全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 15 期 2014 年 8 月

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罗汉果内参基因筛选和 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶时空表达分析
郭茜茜 1, 2，马小军 3，白隆华 2，潘丽梅 2，冯世鑫 2，莫长明 2, 4*
1. 东北农业大学农学院，黑龙江 哈尔滨 150030
2. 广西药用植物园，广西 南宁 530023
3. 中国医学科学院药用植物研究所，北京 100094
4. 广西大学农学院，广西 南宁 530004
摘 要：目的 筛选罗汉果 Siraitia grosvenorii 基因表达分析的内参基因，研究苷 V 生物合成关键酶 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶
A 还原酶（HMGR）时空表达特性。方法 克隆罗汉果看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、微管蛋白（α-tubulin）、肌动
蛋白（β-actin）和泛素（UBQ5）的基因片段，评价了 4 个基因在不同部位（叶、茎和果）及果实发育不同时期的稳定性，筛
选内参基因，分析 HMGR 的时空表达特性。结果 UBQ5 表达最稳定，适宜作为内参基因；叶片的 HMGR 相对表达量较低，
茎和果实相对表达量较高；果实不同发育时期，HMGR 的相对表达量呈现先升高再降低然后再升高再降低的波动式变化，70 d
后 HMGR 的相对表达量最高，然后依次是 5、30、10、50 d。结论 UBQ5 是适宜的内参基因。叶片、茎和果实中，HMGR 的
相对表达量差异明显。果实发育不同时期，HMGR 的相对表达量呈波动式变化，与苷 V 合成积累变化规律相似。
关键词：罗汉果；看家基因；内参基因；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶；时空表达特性；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；微管
蛋白；肌动蛋白；泛素
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)15 - 2224 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.15.020
Screening of reference genes in Siraitia grosvenorii and spatio-temporal
expression analysis of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
GUO Qian-qian1, 2, MA Xiao-jun3, BAI Long-hua2, PAN Li-mei2, FENG Shi-xin2, MO Chang-ming2, 4
1. College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
2. Guangxi Medicinal Botanical Garden, Nanning 530023, China
3. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100094, China
4. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China
Abstract: Objective To screen the reference genes of Siraitia grosvenorii for gene expression analysis, and to study the spatio-temporal
expression characteristics of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMGR) which was the key enzyme of mogroside V biosynthesis.
Methods In this study, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), microtubule associated protein (α-tubulin), actin
(β-actin), and ubiquitin (UBQ5) fragments of S. grosvenorii were cloned, and the stabilities of the four housekeeping genes were evaluated
in different positions (leaves, stems, and fruits) and different periods of fruit development. In addition, the spatio-temporal expression of
HMGR gene was analyzed. Results UBQ5 was the most suitable reference gene for spatio-temporal expression analysis in S. grosvenorii;
The relative expression of HMGR was low in leaves, and that in stems and fruits was higher; The relative expression quantity of HMGR in
fruits showed the fluctuation changes that increased firstly and then decreased, then increased and decreased again; The highest expression
of HMGR was at 70 d of fruit development period, followed by 5, 30, 10, and 50 d. Conclusion UBQ5 is the most suitable reference gene
in S. grosvenorii. The relative expression of HMGR changes significantly in leaves, stems, and fruits. The relative expression quantity of
HMGR in fruits shows the fluctuation changes, which is similar to synthetic accumulation pattern of mogroside V.
Key words: Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey; housekeeping gene; reference gene; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A;
spatio-temporal expression characteristics; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; microtubule associated protein; actin; ubiquitin

