢式 PCR。第 2 轮 PCR 反应条件为 94 ℃预
变性 3 min，然后以 94 ℃变性 30 s、55 ℃退火 30 s、
72 ℃延伸 100 s 运行 30 个循环，72 ℃延伸 10 min。
用琼脂糖凝胶电泳判断 PCR 扩增结果。Inner PCR
产物纯化后，与 PEASY-T1 连接，连接产物转化大
肠杆菌 DH5α，在 X-gal/IPTG/Amp LB 琼脂平板上
挑取白色菌落摇菌扩增培养，提取质粒并进行 PCR
鉴定，将阳性克隆送华大基因公司测序。
1.4 红花栝楼 SS 基因 cDNA 全长序列拼接与生物
信息学分析
利用 Vector NTI Suite 6.0 软件对 3’RACE 所得
片段的测序结果进行分析与拼接。利用 DNAMAN
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1036 •
表 1 不同植物 SS 的相关信息
Table 1 Related information of SS gene from different plants
序号 种名 拉丁名 科名
编码氨基酸
残基数
提交
国家
GenBank 核酸
序列登录号
GenBank 氨基酸
序列登录号
1 楤木 Aralia elata 五加科 414 中国 GU354313 ADC32 654.1
2 百脉根 Lotus japonicus 豆科 413 日本 AB102688 BAC56 854.1
3 北柴胡 Bupleurum chinense 伞形科 415 中国 GQ889267 ACX42 424.1
4 本氏烟 Nicotiana benthamiana 茄科 411 美国 U46000 AAA87 048.1
5 布朗葡萄藻 Botryococcus braunii 葡萄藻科 461 美国 AF205791 AF205791_1
6 大豆 Glycine max 豆科 413 日本 AB007503 BAA22 559.1
7 丹参 Salvia miltiorrhiza 唇形科 413 中国 FJ768961 ACR57 219.1
8 东北红豆杉 Taxus cuspidata 红豆杉科 409 中国 DQ836053 DQ836 053.1
9 番茄 Solanum lycopersicum 茄科 411 美国 NM_001247787 NP_001234 716.1
10 甘草 Glycyrrhiza uralensis 豆科 412 中国 AM182330 CAJ77 653.1
11 高粱 Sorghum bicolor 禾本科 403 美国 XM_002466214 XP_002466 259.1
12 黄甘草 Glycyrrhiza eurycarpa 豆科 413 中国 AM182331 CAJ77 654.1
13 黄花蒿 Artemisia annua 菊科 418 中国 AY445506 AAR20 329.1
14 积雪草 Centella asiatica 伞形科 415 韩国 AY787628 AAV58 897.1
15 假马齿苋 Bacopa monnieri 玄参科 414 印度 GU734711 ADX01 171.1
16 江南卷柏 Selaginella moellendorffii 卷柏科 392 美国 XM_002971905 XP_002971 951.1
17 绞股蓝 Gynostemma pentaphyllum 葫芦科 417 中国 FJ906799 ACQ90 302.1
18 金铁锁 Psammosilene tunicoides 石竹科 414 中国 EF585250 ABQ96 265.1
19 辣椒 Capsicum annuum 茄科 411 韩国 AF124842 AAD20 626.1
20 陆地棉 Gossypium hirsutum 锦葵科 412 中国 EF688567 ABX10 442.1
21 绿玉树 Euphorbia tirucalli 大戟科 411 日本 AB433916 BAH23 428.1
22 罗汉果 Siraitia grosvenorii 葫芦科 417 中国 HQ128565 AEM42 980.1
23 马铃薯 Solanum tuberosum 茄科 411 日本 AB022599 BAA82 093.1
24 毛果杨 Populus trichocarpa 杨柳科 413 美国 XM_002313729 XP_002313 765.1
25 膜荚黄芪 Astragalus membranaceus 蝶形花科 413 中国 HQ829974 ADW27 427.1
26 木榄 Bruguiera gymnorhiza 红树科 416 中国 GU478981 ADD54 645.1
27 人参 Panax ginseng 五加科 415 韩国 AB115496 BAD08 242.1
28 三七 Panax notoginseng 五加科 415 中国 DQ186630 ABA29 019.1
29 蛇足石杉 Huperzia serrata 石杉科 420 中国 JQ004938 AEX58 673.1
30 柿 Diospyros kaki 柿科 415 中国 FJ687954 ACN69 082.1
31 鼠耳芥 Arabidopsis thaliana 十字花科 410 日本 D29017 BAA06 103.1
32 水稻 Oryza sativa 禾本科 403 日本 AB007501 BAA22 557.1
33 睡茄 Withania somnifera 茄科 411 印度 GU474427 ADC95 435.1
34 西洋参 Panax quinquefolius 五加科 415 中国 GU997681 AED99 863.1
35 烟草 Nicotiana tabacum 茄科 411 美国 U60057 AAB08 578.1
36 洋甘草 Glycyrrhiza glabra 豆科 413 日本 D86409 BAA13 083.1
37 银柴胡 Bupleurum falcatum 石竹科 415 韩国 AY964186 AAY46 017.1
38 玉蜀黍 Zea mays 禾本科 401 日本 AB007502 BAA22 558.1
39 远志 Polygala tenuifolia 远志科 413 韩国 DQ672339 ABG66 304.1
40 蒺藜苜蓿 Medicago truncatula 豆科 423 美国 XM_003606992 XP_003607 040.1
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1037 •
表 2 SS 的 3’RACE 引物
Table 2 Primers of 3’RACE for SS
引物 序列 碱基数
ssjbf2 ATATWKAGAGVSAGAAATGGGCA 23
3’RACE Outer Primer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 23
ssjbf3 ATATGGGVAGYTTKGGRGCRAT 22
3’RACE Inner Primer CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 32

