全 文 ：·1284· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 9 期 2014 年 5 月

蔓荆子总黄酮抑制 NCI-H446 细胞系肺癌干细胞自我更新
曹晓诚，肖立红，肖 荞，盛习锋*
湖南师范大学医学院 药物工程重点实验室，湖南 长沙 410013
摘 要：目的 观察蔓荆子总黄酮（Viticis Fructus total flavonoids，VFTF）抑制人小细胞肺癌 NCI-H446 细胞系肺癌干细胞
（lung cancer stem cells，LCSCs）自我更新能力的作用。方法 体外培养 NCI-H446 细胞系细胞，免疫磁珠分选和干细胞条件
培养基悬浮培养得到和扩增 LCSCs；肿瘤球形成法检测自我更新能力，Western blotting 分析自我更新相关转录因子 Bmi1 和
磷酸化 Akt（p-Akt）蛋白表达。结果 VFTF 显著抑制 LCSCs 自我更新能力，呈浓度依赖性（P＜0.05）；与亲本细胞比较，
LCSCs 细胞 Bmi1 和 p-Akt 蛋白表达水平增高；VFTF 能有效下调 LCSCs 细胞 Bmi1 和 p-Akt 蛋白表达；PI3K 特异性阻断剂
LY294002 增强 VFTF 抑制 LCSCs 自我更新能力的作用。结论 VFTF 抑制源自 NCI-H446 细胞系 LCSCs 自我更新能力的作
用与其下调 p-Akt 蛋白表达和抑制细胞自我更新相关转录因子 Bmi1 有关。
关键词：蔓荆子总黄酮；肺癌；肺癌干细胞；自我更新；Akt
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)09 - 1284 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.09.016
Inhibition of Viticis Fructus total flavonoids on self-renewal of lung cancer stem
cells derived from NCI-H446 cell line
CAO Xiao-cheng, XIAO Li-hong, XIAO Qiao, SHENG Xi-feng
Key Laboratory of Medicine Engineering, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China
Abstract: Objective To examine whether and how Viticis Fructus total flavonoids (VFTF) inhibit the capacity of self-renewal in lung
cancer stem cells (LCSCs) derived from human small cell lung cancer NCI-H446 cell line. Methods NCI-H446 cell line was cultured
in vitro. LCSCs were obtained and amplified by Magnetically activated cell sorting system (MACS) and suspended culture with
serum-free conditioned medium. The capacity of self-renewal was detected by tumor sphere-forming assay. The protein expression
levels of the self-renewal associated transcription factors, Bmi1 and p-Akt, were analyzed using Western blotting. Results VFTF
significantly suppressed the capacity of self-renewal in LCSCs, in a concentration-dependent manner (P < 0.05). The expression levels
of Bmi1 and p-Akt were elevated in LCSCs, compared with parental cells. VFTF effectively down-regulated the expression levels of
Bmi1 and p- Akt in LCSCs. In addition, LY294002, a PI3K specific inhibitor, enhanced the inhibition of VFTF on the capacity of
self-renewal in LCSCs. Conclusion VFTF could inhibit the self-renewal capacity of LCSCs derived from NCI-H446 cell line , which
is associated with down-regulation of the expression of p-Akt and self-renewal associated transcription factors Bmi1.
Key words: Viticis Fructus total flavonoids; lung cancer; lung cancer stem cells; self-renewal; Akt

肿瘤组织中存在极少部分具有干细胞特性的肿
瘤细胞，称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）。
CSCs 决定肿瘤发生、转移与复发；是临床肿瘤治
疗中最重要的靶细胞；抑制和杀灭 CSCs 是彻底治
愈肿瘤的关键。蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆
Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. 或蔓荆 Vitex
trifolia L. 的干燥成熟果实。研究表明蔓荆子有效活
性成分紫花牡荆素优先抑制胶质瘤干细胞样细胞增
殖活性 [1]。蔓荆子总黄酮（Viticis Fructus total
flavonoids，VFTF）是一种自主研制的抗肿瘤候选
中药制剂（专利申请号 201210591146.9）。本研究旨
在检定 VFTF 是否以及如何抑制人小细胞肺癌
NCI-H446 细胞系肺癌干细胞（lung cancer stem
cells，LCSCs）自我更新能力。