收稿日期：2014-01-23
基金项目：广西自然科学基金青年基金项目（2011GXNSFB018088）
作者简介：郭茜茜（1983—），女，博士研究生，研究方向为作物生理学。Tel: (0771)2443056 E-mail: xxguo19850502@126.com
*通信作者 莫长明 Tel: (0771)5610462 E-mail: mochming@126.com
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罗汉果 Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey 是
中国传统药材[1]。1995 年，美国食品药品管理局
（FDA）批准罗汉果甜苷用作食品添加剂。罗汉果
的“甜味成分”实际上是葫芦烷三萜苷类化合物，
它们拥有共同的苷元——葫芦烷型四环三萜骨架
（罗汉果醇），除少数几种化合物外均具有甜味[2]。
其中，苷 V 是主要甜味成分[3]，甜度相当于蔗糖的
256～344 倍[4-5]，作为食糖代用品受到广泛关注。
植物体自然生产苷 V 的量很少，可以通过植物改良
或工程菌生产等方式提高苷 V 的产量，满足其应用
开发的需求。因此，对苷 V 的生物合成机制的研究
意义重大。本课题组对罗汉果萜类物质生物合成机
制有一定的研究，预测了苷 V 的生物合成路径[6]，
并且正在进行相关的下游研究工作。MEP 路径的产
物异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯焦磷酸
（DMAPP）是罗汉果醇的合成前体[6-7]。3-羟基-3-
甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）是 2-甲基-D-
赤藓糖醇-4-磷酸代谢途径的第一个关键酶和限速
酶。HMGR 活性在一定程度上影响着罗汉果醇的合
成及甜苷的积累。
定量 PCR 是基因表达分析的重要工具，具有灵
敏度高、定量准确和速度快等优点。基因表达的时空
特 性 分 析 通 常 使 用 相 对 定 量 分 析 （ relative
quantification，RQ）法。以一个稳定表达的看家基因
作为内对照，即内参基因（reference gene），根据目标
基因相对于内参基因的升高或降低表现，判断目标基
因的表达特性[8-9]。植物研究中，常用的看家基因很多，
需要根据不同的实验要求酌情筛选，因为在任何组织
器官及各种处理下，都能够稳定表达的理想型内参基
因是不存在的。选择适宜的内参基因是定量 PCR 研
究的基础，也是定量 PCR 分析准确性的保障。
本研究克隆了罗汉果甘油醛-3-磷酸脱氢酶
（GAPDH）、微管蛋白（α-tubulin）、肌动蛋白（β-actin）
和泛素（UBQ5）基因的片段，分析比较了它们的
稳定性，筛选罗汉果不同部位（叶、茎和果）及果
实发育不同时期基因表达分析的内参基因，为罗汉
果的基因表达研究奠定方法学基础。利用所选内参
基因，分析苷 V 生物合成关键酶编码基因 HMGR
的时空表达特性，为其生物合成机制和合成路径的
改造研究提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料
罗汉果 Siraitia grosvenorii (Swingle) C. Jeffrey