软件分析红花栝楼 SS 基因 cDNA 全长序列性质，
序列测定结果采用 NCBI Blast 进行同源性比对搜
索。用 Vector NTI Suite 6.0 软件对红花栝楼和已报
道的植物 SS 氨基酸序列进行相似性比对，构建 SS
基因系统进化树，并进行相关生物信息学分析[18-20]。
2 结果与分析
2.1 红花栝楼 SS 基因 3’RACE
通过 3’RACE 得到 1 700 bp 左右的特异条带，
见图 1。通过菌落 PCR 得到 1 800 bp 左右的特异条
带，见图 2。

M-Marker 1、2-3’RACE PCR 产物
M-Marker 1, 2-PCR result of 3’RACE
图 1 3’RACE 产物电泳图
Fig. 1 Electrophoretogram of 3’RACE product

M-Marker 1-SS PCR 产物
M-Marker 1-PCR product of SS
图 2 菌落 PCR 电泳图
Fig. 2 Electrophoretogram of colony PCR
2.2 红花栝楼 SS cDNA 基因的核苷酸序列分析
根据 3’RACE 扩增测序结果，由 Vector NTI
Suite 6.0 软件拼接及人工校对后得到红花栝楼 SS
基因全长序列。该基因 cDNA 全长 1 466 bp，翻译
起始位点为 3 碱基处，翻译终止点位于 1 255 碱基
处，开放读码框由 1 254 个碱基组成。
红花栝楼 SS 基因 cDNA 核苷酸及推衍的氨基
酸序列见图 3。
2.3 红花栝楼 SS 基因推导的氨基酸序列分析
由 SWISS-MODEL Workspace 在线分析软件
建立红花栝楼 SS 基因编码蛋白三维结构模型如图
4 所示。根据 Protscale 中的 Kyte & Doolittle 算法
对蛋白质疏水性与吸水性预测可知（图 5），MIN：
−2.300，MAX：3.344，正值越大表示越疏水，负
值越大表示越亲水，介于 0.5～−0.5 的主要为两性
氨基酸，其中 Arg 有最低的亲水性分值−4.5，即亲
水性最强，而 Ile 疏水性最强，其分值为 4.5。根据
整体肽链可知，其中在 386～408 区域的疏水性最
强，其次 335～337、283～340、175～181、69～
76、46～49 区域具有较强的疏水性；214～254 区
域的亲水性最强，其次 17～21、25～37、104～115、
137～144、161～162、164～166、350～361、367～
370、373～383 区域具有较强的亲水性。红花栝楼
SS 多肽链的亲水区域大于疏水区域，预测该蛋白
属于亲水性蛋白。用 Topcons 预测红花栝楼 SS 跨
膜区域，此蛋白含有 3 个跨膜区，分别位于 58～
78 位、281～301 位、386～406 位。
通过与葫芦科植物罗汉果和绞股蓝的 SS 氨基
酸序列比对分析，得到红花栝楼 SS 基因的开放阅
读框编码由 417 个氨基酸残基构成。通过
http://www.expasy.org/网站在线分析，得到红花栝楼
SS 的氨基酸序列等电点为 7.90，相对分子质量为
47 594.33，二级结构中含 α 螺旋（alpha helix）
68.82%，β转角（beta turn）2.88%，扩展链（extended
strand）4.56%，无规卷曲（random coil）23.74%。
利用PSORT Prediction对红花栝楼SS蛋白的亚
细胞定位分析得到 SS 位于膜结构上。SS 定位于质
膜上的可能性为 0.73，明显大于微粒体、线粒体内
膜、内质网膜上的可能性，所以 SS 定位于质膜上
M 1 2
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1038 •