收稿日期：2013-09-22
基金项目：湖南省研究生科研创新项目资助（Cx2013B225）；湖南省科技厅科技计划项目（2011FJ4144）
作者简介：曹晓诚（1989—），男，湖南师范大学生药学硕士研究生。Tel: (0731)88912434 E-mail: Caocheng268@163.com
*通信作者 盛习锋，女，湖南师范大学天然药物化学副教授。E-mail: 1273939213@qq.com
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1 材料与仪器
1.1 药品与试剂
VFTF 按照国家发明专利申请资料的方法制
备，本品为棕褐色粉末状固体，含总黄酮量以芦丁
计为 53%。鼠抗人 p-Akt（ser473）、Akt 和 Bmi1 单
克隆抗体为美国 Cell Signalingg 公司产品；鼠抗人
β-actin 单克隆抗体购自美国 Sigma 公司。辣根过氧
化酶偶联山羊抗鼠二抗购自 Santa Cruz 生物技术公
司。增强化学发光检测试剂购于美国 Amersham
Pharmacia Biotech 公司。 PI3K 特异性阻断剂
LY294002 购于美国 Calbiochem 公司。藻红蛋白
（PE）连接抗人 CD133/2 抗体购自 Miltenyi Biotec
公司；PE 标记抗鼠免疫球蛋白 IgG2b 抗体购自美国
Zymed Laboratories 公司。
1.2 细胞系与细胞培养
人小细胞肺癌 NCI-H446 细胞系购自中国科学
院上海细胞库。参照文献方法进行常规单层贴壁生
长细胞培养和干细胞条件培养基悬浮培养[2]。
2 方法
2.1 NCI-H446 细胞 CD133 免疫磁珠分选和 PE 荧
光标记 CD133 流式细胞术分析
分别取分选后的 CD133+和 CD133−细胞以及非
分选细胞用 PBS 洗涤后，调整细胞密度至 1×
105/mL，分装于 EP 管中，PE 标记的抗人 CD133
抗体和 PE 标记的抗 IgG2b 同型对照抗体避光 4 ℃
孵育 30 min，用流式细胞仪 Calibur（FACS 420，
Becton Dickinson，美国）检测以及 Cell Quest 软件
进行分析，每管计数 10 000 个细胞。
2.2 肺癌球形成实验
取 NCI-H446 细胞系非分选细胞，通过 0.25%
胰蛋白酶消化，同时取从 NCI-H446 细胞系分选得
到的 CD133+细胞，制备单细胞悬液。细胞以 2 000
个 /mL 密度接种于 6 孔超低黏附细胞培养板
（Corning Inc.，Corning，NY，美国），用添加 VFTF
（0.5、1.0、2.0 μg/mL）或 LY294002（5.0、10.0、
20.0 μmol/L）或两者联用的干细胞条件培养基培养
6 d 后，在 Olympus IX51 显微镜（Olympus Inc.）下
计数肿瘤细胞球的个数，并在 OLYMPUS BX41 倒
置显微镜（Olympus Inc.）下获得照片。
2.3 有限稀释法
将分散得到的单个 CD133+肺癌球形成细胞悬
液稀释至细胞密度 500 个/mL，然后用每孔 2 μL 单
细胞悬液接种超低黏附 96 孔细胞培养板（Corning
Inc.，Corning，NY，美国），再加入 150 μL 干细胞
条件培养基。标记每孔只有 1 个细胞的孔，并每天
观察，共计 8 d。
2.4 Western blotting 分析
参照文献报道的方法获得细胞总提取物[2]。以
10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取的蛋白质，
并转移至 PVDF 膜。该膜首先在 PBST 中以脱脂牛奶
5%进行封闭，为了进行探针检测，随后以标示的一
抗孵育，轻微震动下，4 ℃条件下过夜。冲洗膜 4 次
后，以适当的过氧化物酶标记的二抗孵育上述 PVDF
膜 1 h。以增强化学发光试剂盒对信号进行检测。
2.5 统计分析
实验数据录入 SPSS 16.0，建立数据库，各组实
验数据均以 ±x s 表示，用 One Way ANOVA 进行方
差分析。当方差齐性时，各组均数间的两两比较用
LSD 法；方差不齐时，对照组均数与实验组均数间
比较用 Dunnett 法。
3 结果与分析
3.1 NCI-H446 细胞系 CD133+细胞、CD133−细胞
和亲本细胞 CD133 表达状态
NCI-H446细胞系CD133+细胞群的CD133阳性
细胞百分率是（89.52±2.17）%；CD133−细胞群的
CD133 阳性细胞百分率是（0.04±001）%；亲本细
胞（PC）的 CD133 阳性细胞百分率是（1.41±0.26）
%（图 1-A）。表明 CD133 抗体免疫磁珠分选能得
到纯的 NCI-H446 细胞系 CD133+细胞群。在每孔
接种 1 000 个细胞的情况下，在相同的时间点（第
6 天），CD133+细胞的肺癌球体积大于亲本细胞
（图 1-B）；并且 CD133+细胞的肺癌球形成数高于
亲本细胞（图 1-C）。
3.2 CD133+肺癌球形成细胞高表达磷酸化 Akt
（p-Akt）和自我更新相关转录因子 Bmi1 蛋白
来自NCI-H446细胞系的CD133+肺癌球形成细
胞的单个细胞能生长形成新的肺癌球（图 2-A）；进
一步证明NCI-H446细胞系的CD133+肺癌球形成细
胞具有体外自我更新能力。Western blotting 分析结
果显示：与亲本细胞相比，NCI-H446 细胞系 CD133+
肺癌球形成细胞高表达 p-Akt 蛋白和自我更新相关
转录因子 Bmi1 蛋白（图 2-B）。
3.3 VFTF 抑制 LCSCs 自我更新能力
肿瘤球形成实验结果表明，VFTF 显著缩小肺癌
球的体积（图 3-A），同时降低 NCI-H446 细胞系
CD133+肺癌球形成细胞的肺癌球形成数目（图3-B）。
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与亲本细胞系比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs parented cell group
图 1 NCI-H446 细胞系 CD133+细胞和亲本细胞 CD133
表达 (A) 和肺癌球形成能力 (B、C) 的比较
Fig. 1 Comparison on CD133 expression (A) and lung cancer
sphere-forming capability (B and C) between NCI-
H446cell line CD133+ cells and parental cells