采自广西药用植物园，经中国医学科学院药用植物
研究所马小军研究员鉴定为“农院 B6”品种。采集
授粉后 5 d 的叶片、茎及授粉后 5、10、30、50、70
d 的青果，茎和叶片剪成小块，青果取果肉，液氮
速冻，−80 ℃保存备用。
1.2 RNA 分离
100 mg 冻鲜样液氮保护下研磨成粉末状，转移
至预冷的 1 mL TRIzol（Invitrogen）试剂中裂解 15
min，0.2 mL 氯仿抽提蛋白质 2 次，1 mL 异丙醇沉
淀 RNA 10 min，沉淀 RNA 溶解于 30 μL ddH2O 中。
1%琼脂糖凝胶电泳检验 RNA 的纯度和完整性。
1.3 看家基因片段的克隆
采用 PrimeScilpt II 1st Strand cDNA Synthesis Kit
（TaKaRa，D6210s）试剂盒，Oligo dT 作为引物逆转
录得到 cDNA。克隆看家基因的简并引物见表 1。使
用 Primix LA Taq 酶（TaKaRa，D336A）扩增 GAPDH、
α-tubulin、β-actin 和 UBQ5 的基因片段，纯化回收后
连入克隆菌，进行蓝白斑筛选，挑取阳性菌，PCR
扩增检测，再测序检测，通过 NCBI BLAST 比对确
认序列的正确性。利用正确的看家基因片段设计定量
PCR 引物（表 2），进行定量 PCR 反应。
表 1 看家基因片段克隆的简并引物
Table 1 Degenerate primers of housekeeping genes cloning
名称 引物序列（5’-3’） 目标片段长度 / bp
GAPDH 正向引物 TGTTCGTGGTGGGCGTNAAYGARAA 461
反向引物 GGACACCACGTCGTCCTCNGTRTANCC
α-tubulin 正向引物 GGAGAAGATGACCCAGATCATGTTYGARACNTT 863
反向引物 CCTTGGCGATCCACATCTGNTGRAANGT
β-actin 正向引物 CGGGCCGTGTTCATGGAYYTNGARCC 731
反向引物 AAGTTGGTGGGGCACCANTCNRYRAA
UBQ5 正向引物 GGAGGTGGAGTCCTCCGAYACNATHGA 408
反向引物 TGGTACACGTAGGTCAGGCCRCAYTTNCC
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表 2 定量 PCR 引物序列
Table 2 Primer sequence of quantitative PCR
名称 引物序列（5’-3’） 目标片段长度 / bp
HMGR 正向引物 TCTTCAATCGCAGCCAACAA 243
反向引物 AGGACGCTATGAGGGAAACAAT
β-actin 正向引物 CTCAAAGACCAGCTCTTCAGTTGA 134
反向引物 TACCAGCAGCCTCCATACCAA
GAPDH 正向引物 TGTTCACTCAATCACTGCCACC 230
反向引物 TTGCCTTCTTCTCCAACCTCA
UBQ5 正向引物 ATAAAAGACCCAGCACCACATTC 234
反向引物 CCCTTGCCGACTACAACATCC
α-tubulin 正向引物 TTGTTCGTGGTATGCCTTCTC 264
反向引物 ACTGATGTTGCTGTGCTCCTC