斜体 ATG 为起始密码子，斜体加下划线 TGA 为终止密码子；小写字母表示 5′和 3′端非翻译区，大写字母表示编码区；上行为核苷酸序列，下
行为氨基酸序列
ATG is initiation codon in bold and italics, TGA is termination codon in bold and indicated by underlined; Lowercase letters represent 5’and
3’untranslation regions, Capital letters represent encoding regions; Up rows indicate nucleotide sequence; Down rows indicate amino acid squence
图 3 红花栝楼 SS cDNA 序列及推导的氨基酸序列
Fig. 3 cDNA sequence and deduced amino acid sequence for SS gene from T. rubriflos
的可能性最大。
2.4 陆生植物 SS 基因序列比较及进化树分析
经 NCBI Blast 比对，发现本实验克隆得到的红
花栝楼 SS 基因的氨基酸序列与已知植物 SS 的同源
性为 78%～94%，核酸序列同源性为 74%～93%。
其中，氨基酸序列与罗汉果和绞股蓝相似性分别为
94%和 88%，核苷酸序列与罗汉果和绞股蓝相似性
分别为 93%和 88%。保守序列（conservedsequence）
对推测进化结果具有特殊意义，在 NCBI 的蛋白保
守结构域数据库（conserved domain database，
CDD）中对红花栝楼 SS 进行蛋白保守区预测，
结果表明与该基因匹配的蛋白为 SS，保守序列
在 N 端和中间（图 6）。用 Vector NTI Suite 6.0
软件将得到的红花栝楼 SS与不同植物的 SS的氨
基酸序列进行多重比对，构建得到进化树（图 7）。
3 讨论
药用植物的生物合成途径关键酶基因的克隆、
表达和调控是近年来的研究热点。植物体内三萜皂
1
1
62
21
122
41
182
61
242
81
302
101
362
121
422
141
482
161
542
181
602
201
662
221
722
241
782
261
842
281
902
301
962
321
1 022
341
1 082
361
1 142
381
1 202
401
1 262
1 322
1 382
1 442
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1039 •
苷主要通过甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径
合成[5]。MVA 途径中，SS 处于 FPP 到其他产物的
分支点上，FPP 除可以被 SS 催化产生鲨烯（SQ）
外，还可以在其他酶的催化下产生赤霉素、类胡萝

图 4 红花栝楼 SS 基因编码蛋白三维结构模型
Fig. 4 3D structure of SS-encoding protein from T. rubriflos

图 5 红花栝楼 SS 的疏水性与亲水性预测
Fig. 5 Hydrophobicity and hydrophilicity prediction of SS
gene from T. rubriflos

图 6 红花栝楼 SS 保守结构区域的预测
Fig. 6 Prediction of conserved domain of SS protein from T. rubriflos
0 50 100 150 200 250 300 350 400
4
3
2
1
0
−1
−2
−3
得
分