图 2 具有自我更新特性的 LCSCs 组成性活化 Akt
和高表达 Bmi1 蛋白
Fig. 2 Constitutive activation of Akt and high expressed Bmi1
protein in LCSCs with capacity of self-renewal





与对照组比较：*P＜0.05；与 VFTF 0.5 μg·mL−1 组比较：#P＜0.05
*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs VFTF 0.5 μg·mL−1 group
图 3 VFTF 对 LCSCs 自我更新能力的影响
Fig. 3 Effect of VFTF on self-renewal ability of LCSCs
3.4 VFTF 下调 LCSCs p-Akt 蛋白和 Bmi1 蛋白表
达水平
Western blotting 分析结果显示，VFTF（0.5、
1.0、2.0 μg/mL）以质量浓度依赖方式下调 NCI-H446
细胞系 CD133+肺癌球形成细胞 p-Akt 和 Bmi1 蛋白
表达水平（图 4）。

图 4 VFTF 对 LCSCs 中 p-Akt 和 Bmi1 蛋白表达的影响
Fig. 4 Effects of VFTF on protein expression of p-Akt
and Bmi1 in LCSCs
3.5 LY294002增强VFTF抑制LCSCs 自我更新作用
为了证明 VFTF 是否通过抑制 Akt 信号通路从
而抑制肿瘤球的自我更新能力，采用 PI3K 特异性
抑制剂 LY294002 处理或联合处理，肿瘤球形成实
验结果表明，不同浓度 LY294002（5.0、10.0 和 20.0
μmol/L）抑制肺癌球形成，呈浓度依赖性（图 5-A）；
此外，LY294002（5.0 μmol/L）预孵育 1 h 后，与
VFTF（1.0 μg/mL）联合处理导致 NCI-H446 细胞系
CD133+肺癌球形成细胞肺癌球形成数目进一步降
低（图 5-B）。
4 讨论
2008 年，Eramo 等[3]首次在小细胞和非小细胞
肺癌中发现一群稀少的未分化细胞表达干细胞表面
标志物 CD133，并发现其具有自我更新能力、多向
分化潜能、高致瘤性和耐药性，并把这种 CD133+
的肺癌细胞定义为肺癌干细胞（lung cancer stem
cells，LCSCs）。在本研究中，使用免疫磁珠分选法
和干细胞悬浮培养法从人小细胞肺癌 NCI-H446 细
胞系中分选并得到 CD133+肺癌球形成细胞，并证
实其具有自我更新能力和高表达自我更新相关转录
因子 Bmi1 蛋白。
蔓荆子是收载于《中国药典》2010 年版的一种
中药，具有消热解表、利湿解毒、止咳祛痰、缓解
支气管痉挛等症状的作用。本实验通过肿瘤球形成
实验发现VFTF可以显著降低LCSCs肺癌球球形成
数目并缩小肺癌球的体积，表明 VFTF 能有效抑制
A
B C
对照
0.01%
PC
1.68%
CD133+细胞 CD133−细胞
PC CD133+细胞
PC CD133+细胞
*600
500
400
300
200
100
0
细
胞
癌
球
形
成
数