逆转录采用 Random 6 mers 引物获得 cDNA。
定量 PCR 反应使用 ABI7500 定量 PCR 仪，相对标
准曲线法进行基因表达量分析。SYBR® Premix Ex
TaqTM II（TaKaRa，DRR820A）试剂盒，反应体系
是 25 μL，引物终浓度为 0.2 μmol/L，模板 1.0 μL，
ROX Reference Dye II 0.5 μL，H2O 补足体系，设
置 3 个重复。阴性对照用 1.0 μL 水代替模板。反应条
件：95 ℃、5 s 活化反应酶；三步法 95 ℃、5 s，58 ℃、
30 s，72 ℃、34 s，40 个循环；溶解度曲线条件：95 ℃、
15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、30 s，60 ℃、15 s。制作
标准曲线采用梯度稀释法，原液作为最高浓度反应液
1，1 3∶ 依次稀释，得到反应液 2、3、4 和 5。原液 1 20∶
稀释作为样品反应液。通过网站 http://www.leonxie.
com/referencegene.php 分析筛选内参基因。
2 结果与分析
2.1 克隆看家基因片段
GAPDH、α-tubulin、β-actin 和 UBQ5 等常用作
内参基因，罗汉果中没有相应的序列报道。根据近
缘物种基因序列设计简并引物，克隆 GAPDH、
α-tubulin、β-actin 和 UBQ5 4 个基因的部分片段。
克隆片段测序结果的 BLAST 比对见表 3。克隆片段
与不同物种相应基因序列同源性高于 75%，即所得
克隆为目标基因。
2.2 优化定量 PCR 反应
用双标准曲线定量法，分析罗汉果 GAPDH、
α-tubulin、β-actin 和 UBQ5 表达变化情况。反应体
系优化，选择适宜的模板浓度和引物浓度，反应条
件优化主要考虑退火温度和延伸时间。定量 PCR 反
表 3 看家基因片段 BLAST 比对部分结果
Table 3 Partial BLAST results of housekeeping gene fragments
看家基因 编号 来源 覆盖率 / % E 值 同源性 / %
HQ156465.1 黄瓜 Cucumis sativus 97 1.56×10−4 91
FQ394406.1 葡萄 Vitis vinifera 98 1.28×10−5 86
GAPDH
JQ183068.1 辽东木 Aralia elata 97 0.126 86
XM004156822.1 黄瓜 Cucumis sativus 96 0 90
X67162.1 扁桃 Amygdalus communis 96 0 88
α-tubulin
FJ228477.1 垂枝桦 Betula pendula 96 0 86
DQ115882.1 黄瓜 Cucumis sativus 93 0 93
JF737035.1 籼稻 Manaifera indica 99 0 86
β-actin
JF781303 桔梗 Platvcodon qrandiflorum 99 0 85
AY372537.1 黄瓜 Cucumis sativus 99 1.330 90
DQ839403.1 桑 Morus bombvcis 99 0.125 88
UBQ5
AF386524.1 西洋梨 Pyrus communis 99 0.125 88
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应常用 2 步法。但是，本研究的扩增片段设计较长，
95 ℃、5 s 和 60 ℃、34 s 扩增效果不是很好。改
用 3 步法，退火温度为 58 ℃，延伸时间为 34 s。
热启动消除了热循环开始前非特异性产物的影响，
保证了定量 PCR 反应特异性。
GAPDH、α-tubulin、β-actin 和 UBQ5 的标准曲线
参数、扩增效率和溶解温度见表 4。斜率为−（3.350±
0.088），在−3～−3.5 内。相关系数均大于 0.99，高
于定量 PCR 反应要求的 0.98。扩增效率（98.991±
3.609）%，大于 0.80 小于 1.20。α-tubulin 扩增效率
95.382%距离理想扩增效率 100%较大，但仍处于合
理范围内。GAPDH 和 UBQ5 的斜率、相关系数和
扩增效率都很接近。
Ct 的大小反映了对应基因的表达丰度高低。
叶片、茎和果实中，β-actin 的 Ct 平均值最大（表
5），即其表达丰度低于其他 3 个基因。同一个基
因的 Ct 即使相差一两个循环，在扩增量呈指数变
化趋势的状态下，不同样品间基因表达量的差异
也是很大的。叶片中 α-tubulin 的 Ct 为 27.757，高
于茎/果实的 22.322/23.1.00（5/4 个循环），可知
叶片与茎/果实中 α-tubulin 表达丰度相差很大。
GAPDH、β-actin 和 UBQ5 基因 70 d 的 Ct 值大于
50 d 5 个循环以上，表达丰度明显低于其他时期
（表 6）。溶解度曲线反映了 PCR 反应的特异性。
GAPDH、α-tubulin、β-actin 和 UBQ5 峰值单一，
特异性较好（表 5、6）。
表 4 看家基因标准曲线参数、扩增效率和溶解温度
Table 4 Standard curve parameters, amplification efficiency, and solution temperature of housekeeping genes
基因名称 斜率 相关系数 扩增效率 / % 溶解温度平均值 / ℃
GAPDH −3.262 0.999 102.599 84.624
β-actin −3.298 0.996 101.021 83.568
UBQ5 −3.262 0.998 102.568 85.930
α-tubulin −3.438 1.000 95.382 84.900