位置
1 75 150 225 300 375 417
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1040 •
楤木GU354313
人参AB115496
西洋参GU997681
三七DQ186630
北柴胡GQ889267
银柴胡AY964186
积雪草AY787628
黄花蒿AY445506
布朗葡萄藻AF205791
江南卷柏XM_002971905
蛇足石杉 JQ004938
东北红豆杉DQ836053
高粱XM_002466214
玉蜀黍AB007502
水稻AB007501
鼠耳芥D29017
陆地棉EF688567
远志DQ672339
百脉根AB102688
膜荚黄芪HQ829974
大豆AB007503
甘草AM182330
蒺藜苜蓿XM_003606992
黄甘草AM182331
洋甘草D86409
柿 FJ687954
绿玉树AB433916
毛果杨XM_002313729
木榄GU478981
本氏烟U46000
烟草U60057
番茄NM_001247787
马铃薯AB022599
睡茄GU474427
辣椒AF124842
丹参FJ768961
假马齿苋GU734711
红花栝楼
罗汉果HQ128565
绞股蓝 FJ906799
金铁锁EF585250
图 7 不同植物 SS 氨基酸序列进化树
Fig. 7 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of SS
from different plants
卜素等。SQ 是所有三萜皂苷、甾醇、胆固醇等萜
烯类重要物质的共同前体[21]，因此对 SS 的研究具
有重要意义。
通过 GenBank 序列查询表明，目前尚无关于红
花栝楼 SS 基因序列的报道。本研究首次克隆出了
红花栝楼 SS cDNA 基因并对其进行了相关的生物
信息学分析，为进一步研究红花栝楼 SS 基因结构、
基因表达、基因突变提供了基础，并为三萜合成通
路关键酶 SS 的正选择位点与功能的关联性分析提
供了数据支持。
根据已知的 SS基因设计出红花栝楼 SS 基因 5’
端的简并引物，运用 3’RACE 试剂盒直接扩增出 SS
基因的全长，省去了 5’RACE 的步骤，方法简单可
行，节省经费开支，为后续研究提供了基础。本研
究克隆得到的红花栝楼 SS 基因与已知的罗汉果 SS
基因的编码区比较，一致性达到 93%，具有较高的
同源性。通过 NCBI 网站和一些生物信息学软件对
红花栝楼 SS 基因的碱基分布、氨基酸组成进行分
析，结果发现，该基因中 G＋C 的碱基量约为
41.54%，低于 50%，表明发生错配的概率较低，核
苷酸处于较稳定状态。通过 Clustal X 等生物信息学
软件将红花栝楼 SS 氨基酸与其他物种氨基酸的序
列进行多重比对和进化分析可知，序列之间的同源
性较高。例如，红花栝楼氨基酸序列：76～82
（LDTVEDD）、209～214（NIIRDY）、216～220
（EDINE）等区段同源性达 100%，说明其在进化过
程中具有高度保守性，对其他物种 SS 基因的克隆
与分离提供重要的数据支持。同时这些保守区基因
信息为其他物种中该基因的克隆提供了十分有价值
的序列信息，为加快基因克隆及 SS 基因的分子调
控研究奠定基础。从植物 SS 氨基酸序列的进化树
看到，亲缘关系近的科属，其 SS 的氨基酸序列一
致性更高。其中，五加科与伞形科 SS 的进化关系
更密切。葫芦科植物 SS 的序列尚有待增加。较大
差异的基因区段主要集中在 C 端。今后可通过实验
研究进一步验证通过 NCBI 的蛋白保守结构域数据
库（conserved domain database，CDD）中对红花栝
楼 SS 进行蛋白保守区预测的正确性。这些差异性
较大的区段可能与基因的进化与变异相关，这些仍
待确定。
参考文献
[1] Henry M, Rahier A, Taton M. Effect of gypsogenin
3-O-glucuronide pretreatment of Gypsohila paniculata
and Saponaria officinalis cell suspension cultures on the
activities of microsomal 2,3-oxidosqualene cycloarten-
oland amyrin cyclases [J]. Phytochemistry, 1992, 31(11):
3855-3859.
[2] 张 丹, 刘耀平, 鱼红闪, 等. 人参皂苷 8-葡萄糖苷酶
的分离纯化及其酶学特性 [J]. 应用与环境生物学报,
2003, 9(3): 259-262.
[3] Haralampidis K, Trojanowska M, Osbourn A E.
Biosynthesis of triterpenoid saponins in plants [J]. Adv
Biochem Eng Biotechnol, 2002(75): 31-49.
[4] 卢虹玉, 刘敬梅, 阳文龙, 等. 甘草鲨烯合威酶基因的
分离及植物表达栽体的构建 [J]. 药物生物技术, 2007,
14(4): 255-258.
[5] Jennings S M, Tsay Y H, Fisch T M, et al. Molecular
cloning and characterization of the yeast gene for
squalene synthetase [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,
88(14): 6038-6042.
[6] 刘 镛, 吴耀生, 胡艳玲, 等. 陆生植物鲨烯合酶适应
性进化正选择位点分析 [J]. 中国生物化学与分子生物
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 7 期 2015 年 4 月