PC CD133+细胞
p-Akt
Akt
Bmi1
β-actin
4 d 8 d
A B
1 d 2 d
p-Akt
Akt
Bmi1
β-actin
对照 0.5 1.0 2.0
VFTF / (μg·mL−1)
对照 0.5 1.0 2.0
VFTF / (μg·mL−1)
A
300
250
200
150
100
50
0
细
胞
癌
球
形
成
数

*
*#
*#
对照 0.5 1.0 2.0
VFTF / (μg·mL−1)
B
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与对照组比较：*P＜0.05；与单用 VFTF（1.0 μg·mL−1）或 LY294002（5.0 μmol·L−1）组比较：#P＜0.05
*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs treatment with VFTF (1.0 μg·mL−1) or LY294002 (5.0 μmol·L−1) alone group
图 5 LY294002 (A)、VFTF 及两者联用 (B) 对 LCSCs 自我更新能力的影响
Fig. 5 Effects of LY294002 (A), VFTF, or LY294002 + VFTF (B) on self-renewal ability of LCSCs
LCSCs 自我更新能力。本研究还发现 PI3K 特异性
阻断剂 LY294002 可以增强 VFTF 抑制 LCSCs 自我
更新的能力，反映 VFTF 可能以不同于 LY294002
的方式抑制 Akt 活性；或者，VFTF 除抑制 Akt 活
性外还存在其他的作用机制。总之本实验结果为两
者联用靶向抑制 LCSCs 自我更新提供了可能性。
Bmi1 属于多梳基因家族（polycomb of genes，
PcG）成员。有研究表明 Bmi1 是人类造血干细胞维
持自我更新能力的关键因子[4]。Zhou 等[5]发现 Bmi1
通过沉默包括 p16INK4A在内的靶基因调节肺癌干细
胞的自我更新和致瘤性。Akt 是磷脂酰肌醇 3-激酶
（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt 信号传
导通路的核心。Liu 等[6]的研究发现 Akt 通过调节
Bmi1 等多梳家族蛋白维持造血干细胞自我更新能
力。而本课题组的前期研究也表明 LY294002 降低
源自人小细胞肺癌 NCI-H446 细胞系肺癌球形成细
胞 Akt 蛋白磷酸化水平，并以剂量依赖方式抑制肺
癌球形成能力[7]。本实验结果表明 VFTF 能同时下
调 LCSCs 中磷酸化 Akt 和 Bmi1 蛋白表达，并可以
有效抑制 LCSCs 自我更新能力。结合上述文献报
道，推断 VFTF 可能通过降低 Akt 磷酸化水平，从
而下调 Bmi1 表达，进而抑制 LCSCs 自我更新能力。
综上所述，VFTF 具有抑制源自人小细胞肺癌
NCI-H446 细胞系 LCSCs 自我更新能力的作用，作
用机制涉及下调磷酸化 Akt 和 Bmi1 蛋白表达，最
终抑制肿瘤干细胞自我更新能力。本实验的研究结
果突出了 VFTF 可能是治疗肺癌等恶性肿瘤的有效
候选药物的价值。然而，VFTF 抑制肿瘤干细胞 Akt
磷酸化的作用机制以及是否具有在体根除肿瘤干细
胞的作用仍需进一步研究。
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400
300
200
100
0
400
300
200
100
0
B A
对照

5.0 10.0 20.0
LY294002 / (μmol·L−1)
0＋0 0＋1.0 5.0＋0 5.0＋1.0
LY294002 / (μmol·L−1)＋VFTF / (μg·L−1)
*
*
*
*
*
*# 细
胞
癌
球
形
成
数

细
胞
癌
球
形
成
数