表 5 叶片、茎和果实看家基因 Ct 和溶解温度平均值
Table 5 Ct and average melting temperature of housekeeping genes in leaves, stems, and fruits
Ct 平均值 溶解温度平均值 / ℃ 基因名称
叶片 茎 果实 叶片 茎 果实
GAPDH 21.551 19.932 21.521 84.507 84.630 84.94
β-actin 28.766 27.862 27.665 83.830 83.703 83.83
UBQ5 23.346 21.771 21.659 85.860 85.670 86.04
α-tubulin 27.757 22.322 23.100 84.690 84.630 85.18

表 6 果实不同发育时期看家基因 Ct 和溶解温度的平均值
Table 6 Ct and average melting temperature of housekeeping genes in different development periods of fruits
Ct 平均值 溶解温度平均值 / ℃ 基因名称
5 d 10 d 30 d 50 d 70 d 5 d 10 d 30 d 50 d 70 d
GAPDH 21.035 24.079 24.633 25.337 32.821 84.640 84.520 84.333 84.640 84.333
β-actin 27.144 29.735 33.684 34.480 36.653 83.450 83.480 83.390 83.540 82.900
UBQ5 20.922 23.105 24.943 26.286 33.309 85.920 86.040 85.737 85.980 85.737

2.3 看家基因稳定性评价
利用网站 http://www.leonxie.com/reference gene.
php 的 Delta CT、BestKeeper、Normfinder 和 Genorm 4
种方法综合分析看家基因的稳定性，简化了内参基因
的分析过程。罗汉果叶、茎及果中 GAPDH、α-tubulin、
β-actin 和 UBQ5 表达稳定性分析结果见图 1。Delta
CT、Normfinder 和 Genorm 的基因稳定性 M 值排序
是相同的，UBQ5 的稳定性最高，α-tubulin 的稳定性
最低。BestKeeper 数据分析显示 β-actin 和 GAPDH
的 M 值相同，UBQ5 稳定性最高，α-tubulin 的稳定
性最低。看家基因稳定性的综合分析见图 2-A。
UBQ5 的稳定性最高，适合用作内参基因，β-actin
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图 1 4 个看家基因稳定性分析
Fig. 1 Stability analysis of four housekeeping genes

图 2 4 个 (A) / 3 个 (B) 看家基因稳定性综合分析
Fig. 2 Stability analysis of four (A) / three (B) housekeeping genes
稳定性其次，之后是 GAPDH 和 α-tubulin。本研究
旨在选择一个适用于罗汉果叶、茎和果实生长发育
过程中的内参基因，鉴于 α-tubulin 的稳定性很低，
就不再用于果实发育过程的表达分析了。3 个看家
基因的综合分析显示 UBQ5 稳定性最高，β-actin 的
稳定性最低（图 2-B）。
果实不同发育时期，GAPDH、β-actin 和 UBQ5
表达稳定性分析结果见图 3。与其他 3 个程序不同，
BestKeeper 的分析结果显示，GAPDH 稳定性最高，
UBQ5 稳定性最低，β-actin 的稳定性介于二者之间。
Delta CT、Normfinder 和 Genorm 分析显示 UBQ5 稳
定性最高，其次是 GAPDH，稳定性最低的是 β-actin。
2.4 HMGR 的时空表达分析
HMGR 基因定量 PCR 扩增标准曲线的斜率是
−3.097，相关系数 0.998，均处于合理范围内。扩增
效率 109.321，与 GAPDH 和 UBQ5 的扩增效率较为

图 3 3 个看家基因稳定性分析
Fig. 3 Stability analysis of three housekeeping genes
为接近。相同的反应体系中，HMGR 扩增效率高
于所有看家基因，可能是 HMGR 本身的扩增活性
较高的原因。茎和果实的 Ct 值分别为 26.645 和
26.465，小于叶片（32.633），二者中 HMGR 的表
达丰度较高。70 d 的 Ct 值（36.936）最大，与看
家基因相似，HMGR 70 d 的 Ct 值大于果实其他发
育时期。果实发育后期，HMGR 的表达丰度明显
降低。
HMGR 的溶解度曲线为单峰，叶片、茎和果实
不同发育时期（5、10、30、50、70 d）的峰值均接
近于 85 ℃，PCR 扩增特异性较好。HMGR 产物溶
解度与 UBQ5 的溶解度最接近。
本研究采用 UBQ5 作为内参基因，分析 HMGR
的表达情况（图 4）。HMGR 在叶片中相对表达量最
低，茎中最高，果实中次之。茎和果实中 HMGR 的
相对表达量明显高于叶片中表达量。果实发育过程