• 1041 •
学报, 2013, 29(1): 91-97.
[7] 蒋军富, 李雄英, 吴耀生, 等. 绞股蓝鲨烯环氧酶基因
的克隆与序列分析 [J]. 西北植物学报, 2010, 30(8):
1520-1526.
[8] 毛乐心, 赵昶灵, 支伟特, 等. 人参属植物鲨烯合酶编
码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析 [J]. 中国农
学通报, 2012, 28(31): 220-226.
[9] 戴住波, 钱子刚, 胡运乾, 等. 金铁锁鲨烯合酶 cDNA
的克隆和功能鉴定 [J]. 药学学报 , 2008, 43(12):
1245-1250.
[10] 常 晶, 郭春华, 尹永志, 等. 青蒿鲨烯合酶 cDNA 的
克隆与序列分析 [J]. 安徽农业科学 , 2010, 38(10):
4996-4998.
[11] 张 毅, 刘 彦, 王 红. 转青蒿反义鲨烯合酶基因对
烟草鲨烯合酶基因表达的影响 [J]. 农业生物技术学
报, 2005, 13(4): 416-422.
[12] 马艺沔, 袁丽钗, 张林甦, 等. 2 个丹参鲨烯合酶基因
的克隆和鉴定 [J]. 中草药, 2014, 45(9): 1307-1312.
[13] 卢虹玉, 刘敬梅, 阳文龙. 甘草鲨烯合成酶基因的分离
及植物表达载体的构建 [J]. 药物生物技术 , 2007,
14(4): 255-258.
[14] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志 [M].
北京: 科学出版社, 1986.
[15] Takahashi N, Yoshida Y, Sugiura T, et al. Cucurbitacin D
isolated from Trichosanthes kirilowii induces apoptosis in
human hepatocellular carcinoma cells in vitro [J]. Int
Immunopharmacol, 2009, 9(4): 508-513.
[16] Scotto-Lavino E, Du G, Frohman M A. Amplification of
5’end cDNA with ‘new RACE’ [J]. Nat Protoc, 2006,
1(6): 3056-61.
[17] 蒋 东, 唐银琳, 陶晨陈, 等. 绞股蓝法呢基焦磷酸合
酶基因的克隆及其序列分析 [J]. 生物技术通讯, 2014,
25(2): 198-202.
[18] 张 萍, 刘迪秋, 葛 锋, 等. 三七 3-羟基-3-甲基戊二
酸单酰辅酶 A 还原酶基因的克隆和生物信息学分析
[J]. 中草药, 2014, 45(18): 2684-2690.
[19] 陈 莉, 蓝秀万, 李 珅, 等. 三七法呢基焦磷酸合酶
的基因克隆及序列分析 [J]. 中草药 , 2006, 37(7):
1080-1083.
[20] Mount D W. 序列与基因组分析 [M]. 北京: 高等教育
出版社, 2003.
[21] 张风侠, 梁新华, 王 俊. 植物三萜皂苷生物合成及关
键酶鲨烯合酶的研究进展 [J]. 农业科学研究, 2009,
30(3): 64-68.