图 4 叶、茎、果 (A) 和果实不同发育时期 (B)
HMGR 表达的变化
Fig. 4 Expression change of HMGR gene in leaves, stems, fruits
(A) and different fruit development periods (B)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
Delta CT
表
达
稳
定
性
平
均
值
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
BestKeeper
UBQ5 β-actin GAPDH α-tubulin UBQ5 β-actin GAPDH α-tubulin
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
表
达
稳
定
性
平
均
值

Normfinder Genorm
UBQ5 β-actin GAPDH α-tubulin UBQ5 β-actin GAPDH α-tubulin
1.5
1.0
0.5
0
5
4
3
2
1
0
表
达
稳
定
性
平
均
值
3.0
2.0
1.0
0
UBQ5 β-actin GAPDH α-tubulin UBQ5 GAPDH β-actin
Delta CT
4
3
2
1
0
BestKeeper
UBQ5 GAPDH β-actin GAPDH β-actin UBQ5
Normfinder Genorm
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 表
达
稳
定
性
平
均
值
2.0
1.5
1.0
0.5
0
UBQ5 GAPDH β-actin UBQ5 GAPDH β-actin
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 表
达
稳
定
性
平
均
值

叶片 茎 果实 5 d 10 d 30 d 50 d 70 d
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
A B
H
M
G
R
相
对
表
达
量

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中，5～50 d HMGR 的相对表达量较稳定，70 d 明
显升高。70 d HMGR 的相对表达量较高，可能是由
于果实发育后期受物质动员过程影响，HMGR 参与
的代谢过程活跃或者 UBQ5 降解更严重的原因。
3 讨论
罗汉果是药用植物，富含次生代谢物和糖
类，分离高质量的 RNA 较困难[10]。为减少杂质
对 PCR 体系的影响，需要降低 RNA 的溶解浓度，
同时也降低了基因的起始浓度，稀释的倍数不能
太大，否则最小浓度无法检出。罗汉果的果肉很
少，随着果实成熟，果肉的糖化程度升高，分离
RNA 也更困难。70 d 是能分离可用 RNA 的最后
时期，80 d 和 90 d（成熟期）的 RNA 不能用于
实验分析。
筛选内参基因是基因差异表达分析的基础工
作。通常分析多个看家基因的稳定性，再选择稳定
性最好的作为内参基因。以内参基因表达量作为分
母，HMGR 与之比较，用比值的变化趋势来表示目
标基因的表达量变化规律。内参基因的使用具有局
限性，不同的实验条件和处理背景都会影响内参基
因的稳定性及表达量分析的结果[11]。本研究中的
GAPDH 在叶片、茎和果实中表达稳定性不高，但
是在果实的不同发育时期，表达稳定性和所选用的
内参基因一样高。可见，适宜的内参基因需要根据
具体情况选择。
许多研究指出 HMGR 是组成性表达基因。本研
究中，叶片、茎和果实（5 d）HMGR 相对表达量具
有一定的差异，可能与罗汉果的叶片、茎和果实（5
d）代谢产物萜、固醇和苷等物质量不同有关。有报
道指出，罗汉果不同部位成分存在着显著差异，瓜
瓤中标志物是苷 V、苷 III、苷 IIE 和苷 IE，叶片中
是芦丁、槲皮苷-3, 7-O-二吡喃鼠李糖苷和罗汉果黄
素，茎中是槲皮苷-3, 7-O-二吡喃鼠李糖苷、罗汉果
黄素和山柰酚-3-O-吡喃鼠李糖苷[12]。罗汉果不同发
育时期（15～40 d，40～80 d），苷 V 量增加时，苷
IIE 逐渐减少，苷 V 在 40 d 是达到高峰，之后减少
直至果实成熟[13]。50～70 d 的果实中，HMGR 相对
表达量明显升高，这个阶段苷 V 也在迅速积累[6]。
可见，HMGR 的活性变化和苷 V 积累变化方向是一
致的。可以尝试通过提高 HMGR 活性，达到提高苷
V 产量的目的。
参考文献
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